芝麻育性分子标记、引物、试剂盒、应用、高木酚素芝麻新品种选育方法
阅读说明：本技术 芝麻育性分子标记、引物、试剂盒、应用、高木酚素芝麻新品种选育方法 (Sesame fertility molecular marker, primer, kit, application and breeding method of new high-lignan sesame variety ) 是由 梅鸿献 郑永战 刘艳阳 崔承齐 杜振伟 武轲 江晓琳 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域,具体涉及芝麻育性分子标记、分子标记引物、应用、高木酚素芝麻新品种选育方法。本发明提供的分子标记的不同基因型对应芝麻的确定育性,通过针对不同基因型设计特异性扩增引物,通过判断扩增片段的有无即可对芝麻的育性进行准确判断；本发明提供的选育方法,采用轮回选育的方式,在基础群体构建过程的中回交过程结合分子标记进行芝麻育性的辅助选择,与传统的在回交并自交的群体后代中再选择不育株进行回交或者直接连续回交的方法相比,能减少一半以上的时间或工作量,并且构建的基础群体使不育系亲本遗传成分在群体中的比例降至2%以下,提高了群体的遗传多样性。(The invention relates to the technical field of molecular biology and genetic breeding, in particular to a sesame fertility molecular marker, a molecular marker primer, application and a method for breeding a new high-lignan sesame variety. The different genotypes of the molecular marker provided by the invention correspond to the determined fertility of sesame, and the fertility of sesame can be accurately judged by designing specific amplification primers aiming at the different genotypes and judging whether amplified fragments exist or not; the breeding method provided by the invention adopts a recurrent breeding mode, the backcross process is combined with the molecular marker to carry out the auxiliary selection of sesame fertility in the construction process of the basic population, compared with the traditional method of selecting sterile plants again from the progeny of the backcrossed and selfed population to carry out the backcross or direct continuous backcross, the time or workload can be reduced by more than half, and the constructed basic population reduces the proportion of the genetic components of the sterile line parents in the population to below 2%, thereby improving the genetic diversity of the population.)
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及芝麻育性分子标记、分析标记引物、试剂盒、应用、高木酚素芝麻新品种选育方法。
背景技术
