具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于示例性地对本发明进行说明，并不用于限制本发明。

实施例1：

1、顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺的制备

按照文献(中国新技术新产品.2014,8,13)中报道的方法制备得到顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺，经HPLC测得其有关物质含量为2.7％。其中，HPLC(高效液相色谱)测试条件为：使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(用10％氢氧化钠溶液调pH至7.5)-乙腈(80:20)为流动相，检测波长为243nm，测的结果纯度为97.3％。

2、顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺的纯化

(i)称取上述步骤1制备的顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺100.0g，加入400mL乙醇和400mL水的混合溶剂，加热至溶剂回流，搅拌1h后，降温至50±5℃搅拌1h，再降温至35±5℃搅拌1h，自然冷至室温放置2～3h，过滤，收集滤饼，45±5℃减压干燥3～4h，即得顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺98.5g，收率98.5％。HPLC测得纯度大于99.5％，检测条件同上述步骤1，其中，杂质1(顺-外-二环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酰亚胺)含量为0.18％，杂质2(顺-内-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺)含量为0.12％，杂质3(顺-内-二环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酰亚胺)含量为0.009％。

(ii)按照上述(i)的方法制备顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺，投料量均为100g，具体条件和有关物质检测结果参见表1。

表1、精制方法和结果

注：表中溶剂比例均为体积比；“--”表示未检出。

3、枸橼酸坦度螺酮组合物的制备

将1-(2-嘧啶基)哌嗪164g，1,4-二溴丁烷227g，碳酸钾345g，苄基三乙基氯化铵20g，甲苯2L加入到反应器中，搅拌回流反应3-4小时，加入165g上述步骤2(i)中纯化的顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺，搅拌回流4-5小时，反应液冷却至室温后加入到水中，搅拌，静置，分液，有机层加入盐酸溶液酸化，至pH≤3.5，分出水层，加入乙酸乙酯洗涤，分出水层加入适量活性炭，充分搅拌，过滤，滤液用氢氧化钠溶液调pH值至9以上，过滤，干燥得到游离碱，加入枸橼酸210g和乙醇2L的混合溶液，搅拌回流0.5-1小时，冷至室温，过滤，向滤饼中加入5-10倍量的乙醇，搅拌回流0.5-1小时，冷至室温，过滤，干燥得到产物530g，收率92％。

将所得产物进行HPLC检测，测试条件为：使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(用10％氢氧化钠溶液调pH至7.5)-乙腈(60:40)为流动相，检测波长为243nm。测得枸橼酸坦度螺酮组合物中，枸橼酸坦度螺酮的含量为98.5％以上；化合物Ⅰ的枸橼酸盐含量为0.07％，化合物Ⅱ的枸橼酸盐的含量为0.002％，化合物Ⅲ的枸橼酸盐的含量为0.001％。

实施例2

以表1中1-5条件项下制备得到的顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺为原料，按照上述方法制备枸橼酸坦度螺酮组合物，经HPLC检测，枸橼酸坦度螺酮的含量均在98.0％以上，有关物质含量见表2。

表2、检测结果

注：“--”表示未检出。

由上述内容可知，实施例1、2的中间体顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺的纯化工序使用了环保、安全、低毒/无毒的试剂，并且具有高产率、高纯度的优点；此外，坦度螺酮组合物的制备采用两步一锅的工艺，无需分离反应生成的中间产物，大大提高了工业生产效率，缩短了生产周期，并且由本发明方法制备得到的产物中有关物质含量低。

实施例3：

1、顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺的制备同实施例1的步骤1。

2、顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺的纯化

(i)称取上述步骤1制备的顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺100.0g，加入400mL乙醇和400mL水的混合溶剂，加热至溶剂回流，搅拌1h，自然冷却至室温，于-10±5℃放置2～3h，抽滤，向滤饼中加入200mL乙醇和200mL水的混合溶剂，加热至溶剂回流，搅拌1h，自然冷却至室温，于5±5℃放置2～3h，过滤，将滤饼干燥，即得顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺99.5g，收率99.5％。HPLC测得纯度大于99.5％，检测条件同实施例1的步骤1，其中，杂质1(顺-外-二环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酰亚胺)的含量为0.13％，未检出杂质2和杂质3。

