一种鉴定小麦优势变异染色体及其遗传效应的方法
阅读说明：本技术 一种鉴定小麦优势变异染色体及其遗传效应的方法 (Method for identifying wheat dominant variation chromosome and genetic effect thereof ) 是由 亓增军 吴楠 刘鑫 杨阳 王从磊 何梓铭 方佳欣 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鉴定小麦优势变异染色体及其遗传效应的方法,综合寡核苷酸探针荧光原位杂交、小麦芯片分析、混合分离群体表型比较和BSR-seq分析揭示小麦变异染色体遗传传递特点以及对基因组分化、基因表达和表型的效应,为发掘和利用小麦优势染色体变异及其关键基因(簇)进行小麦品种改良提供了新方案,属于作物遗传育种与农业生物技术领域。(The invention discloses a method for identifying a wheat dominant variant chromosome and a genetic effect thereof, which integrates oligonucleotide probe fluorescence in-situ hybridization, wheat chip analysis, mixed segregation population phenotype comparison and BSR-seq analysis to reveal genetic transmission characteristics of the wheat variant chromosome and the effects on genome differentiation, gene expression and phenotype, provides a new scheme for exploring and utilizing the wheat dominant chromosome variant and key genes (clusters) thereof to improve wheat varieties, and belongs to the technical field of crop genetic breeding and agricultural biology.)
一、
技术领域
本专利公开了一种鉴定小麦优势变异染色体及其遗传效应的方法，属于作物遗传育种与农业生物技术领域。
二、
背景技术
普通小麦为典型的异源六倍体物种，在经历多倍体化、驯化和改良过程中，为提高逆境胁迫中的适应性，其基因组发生了明显的变异(见参考文献：Badaeva E，Dedkova O，Gay G，Pukhalskyi V，Zelenin A，Bernard S，Bernard M.Chromosomal rearrangementsin wheat：their types and distribution[J].Genome，2007，50：907-926；Dvorak J，WangL，Zhu T，Jorgensen C，Luo M，Deal K，Gu Y，Gill B，Distelfeld A，Devos K，Qi P，McGuire P.Reassessment of the evolution of wheat chromosomes 4A，5A，and 7B[J].Theoretical and Applied Genetics，2018，131：2451-2462)。随着作物基因组学的的迅速发展，从分子水平上对小麦驯化和人工选择过程中基因组变异特点的解析取得了很大进展，鉴定出一批选择性标记位点和区段(见参考文献：Hao C，Wang Y，Chao S，Li T，Liu H，Wang L，Zhang X.The iSelect 9K SNP analysis revealed polyploidization inducedrevolutionary changes and intense human selection causing strong haplotypeblocks in wheat[J].Scientific Reports，2017，7：41247；Hao C，Jiao C，Hou J，Li T，Liu H，Wang Y，Zheng J，Liu H，Bi Z，Xu F，Zhao J，Ma L，Wang Y，Majeed U，Liu X，AppelsR，Maccaferri M，Tuberosa R，Lu H，Zhang X.Resequencing of 145 landmark cultivarsreveals asymmetric sub-genome selection and strong founder genotype effectson wheat breeding in China[J].Molecular Plant，2020，13：1-19)，为基于组学的基因组育种提供了重要参考，但是对于选择性标记及其区段的形成机制尚缺乏深入的了解，例如，染色体变异与小麦基因组演化的关系，染色体变异对农艺性状、逆境胁迫和基因表达调控的具体效应是什么尚鲜有直接报道，其中很大的原因在于，一是目前的组学技术尚难以对富含高度重复序列的异染色质区段进行测序和组装，因此大范围的染色体变异特别是相互易位、倒位以及隐性非整倍体等的鉴定尚依赖于细胞遗传分析，但是前期缺乏简单高效的染色体鉴定技术，使大规模分析小麦品种演化中的染色体变异也存在很大的困难；二是，尚缺乏一套将染色体变异与植物基因组演化以及遗传效应分析整合在一起系统研究的技术体系，因而造成目前的组学研究和细胞遗传研究在很多方面尚未相互结合起来。