芝麻是我国重要的特色优质油料作物，与其它油料相比，芝麻种子中脂肪含量55%，其中油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸高达85%，但却能长时间存放而不发生酸败，具有较高的稳定性，主要因为芝麻中含有一类特异的天然抗氧化物质—木酚素类（lignans），此类活性成分因带有酚羟基而具有较强的抗氧化作用（胡华丽等，华北农学报，2014,29:190-194）。研究表明，木酚素不仅能防止油脂氧化酸败，而且在人体内也有很高的生理活性，它能消除体内自由基，具有降血脂、降血压、抗血栓形成、缓解动脉粥样硬化、增加肝脏解毒活性、增强机体免疫力、抑制乳腺癌等作用（Namiki et al. Crit Rev Food Sci, 2007, 47:651-673）。芝麻木酚素作为天然抗氧化剂，既可以用作食品添加剂，又可用于保健药品的开发，培育高木酚素含量芝麻品种具有广阔的市场前景。
芝麻种子中木酚素组分主要为芝麻素和芝麻林素，总含量0.3%-0.5%，但在不同品种资源中变异较大。木酚素生物合成是一个比较复杂的过程，芝麻木酚素含量也是典型的复杂数量性状，受多基因控制，并易受环境影响。现有高木酚素芝麻品种选育技术方案为：利用少数高木酚素含量亲本与当地优良品种通过人工配制杂交或者回交组合，而后通过系谱法进行后代选择。长期利用少数亲本进行杂交，导致育成品种遗传基础日渐狭窄，难以育成突破性品种。轮回选择育种方法则利用多个亲本构建基础群体，通过连续多轮的遗传重组和后代选择，能打破不利基因的连锁，增加优良基因的积累，因而是拓宽品种遗传基础，育成突破性品种的重要手段。但是，轮回选择重组过程需要群体内进行自由授粉，传统方法涉及大量人工去雄和自由授粉工作，使轮回选择在像芝麻一样的自花授粉作物上的应用受到限制。上世纪80年代，隐性雄性核不育基因的发现为在芝麻中应用轮回选择育种方法提供了可能，国内外育种专家利用轮回选择法对芝麻产量相关性状进行了遗传改良。
但是，现有的以隐性雄性核不育性状为媒介，进行芝麻轮回选择的方法中仍存在两个主要问题，限制了其在芝麻木酚素含量改良中的应用，主要体现在基础群体构建时采用同一个隐性雄性核不育材料作母本，分别与不同优异材料配制组合，不育基因供体亲本遗传成分占群体总体的50%，容易导致基础群体遗传多样性降低，后代遗传类型和性状表现单一，难以育成综合性状优良的品种，需要寻找新的方法，降低不育基因供体遗传成分占群体总体的比例，用于芝麻木酚素含量的轮回选择，以便快速有效地培育集高木酚素含量、高产、抗逆、广适性于一体的芝麻新品种。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供芝麻育性分子标记，能够对芝麻纯合不育性状、纯合可育性状、杂合可育性状进行准确筛选。
本发明的目的之二在于提供一种用于扩增芝麻育性分子标记的引物，用于特异性扩增分子标记，基于扩增产物的状态判断分子标记的基因型，进而对芝麻育性进行准确筛选。
本发明的目的之三在于提供一种包括本发明提供的引物的试剂盒，用于检测本发明所述分子标记，对芝麻育性进行判断。
本发明的目的之四在于提供一种本发明提供的引物在芝麻育性选择方面的应用。
本发明的目的之五在于提供一种高木酚素芝麻新品种选育方法，以本发明分子标记在基础群体构建过程中对芝麻育性进行选育，降低不育基因供体遗传成分占群体总体的比例，丰富基础群体的遗传成分，快速有效地培育集高木酚素含量、高产、抗逆、广适性于一体的芝麻新品种。
一种芝麻育性分子标记，所述分子标记由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成。
其中SEQ ID NO：1为芝麻雄性可育基因型；SEQ ID NO：2为芝麻雄性核不育基因型。
一种用于扩增芝麻育性分子标记的引物，由第一引物对和第二引物对组成；其中第一引物对上游引物为：F1:5'- AATGACGATGCCTAAGGCCC-3'，如SEQ ID NO：3所示；第二引物对的上游引物为：F2：5'- AATGACGATGCAGAGGCATA-3'，如SEQ ID NO：4所示；第一引物对和第二引物对的下游引物均为R：5'- GCATTAGCCTCTCCACAAATGG -3'，如SEQ ID NO：5所示。
一种用于检测上述分子标记的试剂盒，包括上述引物。
上述分子标记在芝麻育性选择上的应用，采用上述第一引物对和第二引物对扩增芝麻育种后代材料DNA；若只获得第一引物对扩增片段，可预测该材料为纯合可育株；若只获得第二引物对扩增片段，可预测该材料为纯合不育株；若同时获得第一引物对和第二引物对扩增片段，可预测该材料为杂合可育株。
需要说明的是，可以采用上述第一引物对和第二引物对分别扩增芝麻育种后代材料DNA，若只获得第一引物对扩增片段，可预测该材料为纯合可育株；若只获得第二引物对扩增片段，可预测该材料为纯合不育株；若同时获得第一引物对和第二引物对扩增片段，可预测该材料为杂合可育株；