(ii)按照上述方法制备顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺，投料量均为100g，具体条件和有关物质检测结果参见表3。根据检测结果显示，本发明方法所得产品的杂质1、杂质2、杂质3总含量不高于0.2％。

表3、精制方法和结果

注：表中混合溶剂比例均为体积比；“--”表示未检出。

3、枸橼酸坦度螺酮组合物的制备

将1-(2-嘧啶基)哌嗪164g，1,4-二溴丁烷227g，碳酸钾410g，苄基三乙基氯化铵22g，甲苯2.5L加入到反应器中，搅拌回流反应3-4小时，加入165g上述步骤2(i)中纯化的顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺，搅拌回流4-5小时，反应液冷却至室温后加入到水中，搅拌，静置，分液，有机层加入盐酸溶液酸化至pH≤3.5，分出水层，加入二氯甲烷洗涤，分出水层加入适量活性炭，充分搅拌，过滤，滤液用氢氧化钠溶液调pH值至9以上，过滤，干燥得到游离碱，加入枸橼酸210g和乙醇2.5L的混合溶液，搅拌回流0.5-1小时，冷至室温，过滤，向滤饼中加入5-10倍量的乙醇，搅拌回流0.5-1小时，冷至室温，过滤，干燥得到产物541g，收率94％。

将所得产物进行HPLC检测，测试条件与实施例1的步骤3相同，测得枸橼酸坦度螺酮组合物中，枸橼酸坦度螺酮的含量为98.5％以上；化合物Ⅰ的枸橼酸盐的含量为0.05％，未检出化合物II枸橼酸盐和化合物III枸橼酸盐。

实施例4

以表3中各条件项下制备得到的顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺为原料，按照上述方法制备枸橼酸坦度螺酮组合物，经HPLC检测，枸橼酸坦度螺酮的含量均在98.5％以上，其中编号3-5的组合物中，枸橼酸坦度螺酮的含量均在99.0％以上。有关物质含量见表4。

表4、检测结果

注：“--”表示为检出。

由上述内容可知，实施例3、4中间体顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺的纯化工序中使用了环保、安全、低毒/无毒的试剂，并且具有高产率、高纯度的优点；此外，坦度螺酮组合物的制备采用两步一锅的工艺，无需分离反应生成的中间产物，大大提高了工业生产效率，缩短了生产周期，由本发明方法制备得到的产品中有关物质含量低。

对比例1

1、顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺的制备同实施例1的步骤1。

2、枸橼酸坦度螺酮组合物的制备

将上述步骤1制备的顺-外-二环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺作为原料，投料量为165g，按照实施例1步骤3的方法制备得到枸橼酸坦度螺酮组合物485g。HPLC检测条件同实施例1步骤3，测得化合物Ⅰ的枸橼酸盐的含量为0.62％，化合物Ⅱ的枸橼酸盐的含量为0.46％，化合物Ⅲ的枸橼酸盐的含量为0.25％。

由实施例1-4与对比例1的结果可知，通过本发明方法可以有效提高枸橼酸坦度螺酮的含量，控制有关物质在较低的限量范围内。

实施例5：本发明药物组合物

将实施例3制备得到的枸橼酸坦度螺酮组合物与淀粉通过等量递增法混匀后，再与微晶纤维素混匀，制粒，装胶囊即得胶囊剂。

实施例6：本发明药物组合物

将原辅料分别过100目筛。将待制备量的实施例4表4编号1组的枸橼酸坦度螺酮组合物与低取代羟丙甲基纤维素通过等量递增法混匀，再依次加入甘露醇、乳糖淀粉，最后加入甜橙香精和硬脂酸镁，混合均匀后压片，即得舌下片剂。

