一种数字pcr芯片
阅读说明：本技术 一种数字pcr芯片 (digital PCR chip ) 是由 任鲁风 李洁昆 蔡亦梅 高静 范东雨 于 2018-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种数字PCR芯片,其包括基座、旋转上盖、微阵列反应仓、密封层、密封圈、弹力卡扣、转轴一、转轴二、扭簧。其中微阵列反应仓表面均布400~1亿个微孔,用于独立分隔和承载反应试剂体系；旋转上盖与基座绕转轴一相互转动,实现样品填充；旋转上盖上置有密封层和密封圈,用于隔离和密封微阵列反应仓,避免交叉污染和蒸发；弹力卡扣与基座绕转轴二相互转动,通过转轴二内置的扭簧实现压紧和密封。本发明的数字PCR芯片无需外接驱动装置、节省试剂、操作简单。(the invention provides a digital PCR chip, which comprises a base, a rotary upper cover, a microarray reaction bin, a sealing layer, a sealing ring, an elastic buckle, a first rotating shaft, a second rotating shaft and a torsion spring. Wherein 400-1 hundred million micropores are uniformly distributed on the surface of the microarray reaction bin and are used for independently separating and bearing a reaction reagent system; the rotary upper cover and the base rotate around the first rotating shaft to realize sample filling; the rotary upper cover is provided with a sealing layer and a sealing ring for isolating and sealing the microarray reaction bin to avoid cross contamination and evaporation; the elastic buckle and the base rotate around the second rotating shaft, and the compression and the sealing are realized through a torsion spring arranged in the second rotating shaft. The digital PCR chip of the invention does not need an external driving device, saves reagents and has simple operation.)
技术领域
本发明涉及数字PCR技术领域，特别是数字PCR芯片。
背景技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种可将DNA片段体外扩增的分子生物技术，数字PCR(dPCR)是一种核酸分子绝对定量的新技术，它不依赖标准曲线和参照样本，无需设对照，可直接检测出目标分子的拷贝数。dPCR原理类似于计算机科学中的“分治算法”，将低模板的试剂分配到大量微孔中，经过统计学分析，大部分微孔中没有或者只有1个目标分子，扩增完成后，通过光学检测模块计数，即为初始模板量。相比于传统的定量PCR，dPCR具有更高的灵敏度、特异性、高耐受性和精确性，此项技术已经在极微量核酸样本检测、CNV分析和复杂样本基因表达检测等方面有着广泛应用。
数字PCR可以有两种检测方法。
其一为乳滴法检测模板量，将含有核酸分子的反应体系形成上万个微滴，微滴体积约为1nL左右，遵循统计学规律，每个微滴最多含有1个核酸分子（个别差异除外），把每个微滴作为一个PCR反应容器，经过循环扩增后，使用微滴分析仪，逐个检验每个微滴是否扩增，对扩增的微滴进行计数，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，计算出模板的拷贝数。这种方法，生成微滴时误差较大，影响检测结果，且成本高。
其二为使用微流控芯片检测，微流控原理为通过外界施加压力将试剂挤入芯片孔道内，但驱动结构复杂、占用空间较大、成本高，流体通道阻力大，很容易有气体残留，这种方式一般需要试剂留有大量余量才能注满芯片，对试剂造成极大的浪费。
