一种运用PCR引物检测Diaporthe novem的方法
阅读说明：本技术 一种运用PCR引物检测Diaporthe novem的方法 (Method for detecting Diaporthe novem by using PCR (polymerase chain reaction) primers ) 是由 张莹 胡佳续 王娓辰 刘鹏 张裕君 刘勇 王仲敏 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及使用PCR技术检测植物及植物产品中Diaporthe novem的方法,属于植物病原真菌检测领域。本发明设计合成了D.novem的特异性引物,用于对D.novem基因组DNA的特异检测。本发明建立了一种快速简便、特异性强、准确可靠的D.novem的分子检测方法,一个工作日内完成整个检测。(The present invention relates to the detection of plants and plant products using PCR technology Diaporthe novem Belonging to the field of plant pathogenic fungi detection. The invention designs and synthesizes D.novem Specific primers of (1), for the pair D.novem Specific detection of genomic DNA. The invention establishes a method which is rapid, simple, convenient, strong in specificity, accurate and reliable D.novem The molecular detection method of (1) completes the whole detection within one working day.)
技术领域
本发明涉及使用PCR技术检测植物及植物产品中Diaporthe novem J.M. Santos,Vrandečić & A.J.L. Phillips, sp. nov.的方法，属于植物病原真菌检测领域。
背景技术
Diaporthe novem属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），子囊菌纲（Ascomycetes），间座壳目（Diaporthales），间座壳科（Diaporthaceae），间座壳属（Diaporthe），其无性阶段为Phomopsissp.9。它与严重危害大豆的大豆北方茎溃疡病菌D. caulivora，大豆南方茎溃疡病菌D. aspalathi 和大豆拟茎点种腐病菌D. longicolla互为近似种，其中大豆北方茎溃疡病菌和大豆南方茎溃疡病菌被列入我国进境植物检疫性有害生物名录。
D. novem最早由Jorge Manuel Santos等人于2011年正式命名，现有资料显示该病菌在智利、克罗地亚、意大利、葡萄牙、南非和澳大利亚等地区有分布。危害大豆、向日葵、猕猴桃、葡萄、金橘和青柠等重要经济作物，引起种子和果实腐烂，造成严重经济损失，也在绣球花、南非红茶、茜草科拉拉藤属上有分离报道，我国尚未见报道。
大豆作为重要的粮油兼用作物、饲料原料，在国内有着巨大的需求，是我国最重要的进口农产品之一，2019年我国大豆进口总量达到8851万吨。我国口岸多次检出D. novem，由于该病菌不在检疫性名录内，其危害往往容易被忽视。该病菌引起大豆茎秆溃疡和种子腐烂，导致大豆产量和品质下降。由受害种子生产的豆油及大豆榨油后所得饲料、肥料及豆饼等其它产品质量低下，不适合作为饲料使用。此外，该病菌寄主广泛，一旦随进境大豆传入我国，将会对我国大豆及其它农作物生产、农业生态造成难以估量的损失。
鉴于D. novem传入我国的风险性及病菌危害的严重性，为保护我国农林业生产安全，维护国家利益，进一步规范这一重要病害的检疫，提高口岸疫情检测的准确性和验放速度，防止该病菌传入我国，建立一套快速、准确、完整的D. novem的检测方法迫在眉睫。
发明内容
本发明收集间座壳属8种真菌（见表1），建立了快速简便、特异性强、准确可靠的间座壳属真菌分子检测方法，能将D. novem准确鉴定出来。该方法检测快速，方法可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。
具体技术方案如下：
本发明目的是提供一种检测D. novem基因组DNA的PCR方法，它包括如下步骤：
（1）植物基因组DNA的提取；
（2）D. novem的特异引物，序列如下：
DnoF1：CTCACACTGGCTGGATTATG
DnoR1：AGCCGCTTATCTCCTATGC
该引物用于D. novem基因组DNA特异性检测，扩增片段约为329bp。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明建立了快速简便、特异性强、准确可靠的D. novem分子检测方法，能将D. novem与间座壳属其他种区别开来。该方法检测快速，方法可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。
下面结合附图与
具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1 D. novem基因组DNA特异引物的扩增
图中1～9泳道分别为D. novem, D. longicolla , D. caulivora, D. aspalathi, Diaporthe sp., D. eres , D.phaseolorum, D. vaccinii和阴性对照，M泳道为2000 bp DNA marker。
具体实施方式
实施例1：植物材料基因组DNA的提取
本实验D. novem菌株源于天津海关动植食中心植检实验室。共计8株，相关信息见表1。
表1 供试材料代码、拉丁名、中文名及收集年份
序号
拉丁名
中文名
收集年份
1
<i>Diaporthe novem</i>
-
2019
2
<i>Diaporthe longicolla</i>
大豆拟茎点种腐病菌
2019
3
<i>Diaporthe caulivora</i>
大豆北方茎溃疡病菌
2019
4
<i>Diaporthe aspalathi </i>
大豆南方茎溃疡病菌
2019
5
<i>Diaporthe</i>sp.
向日葵间座壳
2020
6
<i>Diaporthe eres</i>
樱间座壳
2020
7
<i>Diaporthephaseolorum</i>
菜豆间座壳
2020
8
<i>Diaporthe vaccinii</i>
蓝莓果腐病菌
2020
挑取皱缩、带有病斑的病豆，用1 %次氯酸钠表面消毒5 min，灭菌水冲洗3次，置25℃下保湿培养24 h，-20 ℃冰冻24 h，置PDA培养基上，22 ℃、12 h光照黑暗交替培养。5d后观察培养结果。可疑菌落用PDA进行分离纯化，取适量菌丝块，液氮充分研磨，用德国QIAGEN公司Dneasy plant mini kit植物基因提取试剂盒提取DNA，并将DNA溶于100 μL 1× TE缓冲液中，置于-20℃保存。
实施例2：特异引物的设计
人工合成D. novem的特异引物，引物序列如下：
DnoF1：CTCACACTGGCTGGATTATG
DnoR1：AGCCGCTTATCTCCTATGC
实施例3：D. novem特异引物的PCR扩增
1. 反应混合液的配制
反应体系配置见表2。
表2 D. novem特异性扩增体系
试剂
加样量/μl
2× Premix
12.5
ddH<sub>2</sub>O
10.0
DnoF1
0.5
DnoR1
0.5
模板
1.5
Total
25.0
2. PCR反应程序
预变性：94ºC，3min
变性： 94ºC，30s
退火： 60ºC，20s
延伸： 72ºC，20s
循环数：35个
延伸： 72ºC，6min
2.3 结果分析
对8个实验材料的基因组DNA进行特异性引物DnoF1 / DnoR1的扩增，以添加无菌水为模板作为阴性对照。扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳，EB染色均能观察到特定目的大小带，通用引物扩增的片段应约为329 bp，只有D. novem显示特定大小的目的带（见图中1泳道），D. longicolla , D. caulivora, D. aspalathi, Diaporthe sp., D. eres , D.phaseolorum, D. vaccinii 和阴性对照无相应产物（见图中2～9泳道，图中1～9泳道分别为D. novem, D. longicolla, D. caulivora, D. aspalathi, Diaporthe sp., D. eres, D.phaseolorum, D. vaccinii和阴性对照），M泳道为2000 bp DNA marker。
序列表
<110> 天津海关动植物与食品检测中心
<120> 一种运用PCR引物检测Diaporthe novem的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Diaporthe novem
<400> 1
ctcacactgg ctggattatg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Diaporthe novem
<400> 2
agccgcttat ctcctatgc 19
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