实施例7：本发明药物组合物

将待制备量的实施例4表4编号2组的枸橼酸坦度螺酮组合物、羟丙基甲基纤维素和乳糖混合均匀，过筛，加入75％乙醇溶液制软材，过20目筛制湿颗粒，于50℃左右烘干，20目筛整粒，加入硬脂酸镁和滑石粉，混合均匀后压片，即得缓释片剂。

实施例8：本发明药物组合物

将待制备量的实施例4表4编号3组的枸橼酸坦度螺酮组合物、微晶纤维素、乳糖和羧甲基淀粉钠在制粒机中混匀后，加入乙醇制软材，真空干燥后，过筛整理，装袋即得颗粒剂。

实施例9：本发明药物组合物

将待制备量的实施例4表4编号4组的枸橼酸坦度螺酮组合物、微晶纤维素、乳糖和羧甲基淀粉钠在制粒机中混匀后，加入乙醇制软材，真空干燥后，过筛整理，再加入硬脂酸镁混合均匀后压片，即得片剂。

以下通过药效学试验和临床试验进一步说明本发明的有益效果：

下述各组按照实施例5所述方法制得药物组合物胶囊剂，各组的枸橼酸坦度螺酮组合物按照下述方法制得：原始质量组由对比例1制得，质量提高组1由实施例2表2中的第2组制得，质量提高组2由实施例2表2中的第3组制得，质量提高组3由实施例4表4中的第6组制得，质量提高组4由实施例4表4中的第5组制得。

试验1：临床药效试验

使用本发明药物组合物进行多中心的随机、双盲、安慰剂平行对照研究的临床试验，病人总数为120人，随机分为3组，年龄从24到65岁，入组标准为轻度至中度的焦虑患者并符合伴有消化系统疾病、胃黏膜损伤或易出血、年龄50岁以上其中至少一个条件。在研究期间病人被禁止使用其它镇静剂、抗炎药、肌松剂、降压药、抗精神病药、抗抑郁药或抗焦虑药。各组分别服用安慰剂、原始质量组(含0.62％化合物Ⅰ的枸橼酸盐，0.46％化合物Ⅱ的枸橼酸盐，0.25％化合物Ⅲ的枸橼酸盐)、质量提高组3(含0.05％化合物Ⅰ的枸橼酸盐)。服药30天后，进行疗效(抗焦虑疗效根据汉密尔顿焦虑量表进行评价分析)和不良反应评价。其中，安慰剂组的有效率为10％，不良反应发生率为5％；原始质量组的有效率为65％，不良反应发生率为35％；质量提高组3的有效率为75％，不良反应发生率为15％。

临床观察结果表明，原始质量组和质量提高组均具有明显的疗效，而质量提高组的药物不良反应发生率明显低于原始质量组，说明质量提高组不但具有抗焦虑效果，其不良反应也有明显降低。

试验2：肝毒性试验

长期使用枸橼酸坦度螺酮组合物的严重不良反应包括对肝脏的损伤，下面通过小鼠的长期给药实验来考察不同质量组的枸橼酸坦度螺酮组合物对肝脏的损伤情况。

将120只体重18～22g的雄性ICR小鼠随机分成6组，每组20只，各给药组按表5所示的药物和剂量连续灌胃给药28天，空白组用生理盐水灌胃，1次/天，取血前禁食12h，在第29天由眼球后静脉丛取血两份，分别测定血清中转氨酶AST和ALT浓度。

试验数据用平均值±标准差表示，用SPSS软件进行数据分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05和P<0.01为具有显著性差异。