材料需要综合考虑导热性、耐热性、生物相容性、透光性，可选用硅和玻璃，这两种材料导热性和透光性都非常好，可以使用传统的微加工技术，如湿法刻蚀、干法刻蚀、深度反应离子刻蚀、光学刻蚀等，也可选择塑料和聚合物，相比于硅和玻璃更容易加工制造，可选择传统的微机械加工和快速成型法，如注塑。
本发明是一种无需外接驱动装置、避免微孔间交叉污染、避免液体蒸发、减少试剂用量、成本低的数字PCR芯片。
发明内容
本发明提供了一种数字PCR芯片。
在一些实施例中，数字PCR芯片结构主要包括：基座、旋转上盖、微阵列反应仓、密封层、密封圈、弹力卡扣、转轴一、转轴二、扭簧，其中基座与旋转上盖之间由转轴一连接，可使两者相互转动；转轴二通过扭簧与基座和弹力卡扣之间相连，可使弹力卡扣与基座之间相互转动。
在一些实施例中，基座上置有微阵列反应仓。
在一些实施例中，微阵列反应仓表面分布400~1亿个微孔，其制作材料包括树脂、塑料、玻璃、石英、硅片、金属和陶瓷，优选硅片，其有益效果是，导热性能好、生物相容性好、适用多种加工方法；
在一些实施例中，微孔容积为0.5pL~1μL，优选4pL~1nl，根据统计学分析，可视为每个微孔内的DNA数量≤1。
在一些实施例中，微阵列反应仓分隔为1~100个分区，用于1~100个样品同时进行数字PCR反应。
在一些实施例中，微孔形状为圆形、方形、三角形、六边形、多边形，排布为横纵或密排。
在一些实施例中，微阵列反应仓四周有一凹槽，其有益效果是存放多余的反应试剂。
在一些实施例中，微阵列反应仓的加工方法包括光刻蚀、玻璃陶瓷金属刻蚀、高精度模具注塑、机加工切削、3D打印、沉积和粘合等，优选光刻蚀。
在一些实施例中，微阵列反应仓具有功能化修饰基团或进行表面亲水处理，其有益效果是，使试剂顺利进入微孔内，避免产生气泡。
在一些实施例中，旋转上盖上置有密封层，密封层为低熔点固态直链烷烃。其中低熔点固态直链烷烃常温状态下为固体，其熔点为30℃~70℃，融化后其密度小于反应试剂，不与试剂互溶，不与试剂发生反应，其材料可以是石蜡、固体油脂。
在一些实施例中，密封层或微阵列反应仓外侧有密封圈，其有益效果是，将融化后的固态直链烷烃密封在微阵列反应仓上方。
在一些实施例中，扭簧两端分别固定在旋转上盖和基座上，其有益效果是，自由状态下弹力卡扣压在基座上。
本发明的优势在于，与传统微流控芯片相比，无需外接驱动装置、节省试剂、避免交叉污染、避免液体蒸发、操作简单。
附图说明
图1表示本发明实施例的整体结构示意图。
图2表示本发明实施例的微阵列反应仓结构示意图。
图3表示本发明实施例的加样过程说明图。
图4表示本发明实施例的加样完成示意图。
具体实施方式
以下将实施例和附图相结合，具体说明本发明的技术方案。
本实施例数字PCR芯片为一次性耗材。结构包括基座（11）、旋转上盖（12）、微阵列反应仓（15）、密封层（14）、密封圈（17）、弹力卡扣（18）、转轴一（13）、转轴二（16）、扭簧（19）。其中基座（11）与旋转上盖（12）之间由转轴一（13）连接，可使两者相互转动；转轴二（16）通过扭簧（19）与基座（11）和弹力卡扣（18）之间相连，可使弹力卡扣（18）与基座（11）之间相互转动。
本实施例中，旋转轴一（13）内置滑动轴承，其有益效果是，提高旋转上盖与基座的转动精度。
本实施例中，基座（11）上置有微阵列反应仓（15），其中微阵列反应仓材料为硅片，外形尺寸为25mm×25mm，其中心20mm×20mm表面通过光刻蚀法均匀分布30625个微孔（151），微孔直径0.1mm，深度0.05mm，容积约为0.4nL。微孔四周有一圈0.2mm宽的凹槽（152），用于存放多余的反应试剂，避免试剂溢出。
本实施例中，使用BSA溶液对微阵列反应仓进行亲水处理，可使试剂顺利进入微孔，避免产生气泡。
旋转上盖（12）上置有密封层（14）,密封层为低熔点固态直链烷烃。其中低熔点固态直链烷烃常温状态下为固体，其熔点为30℃~70℃，融化后其密度小于反应试剂，不与试剂互溶，不与试剂发生反应，其材料可以是石蜡、固体油脂，本实施例中低熔点固态烷烃选择石蜡（Sigma，货号327204），其熔点为53℃~57℃。
本实施例中，密封层（14）外侧有密封圈（17），密封圈为硅胶材质。
本实施例中，使用3个扭簧（19），每个扭簧两端分别固定在旋转上盖（12）和基座（11）上。
本实施例的加样过程为：将数字PCR芯片（10）水平放置，将试剂（31）滴在微阵列反应仓上，用手旋转旋转上盖（12），使旋转上盖（12）与基座（11）的夹角α逐渐变小，当密封层（14）与试剂（31）接触后，夹角α变小的同时旋转上盖（12）驱使液体进入微孔（151）中；当夹角α接近0度时，密封层（14）可覆盖在微孔区域的上方，手动按起弹力卡扣（18），使弹力卡扣（18）压紧旋转上盖（12），通过扭簧（19）的弹力，挤压密封圈，使其变形后，实现密封。当使用该数字PCR芯片进行PCR扩增时，随着温度升高至53℃，石蜡融化后位于微阵列反应仓上层与密封圈之间，起到密封作用，避免了交叉污染和试剂蒸发。