也可以在第二引物对的上游引物的5’端随机增加至少5bp序列，采用第一引物对和第二引物对同时扩增芝麻育种后代材料DNA，由于第一引物对和第二引物对上游引物长度不同导致不同引物的特异性扩增产物的片段大小存在差异，从而可以通过扩增产物的片段大小区分不同引物的扩增片段，若只获得第一引物对扩增片段，可预测该材料为纯合可育株；若只获得第二引物对扩增片段，可预测该材料为纯合不育株；若同时获得第一引物对和第二引物对扩增片段，可预测该材料为杂合可育株。作为进一步优选的，第二引物对上游引物的序列为F2：5'-TAATTAATGACGATGCAGAGGCATA-3'，如SEQ ID NO：6所示。
一种高木酚素芝麻新品种选育方法，包括如下步骤：
1）构建基础群体：
（1）确定父本和母本：
父本：筛选符合目标形状要求，综合形状优良的种质资源30~50份，作为父本；
母本：以隐性核不育材料不育株为母本；
（2）母本与父本分别配置杂交组合，并回交获得BC1；
（3）利用上述第一引物对和第二引物对分别对BC1群体中的各单株材料DNA进行PCR扩增；对于只获得第一引物对扩增片段的材料判定为纯合可育株；对于只获得第二引物对扩增片段的材料判定为纯合不育株；同时获得第一引物对和第二引物对扩增片段的材料判定为杂合可育株；
（4）按照步骤（3）所述方法选择BC1群体中的杂合可育株作为母本，相应的父本作为轮回亲本，分别连续回交6代至BC6，并自交获得BC6F2种子；
（5）将步骤（4）获得的各亲本BC6F2种子等量混合后，在隔离条件下种植，开花期标记植株花粉育性，混合收获不育单株上种子，构成基础群体C0。
2）木酚素含量轮回选育：
在隔离条件下种植基础群体C0，开花期标记植株花粉育性；成熟收获时，根据目测，选择农艺性状优良的可育单株，单株收获芝麻籽粒；
测定各单株收获的芝麻籽粒中的芝麻素和芝麻林素含量；
按照总木酚素含量高低排列，筛选高木酚素含量且综合形状优良的植株籽粒，等量混合构成第一轮群体C1；
在隔离条件下种植C1，开花期标记植株花粉育性，混合收获不育单株上种子，完成群体重组；
重复步骤和步骤，即可完成新一轮的重组和选择，最终培育出高木酚素含量且综合形状优良的新品种。
可选的，步骤（1）中的母本为ms86-1。
可选的，步骤中，基础群体C0的种植规模为10000-20000株，选择的农艺形状优良的可育单株为1000-2000株。
可选的，步骤国内首先按照总木酚素含量高低排列，筛选前500株，然后再筛选综合形状优良的100株，等量混合构成第一轮群体C1。
可选的，步骤中C1的种植规模为5000~10000株；步骤（5）中种植规模为5000~10000株。
可选的，步骤中芝麻籽粒的芝麻素和芝麻林素含量采用红外光谱仪检测。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的芝麻育性分子标记的不同基因型对应芝麻育性，通过针对不同基因型设计特异性扩增引物，通过判断扩增片段的有无即可对芝麻的育性进行准确判断；
2、本发明提供的高木酚素含量芝麻新品种的选育方法，采用轮回选育的方式，在基础群体构建过程中，首先确定以隐性雄性核不育材料不育株为母本，与选定的父本杂交并回交后获得BC1，以本发明筛选的分子标记，采用本发明提供的扩增分子标记的引物，对BC1群体的雄性不育性状进行筛选，以杂合不育株作为母本与相对应的父本进行回交，连续回交6代后再自交收获单株籽粒等量混合获得基础群体。可以使不育系亲本遗传成分在群体中的比例降至2%以下，提高了群体的遗传多样性；通过轮回选择进行芝麻木酚素含量的遗传改良，可聚合多个有利等位基因，育成综合性状优良的高木酚素品种，并可随时在群体中添加优异材料，拓展品种的遗传基础。
并且回交过程结合分子标记进行芝麻不育性状的辅助选择，与传统的在回交并自交的群体后代中再选择不育株进行回交或者直接连续回交的方法相比，能减少一半以上的时间或工作量；在海南或温室加代条件下，2年内即可完成连续6代回交和基础群体的构建。
3、作为优选的，本发明利用近红外光谱对群体后代进行木酚素含量无破损测定的方法，显著降低了检测成本，实现了对大规模样本品质的快速高效测定。
附图说明
图1为芝麻雄性不育基因BSA分析结果；
图2为ms基因精细定位图；
图4为实施例1确定的分子标记引物在实施例2验证实验的群体后代中扩增出的带型；
图3为采用实施例1确定的分子标记引物在实施例3木酚素含量芝麻新品种的选育过程中亲本及群体后代中扩增出的带型。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例提供芝麻育性分子标记及特异性扩增分子标记的引物的开发，具体步骤包括：
（1）以芝麻隐性雄性核不育系ms86-1不育株（msms）为母本，以豫芝11号（MsMs）为父本，构建了一个包括398个单株的F2群体；