表5、长期给药对肝功能的影响

与空白对照组比较：^#P<0.05，##P<0.01；与原始质量组比较：*P<0.05，**P<0.01。

试验结果表明，采用常规剂量每天单独给药，原始质量组和空白组相比，小鼠血清中AST和ALT浓度显著升高(##P<0.01)；而采用质量提高后的枸橼酸坦度螺酮组合物每天给药，与原始质量组相比，小鼠血清中AST和ALT浓度升高情况均显著降低，尤其是质量提高组2、3、4(**P<0.01)；而且AST和ALT的浓度随着质量提高组中化合物Ⅰ的枸橼酸盐、化合物Ⅱ的枸橼酸盐和化合物Ⅲ的枸橼酸盐含量的降低而降低，表明使用质量提高后的枸橼酸坦度螺酮组合物显著降低了其对肝脏的毒性，药物安全性更高。

试验3：抗抑郁动物模型实验

(1)小鼠悬尾实验(抗抑郁实验)

将84只小鼠随机分成7组，每组12只，按表6中的药物分组灌胃给药一次。各组小鼠给药后1h，将小鼠的尾尖1cm处黏贴倒置悬挂，用胶布固定在挂钩上使其呈倒悬状态，头部距离实验台约15cm，每次操作一只，使用动物行为视频分析系统记录6min内小鼠的绝望行为，分析后4min内的累计不动时间(s)。判断不动的标准为小鼠停止挣扎，呈倒悬状态，静止不动。

试验数据用平均值±标准差(x±SD)表示，用SPSS软件进行数据分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05和P<0.01为具有显著性差异。

表6、小鼠悬尾实验结果

与空白对照组比较：^#P<0.05,^##P<0.01；与原始质量组比较：*P<0.05,**P<0.01。

实验结果表明，与空白对照组相比，阳性药组小鼠的累计不动时间明显减少(^##P<0.01)；原始质量组与质量提高组1、2、3、4的小鼠累计不动时间都小于空白对照组，说明原始质量组与质量提高组均有一定的抗抑郁作用；与原始质量组相比，质量提高组2、3、4小鼠的累计不动时间明显减少(**P<0.01)，表明质量提高组抗抑郁效果比原始质量组好；由质量提高组3和4结果可知，小鼠累计不动时间随着化合物Ⅰ的枸橼酸盐含量的增加而减少，均小于质量提高组1和2，表明在本申请范围内，枸橼酸坦度螺酮组合物的抗抑郁效果随化合物Ⅰ的枸橼酸盐含量的增加而变好。

(2)小鼠强迫游泳实验(抗抑郁实验)

将84只小鼠随机分成7组，每组12只，按下表中药物分组灌胃给药一次。各组小鼠给药后1h，将小鼠分别放入高20cm，直径10cm的有机玻璃缸中，有机玻璃缸中盛入25±1℃的水，高度15cm，每次操作一只，并且使用动物行为视频分析系统记录6min内小鼠的游泳行为，分析后4min内小鼠强迫游泳的累计不动时间(s)。不动时间判断为动物在水中停止挣扎，呈漂浮状态，只有细小的肢体运动以保持头部浮在水面上。

试验数据用平均值±标准差表示，用SPSS软件进行数据分析。组间比较使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05和P<0.01为具有显著性差异。

表7、小鼠强迫游泳实验结果

与空白对照组比较：^#P<0.05,^##P<0.01；与原始质量组比较：*P<0.05,**P<0.01。

实验结果表明，与空白对照组相比，阳性药组小鼠的累计不动时间明显减少(^##P<0.01)；原始质量组与质量提高组1、2、3、4的小鼠累计不动时间都小于空白对照组，说明原始质量组与质量提高组均有一定的抗抑郁作用；与原始质量组相比，质量提高组2、3、4小鼠的累计不动时间明显减少(**P<0.01)；由质量提高组3和4结果可知，小鼠累计不动时间随着化合物Ⅰ的枸橼酸盐含量的降低而增加，且小于质量提高组1，表明在本申请范围内，枸橼酸坦度螺酮组合物的抗抑郁效果随化合物Ⅰ的枸橼酸盐含量的增加而变好。

上述研究结果表明，通过各指标成分的控制，在本发明限定的范围内，可以有效提高枸橼酸坦度螺酮的药效，降低毒副作用。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。