具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本发明实施例提供一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂，总体思路如下：

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的制备方法，如图7所示，所述方法包括：

步骤S1、将锌盐加入多元醇溶剂中混匀，获得锌盐多元醇溶液；

所述步骤S1中：

所述锌盐包括无机锌盐和有机锌盐中的至少一种；其中，所述无机锌盐包括氯化锌、硫酸锌、硝酸锌、甲酸锌和乙酸锌中的至少一种。在其他实施方式中可选其他锌盐，本发明实施例优选乙酸锌；

所述多元醇溶剂包括含有多羟基的醇类及其寡聚物和聚合物中的至少一种，所述含有多羟基的醇类包括乙二醇、丙二醇、二甘醇、甘油和聚乙二醇中的至少一种。在其他实施方式中可选其他含有多羟基的醇类，本发明实施例优选二甘醇；

所述锌盐和所述多元醇溶剂的质量体积比为(1：20～200)g/L。优选1：50；该质量体积比有利于氧化锌的成核和组装形成团簇；多元醇溶剂添加过多不利于生成氧化锌核，多元醇溶剂添加过少不利于形成尺寸均一的团簇；

步骤S2、将所述锌盐多元醇溶液进行第一加热，后加入去离子水，进行第二加热至溶液出现浑浊，去除热源待自然冷却，获得反应产物；其中，所述去离子水与所述锌盐多元醇溶液的体积比为1：15～100；

上述技术方案中，所述去离子水与所述锌盐多元醇溶液的体积比为1：15～100目的在于使得锌盐水解速度适中获得团簇适中(直径为150～300nm)的荔枝状纳米氧化锌团簇；纳米颗粒主要通过内吞和渗入的方式进入细胞.大量的实验和理论分析表明,纳米颗粒的尺寸200nm左右、团簇状形貌、增大表面结构、等直接影响其与细胞的交互作用，提高抗原呈递效率。

所述去离子水与所述锌盐多元醇溶液的体积比若小于1:100锌盐水解速度慢，团簇尺寸变大；若大于1:15锌盐水解速度快，成核数量多，团簇尺寸小；所述去离子水与锌盐多元醇溶液的比例优选为1:50。

作为一种优选的实施方式，所述第一加热、第二加热和所述去除热源待自然冷却中，全程进行磁力搅拌，所述磁力搅拌的转速为200～1000rpm。

作为一种可选的实施方式，所述第一加热包括：于120～180℃下预加热5～15min。(最优时间10min)，加热过程中通过磁力搅拌使溶液受热均匀，磁力搅拌速度为200～1000rpm；所述第一加热起到预热的作用，预热温度若小于120℃锌盐水解较慢，若大于180℃多元醇会发生氧化变色；预热时间若小于5min溶液不能均匀受热，若大于15min会加速多元醇氧化变色；

作为一种可选的实施方式，所述第二加热包括：于120～180℃下预加热5～15min。在该条件下有利于荔枝状纳米氧化锌团簇成功合成。

作为一种具体的实施方式，在200～1000rpm(最优搅拌速度500rpm)持续磁力搅拌下，按照水：多元醇溶剂的体积比1:25、1:50、1:75、1:100(最优配比为1:50)向上述预热好的溶液中快速加入去离子水以引发锌盐的水解，继续加热5～15min(最优时间10min)溶液出现浑浊，证明此时荔枝状纳米氧化锌团簇成功合成；

步骤S3、将所述反应产物进行固液分离，获得氧化锌纳米团簇沉淀，后清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇。

所述步骤S3具体包括：

将所述反应产物用等体积有机溶剂稀释，后于6000～12000rpm离心5～10min收集氧化锌纳米团簇沉淀，采用有机溶剂清洗，获得荔枝状纳米氧化锌团簇。

所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、二甲基甲酰胺中的一种，所述有机溶剂优选乙醇；

所述清洗步骤具体包括：加入适量有机溶剂并在超声协助下分散沉淀，然后通过6000～12000rpm离心5～10min收集氧化锌团簇；优选重复上述步骤1～3次得到纯化的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂。

根据本发明另一种典型的实施方式，提供了用所述方法制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂。所述荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂由许多直径5nm左右(范围可以列为4～6nm)的纳米氧化锌球组装而成的荔枝状氧化锌团簇，其直径为150～300nm，表面凸凹不平，可见氧化锌纳米球；

单个氧化锌团簇由许多更小的纳米颗粒组成，表面凹凸不平、比表面积大，有效提高抗原的吸附能力；更重要的是该纳米团簇与病毒、细菌的颗粒非常相似，可增加免疫细胞的识别和吞噬，提高抗原递呈效率；纳米颗粒主要通过内吞和渗入的方式进入细胞.大量的实验和理论分析表明,纳米颗粒的尺寸200nm左右、团簇状形貌、增大表面结构、等直接影响其与细胞的交互作用，提高抗原呈递效率。我们的材料基本符合这些描述。