（2）分别选择不育及可育株单株各50个，将DNA等量混合，构建利用BSA（bulkedsegregant analysis）混合基因池；
（3）利用SLAF-seq（specific-locus amplified fragment sequencing）技术进行简化基因组测序，即用HaeIII和Hpy166II 两种酶组合，对样品DNA进行酶切，对酶切的片段加A处理后，利用Dual-index的测序接头进行连接，通过PCR的扩增后切胶，并选取将酶切长度264~364 bp片段，构建测序文库。利用Illumina HiSeq 2500平台进行双端（PE）测序。利用BWA软件将读序列（reads）比对到中芝13号参考基因组，利用GATK和SAMtools软件进行SNP和InDel检测；
（4）采用MutMap方法进行BSA分析，如图1所示，即分别统计可育池和不育池各SLAF标记基因型频率，分别计算两混池之间的SNP-index，并通过△SNP-index 发现可能和性状分离的相关位点，为了消除假阳性的位点，利用标记在基因组上的位置，将具有多态性SLAF标签得到的△SNP-index值，完成loess回归拟合出现关联阈值，不育和可育株混池拟合后的△(SNP-index)的关联阈值，经loess回归拟合为0.62。在参照基因组的16条连锁群上，只有LG1上的△(SNP-index)值大于阈值，说明此区域与雄性不育基因相关联；
（5）分子标记的确定：为了进一步缩小目标基因区间，对两亲本进行了重测序，即提取ms86-1及豫芝11号基因组DNA，利用超声波将DNA随机打断，连接测序接头，构建测序文库；利用Illumina Hiseq 2500测序平台进行双端（PE）测序。利用BWA软件将高质量reads比对到中芝13号参考基因组，利用GATK和SAMtools软件进行SNP及InDel变异检测。在目标基因组区段，开发SNP及InDel标记共20对，筛选出亲本中具有多态性的引物8对，其中， SNP和InDel分别为2对和6对。利用8对多态性标记对398株“ms86-1×豫芝11号”衍生的F2群体进行了基因型分析，通过连锁分析，将ms基因定位到Marker629090和Marker509788标记之间（如图2），通过目标区段基因注释，确定芝麻XM_011095623基因（如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示）对芝麻育性有直接的关联性；
（6）扩增引物的确定：对两亲本基因XM_011095623基因的DNA和CDNA序列进行分析，该基因包含两个外显子和一个内含子，cDNA全长1581bp，编码526个氨基酸。序列比对分析显示两亲本存在两个非同义突变，一个发生在第一个内含子，碱基G突变为A，导致N末端第26个氨基酸Val突变为Ile，另一个突变发生在第二个内含子，碱基CTAAGGCCC突变为AGAGGCATA，导致C末端第507-510氨基酸ProLysAlaGlu变异为GlnArgHisLys。对F2群体50个后代单株两个突变位点序列进行分析，N末端序列突变与芝麻育性有关。
为了能够通过一步扩增反应筛选芝麻育性，根据N末端突变序列设计不同长度的两对扩增引物，其中特异性针对可育基因型的上游引物F1:5'- AATGACGATGCCTAAGGCCC-3'，如SEQ ID NO：3所示; 特异性针对不育基因型的上游引物F2: 5'-TAATTAATGACGATGCAGAGGCATA-3'，如SEQ ID NO：6所示；可育基因型和不育基因型对应相同的下游引物R:5'- GCATTAGCCTCTCCACAAATGG -3'，如SEQ ID NO：5所示。在一步扩增反应中同时加入可育基因型特异性引物对和不育基因型特异性引物对，通过产物片段大小区分，若只获得可育基因型特异性引物的扩增片段，该植株为纯合可育；若只获得不育基因型特异性引物对的扩增片段，该植株为纯合不育；若同时获得两对引物的片段，该植株则为杂合可育。
需要说明书的是，可以调整特异性针对不育基因型的上游引物F2：5'-AATGACGATGCAGAGGCATA-3'，如SEQ ID NO：4所示，通过分别采用可育基因型引物对和不育基因型引物对分两次分别扩增待筛选材料，通过判断扩增产物的有无即可确定待筛选材料的育性。
实施例2
本实施例对实施例1确定的分子标记及其引物对芝麻育性筛选的准确性进行验证，具体验证过程如下：
（1）以隐性雄性核不育材料ms86-1不育株为母本，以63份种质资源为父本分别配制杂交组合，自交，获得63个F2群体；
（2）对每个群体选取5株可育株和5个不育株，提取叶片DNA，利用MarkerSims标记进行基因型分析，如图3所示，采用实施例1确定的分子标记及其引物对其中的5个群体筛选的10株材料进行育性标记，其中1-5为可育株；6-10为不育株，表明该标记100%区分可育株和不育株。
实施例3
本实施例提供高木酚素含量芝麻新品种的选育方法，具体步骤包括：
1. 基础群体构建
（1）从河南省农业科学院芝麻研究中心资源库中，筛选来自黄淮流域、综合性状优良的种质资源50份，用于轮回选择基础群体的构建（P1）；
（2）以隐性雄性核不育材料ms86-1不育株（msms）为母本，以50份种质资源为父本分别配制杂交组合，并回交获得BC1；
（3）在各回交群体中，提取单株DNA，分别利用实施例1开发的特异性的可育基因型引物对和不育基因型引物对，对单株材料DNA进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后观察扩增产物片段，如图4所示；若只获得可育基因型引物对的扩增片段（材料1,2,6，9,12,15,19），该植株为纯合可育；若只获得不育基因型引物对的扩增片段，该植株为纯合不育（材料4,11,16,23）；若同时获得两对引物的片段，该植株则为杂合可育（材料3,5,7,8,10,13,14,17,18）；
（4）以回交群体中杂合可育植株作母本，相应父本作轮回亲本，分别连续回交6代至BC6，并自交获得BC6F2种子；
（5）BC6F2种子等量混合后，在隔离条件下种植，规模5000-10000株，开花期标记植株花粉育性，混合收获不育单株上种子，构成基础群体P1C0。
2. 木酚素含量轮回选择
（1）在隔离条件下种植P1C0群体，规模10000-20000株，开花期标记植株花粉育性；成熟收获时，首先，根据目测，选择农艺性状优良的可育单株1000-2000株，单株收获；晾晒脱粒后，测定籽粒芝麻素和芝麻林素含量。
（2）芝麻素及芝麻林素测定采用近红外光谱法，具体为利用瑞典波通（Perten）公司的DA7200二极管阵列近红外光谱仪对试验材料种子进行光谱数据采集。进行光谱扫描前，将所有需采集光谱的样品在近红外光谱仪所在实验室放置24 h以上，使得样品环境条件与仪器的环境条件一致，以减少温度对样品的影响。仪器预热30 min后，实验前设置好仪器的工作参数，扫描谱区范围为950~1650 nm，采样间隔2 nm；利用800份资源建立的芝麻素和芝麻林素含量NIRS模型进行芝麻素和芝麻林素含量分析；
（3）按照总木酚素含量高低排列，选取前500株，等量混合构成第一轮群体P1C1，并筛选100株综合性状优良的单株进入系统选择程序；
（4）在隔离条件下种植P1C1，规模5000-10000株，开花期标记植株花粉育性，混合收获不育单株上种子，完成群体重组；
（5）重复步骤（3）和步骤（4），即可完成新一轮的重组和选择。
截至2020年，实施例2已完成5轮的轮回选择，P1C5群体单株平均总木酚素含量6.10 mg/g，与基础群体单株平均4.25 mg/g相比，提高了43.53%，平均每轮提高8.71%。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 河南省农业科学院芝麻研究中心
<120> 芝麻育性分子标记、引物、试剂盒、应用、高木酚素芝麻新品种选育方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 99
<212> DNA
<213> Natural sequence
<400> 1
aatgacgatg cctaaggccc aacccttaat tgccattcct aggcccagac tagcagccca 60
tttgtataat tagcggccca tttgtggaga ggctaatgc 99
<210> 2
<211> 99
<212> DNA
<213> Natural sequence
<400> 2
aatgacgatg cagaggcata aacccttaat tgccattcct aggcccagac taccagccca 60
tttgtataat tagcggccca tttgtggaga ggctaatgc 99
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aatgacgatg cctaaggccc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aatgacgatg cagaggcata 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcattagcct ctccacaaat gg 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
taattaatga cgatgcagag gcata 25