根据本发明另一种典型的实施方式，提供了所述的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂作为疫苗佐剂的应用。

本发明实施例将荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂溶液稀释为浓度为1mg/mL的半成品备用；后将所述荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂溶液和已灭活的猪伪狂犬病病毒液(C1201株)(灭活前抗原含量为10^8.5TCID₅₀/ml)按照灭活抗原体积比1:1吸附制备成疫苗待用。荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂辅佐的猪伪狂犬病灭活疫苗(C1201株)疫苗具有接种量小，无良反应，效率高的特点，有望在细菌、病毒、亚单位疫苗等多类疫苗制备方面得到广泛应用。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法与作为疫苗佐剂的应用进行详细说明。

实施例1、荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法

1、将1.1g乙酸锌加入到装有50mL二甘醇的圆底烧瓶中，在300rpm的转速下磁力搅拌30min使乙酸锌充分溶解备用；

2、将装有上述溶液的圆底烧瓶放入180℃的硅油中预加热10min，加热过程中通过磁力搅拌使溶液受热均匀，磁力搅拌速度为500rpm；

3、在500rpm持续磁力搅拌下，按照水：二甘醇的体积比1:50向上述预热好的溶液中快速加入去离子水以引发锌盐的水解，继续加热10min溶液出现浑浊，证明此时荔枝状纳米氧化锌团簇成功合成；

4、移去热源，继续磁力搅拌直至溶液冷却至室温。产物用等体积乙醇稀释，10000rpm离心5min收集氧化锌纳米团簇沉淀，加入适量乙醇并在超声协助下分散沉淀，然后通过10000rpm离心5min收集氧化锌团簇，重复上述步骤3次得到纯化的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂。

5、本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的SEM图如图1所述，由图1可知，本发明的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂由许多直径5nm左右的纳米氧化锌球组装而成的荔枝状氧化锌团簇，其直径为150～300nm，表面凸凹不平，可见氧化锌纳米球。

本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的X射线晶体衍射(XRD)图如图2所示，可知荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂为六方纤锌矿氧化锌晶体；

本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的水合粒径分布图如图3所示，表明荔枝状纳米氧化锌团簇的粒径分布在100～400nm，主要分布在200nm～300nm；

本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的的Zeta电位如图4所示，表明颗粒表面带有正电荷。

实施例2、荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法

1、将1.1g乙酸锌加入到装有22mL二甘醇的圆底烧瓶中，在200rpm的转速下磁力搅拌30min使乙酸锌充分溶解备用；

2、将装有上述溶液的圆底烧瓶放入120℃的硅油中预加热15min，加热过程中通过磁力搅拌使溶液受热均匀，磁力搅拌速度为500rpm；

3、在500rpm持续磁力搅拌下，按照水：二甘醇的体积比1:15向上述预热好的溶液中快速加入去离子水以引发锌盐的水解，继续加热10min溶液出现浑浊，证明此时荔枝状纳米氧化锌团簇成功合成；

4、移去热源，继续磁力搅拌直至溶液冷却至室温。产物用等体积乙醇稀释，10000rpm离心5min收集氧化锌纳米团簇沉淀，加入适量乙醇并在超声协助下分散沉淀，然后通过10000rpm离心5min收集氧化锌团簇，重复上述步骤3次得到纯化的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂。本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的SEM和XRD图基本同实施例1。

实施例3、荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂及其制备方法

1、将1.1g乙酸锌加入到装有220mL二甘醇的圆底烧瓶中，在1000rpm的转速下磁力搅拌30min使乙酸锌充分溶解备用；

2、将装有上述溶液的圆底烧瓶放入160℃的硅油中预加热12min，加热过程中通过磁力搅拌使溶液受热均匀，磁力搅拌速度为500rpm；

3、在500rpm持续磁力搅拌下，按照水：二甘醇的体积比1:100向上述预热好的溶液中快速加入去离子水以引发锌盐的水解，继续加热10min溶液出现浑浊，证明此时荔枝状纳米氧化锌团簇成功合成；

4、移去热源，继续磁力搅拌直至溶液冷却至室温。产物用等体积乙醇稀释，10000rpm离心5min收集氧化锌纳米团簇沉淀，加入适量乙醇并在超声协助下分散沉淀，然后通过10000rpm离心5min收集氧化锌团簇，重复上述步骤3次得到纯化的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂。本发明实施例制备得到的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂的SEM和XRD图基本同实施例1。

实施例4、猪伪狂犬病灭活疫苗(C1201株)灭活疫苗的制备

1、将实施例1制备好的荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂用生理盐水稀释配置成1mg/mL，置于4℃冰箱备用；

2、将灭活后的猪伪狂犬病病毒液(C1201株)(灭活前抗原含量为10^8.5TCID₅₀/ml)按照体积比1：1比例与荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂充分混合，即得实验佐剂疫苗。(分别以制备的三批纳米氧化锌团簇佐剂配制三批实验佐剂疫苗，记为实验佐剂疫苗1、实验佐剂疫苗2和实验佐剂疫苗3。

实施例5、实验佐剂疫苗对小鼠的安全性试验

每批疫苗腹腔注射小鼠20只，0.5ml/只，并设未接种对照小鼠5只。接种后连续观察14日，每日观察记录小鼠的精神、食欲及死亡情况等。对小鼠的安全性试验结果显示：试验鼠精神及食欲正常，均健活；注射部位观察疫苗吸收良好、无红肿、无结节；白油佐剂对照疫苗组小鼠注射部位疫苗为完全吸收(表1)。

表1-疫苗对小鼠接种的临床观察结果

由表1的数据可知，本发明的佐剂制备疫苗对昆明小鼠安全性良好。

实施例6、实验佐剂疫苗对兔的安全性试验

每批疫苗腿部肌肉注射兔5只，5.0ml/只，同时设空白对照兔5只相同条件下饲养，连续观察14日，每日观察记录兔注射部位有无肿包、精神状态、食欲及死亡情况等。

表2-疫苗对兔接种后的临床观察结果

试验结果显示：经过连续观察14日，试验兔精神及食欲正常；注射部位观察疫苗吸收良好、无红肿、无结节；白油佐剂对照疫苗注射部位疫苗未完全吸收(表2)。空白对照组均健活，无异常临床反应。表明实验佐剂制备疫苗对兔安全性良好，免疫无残留。

实施例7、实验佐剂疫苗对仔猪的安全性试验

将25头仔猪随机分为5组，每组5头，每种佐剂疫苗接种仔猪5头，颈部肌肉注射4ml/头，另一组为空白对照。免疫后每日测量体温，并观察猪的精神状态、食欲，记录仔猪的不良反应。14日后剖检观察注射部位局部炎症反应及各脏器病变状况。根据不同佐剂疫苗对仔猪免疫后的体温、临床表现、局部炎症反应及脏器病理变化等安全性指标的影响程度，评价纳米氧化锌团簇作为佐剂制备疫苗的安全性。仔猪体温结果见表3，临床观察结果见表4。

表3-试验佐剂配制疫苗免疫仔猪后的体温记录

表4-试验佐剂配制疫苗免疫仔猪后的临床观察结果

*注：“临床表现无异常”指仔猪精神、食欲及体温正常。

试验结果显示：疫苗接种仔猪后连续观察14日，仔猪体温、精神及食欲均正常，试验猪均未出现不良反应及死亡情况；试验结束后解剖试验猪，心、肺、肝、脾、肾、脑、扁桃体及淋巴结等脏器均无病变。白油佐剂疫苗眼观有未完全吸收疫苗。结果表明，试验佐剂疫苗安全性良好，优于白油佐剂疫苗。

实施例8、实验佐剂疫苗对小鼠的有效性

将3批实验佐剂疫苗和白油佐剂对照疫苗分别接种17～22g昆明小鼠20只，每只腹腔免疫0.3ml。同时设置攻毒对照组5只、空白对照组5只。于免疫后21日用伪狂犬病毒PRVHP-17株强毒株进行攻毒，每只腹腔注射伪狂犬病毒PRV HP-11株病毒液0.1ml(含200LD₅₀)。连续观察10日，记录每组小鼠健活数。3批实验佐剂疫苗组16～19只小鼠健活；白油佐剂疫苗组12/20健活；攻毒对照5/5死亡；空白对照5/5健活。结果见表5，荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂辅助的猪伪狂犬病灭活疫苗能显著提高免疫小鼠的攻毒保护率。

表5-对小鼠免疫攻毒试验结果

实施例9、免疫小鼠产生中和抗体检测

按表6中分组(荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂，商业白油佐剂对照，商业铝胶佐剂对照，和空白对照)各免疫小鼠20只，各腹腔注射疫苗0.3ml，14日后，再次各腹腔注射疫苗0.3ml。初次免疫后4，8，16，24，28周采集小鼠尾静脉血，分离血清，将待检血清倍比稀释后，分别加入等量的含有100TCID₅₀的伪狂犬病毒液，置37℃下作用60分钟，接种96孔ST细胞培养板，根据各孔CPE情况统计数据，计算被检血清中和抗体效价。(表6)所获得的实验数据以SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，P﹤0.05具有统计学意义(图6)。

表6 免疫小鼠产生中和抗体

通过表6数据分析可以看出，从第四周开始，各个实验组都能产生中和抗体，并普遍在十二周以后达到峰值。其中荔枝状纳米氧化锌团簇佐剂实验组取得了最佳免疫效果，中和抗体水平都显著高于其他对照实验组P﹤0.05，并同时在整个检测期间都维持较高的水平。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。