染色体变异通过降低杂合体的育性或者通过抑制重组减少了基因流动，因而造成生殖隔离以及新物种的形成(见参考文献：Schubert I.Chromosome evolution[J].Current opinion in plant biology，2007，10：109-115；Murat F，Xu J，Tannier E，Abrouk M，Guilhot N，Pont C，Messing J，Salse J.Ancestral grass karyotypereconstruction unravels new mechanisms of genome shuffling as a source ofplant evolution[J].Genome research，2010，20：1545-1557)。染色体结构变异由于涉及大片段DNA序列重排因此对进化及人类疾病发生具有重要的影响，在动物、微生物和人类上研究较为深入(de Jonge R，Bolton M，Kombrink A，van den Berg G，Yadeta K，ThommaB.Extensive chromosomal reshuffling drives evolution of virulence in anasexual pathogen[J].Genome research，2013，23：1271-1282；Collins R，Brand H，Karczewski K，Zhao X，J，Francioli L，Khera A，Lowther C，Gauthier L，Wang H，Watts N，Solomonson M，O’Donnell A，Baumann A，Munshi R，Walker M，Whelan C，HuangY，Brookings T，Sharpe T，Stone M，Valkanas E，Fu J，Tiao G，Laricchia K，Ruano V，Stevens C，Gupta N，Cusick C，Margolin L，Genome Aggregation Database ProductionT，Genome Aggregation Database C，Taylor K，Lin H，Rich S，Post W，Chen Y，Rotter J，Nusbaum C，Philippakis A，Lander E，Gabriel S，Neale B，Kathiresan S，Daly M，BanksE，MacArthur D，Talkowski M.A structural variation reference for medical andpopulation genetics[J].Nature，2020，581：444-451)。但在植物中的研究较少，尤其对于基因组巨大的小麦等作物更缺少深入的研究。基因组学与细胞遗传学的结合，推动了染色体变异机制和效应的研究，特别是基于基因组测序开发的寡核苷酸探针，为清晰识别大范围的染色体结构变异提供了有力工具，大大推动了小麦染色体结构与功能的研究进展。通过这种方式，南京农业大学前期研究成功开发了8个寡核苷酸探针套，用于小麦(见参考文献：Du P，Zhuang L，Wang Y，Yuan L，Wang Q，Wang D，Dawadondup，Tan L，Shen J，Xu H，Zhao H，Chu C，Qi Z.Development of oligonucleotides and multiplex probes forquick and accurate identification of wheat and Thinopyrum bessarabicumchromosomes[J].Genome，2017，60：93-103)、大麦(见参考文献：Zhang S，Zhu M，Shang Y，Wang J，Dawadundup，Zhuang L，Zhang J，Chu C，Qi Z.Physical organization ofrepetitive sequences and chromosome diversity of barley revealed byfluorescence in situ hybridization(FISH)[J].Genome，2019，1：329-339)、玉米(见参考文献：Zhu M，Du P，Zhuang L，Chu C，Qi Z.A simple and efficient non-denaturingFISH method for maize chromosome differentiation using single-strandoligonucleotide probes[J].Genome，2017，60(8)：657-664)、黑麦(见参考文献：Wu N，LiM，Sun H，Cao Z，Liu P，Ding T，Xu H，Chu C，Zhuang L，Qi Z.RNA-seq facilitatesdevelopment of chromosome-specific markers and transfer of rye chromatin towheat[J].Molecular Breeding，2018，38：6)、百萨偃麦草(见参考文献：Chen J，Tang Y，Yao L，Wu H，Tu X，Zhuang L，Qi Z.Cytological and molecular characterization ofThinopyrum bessarabicum chromosomes and structural rearrangementsintrogressed in wheat[J].Molecular Breeding，2019，39：146)等物种的染色体鉴定，其中在小麦中开发的寡核苷酸探针套#4(ONPM#4)由于简单高效，在小麦及其亲缘物种染色体鉴定中得到大量利用，成为识别小麦染色体变异的重要工具(见参考文献：Huang X，Zhu M，Zhuang L，Zhang S，Wang J，Chen X，Wang D，Chen J，Bao Y，Guo J，Zhang J，Feng Y，ChuC，Du P，Qi Z，Wang H，Chen P.Structural chromosome rearrangements andpolymorphisms identified in Chinese wheat cultivars by high-resolutionmultiplex oligonucleotide FISH[J].Theoretical and Applied Genetics，2018，131：1967-1986；王丹蕊，杜培，裴自友，庄丽芳，亓增军.基于寡核苷酸探针套painting的小麦“中国春”非整倍体高清核型及应用[J].作物学报，2017，43：1575-1587)，从中国小麦育成品种和地方品种中鉴定出一大批结构变异和多态性染色体，其中部分变异染色体衍生自骨干亲本并在衍生品种中高频传递，同时鉴定出一批高频率出现的多态类型，可能代表我国小麦的优势变异类型，但是如何鉴定这些变异染色体的遗传效应尚缺乏有效的方法，因此难以确定和发掘小麦种质中蕴含的优势染色体变异，限制了在育种中的应用。
本专利针对上述问题，提出了一种利用寡核苷酸探针荧光原位杂交准确识别小麦变异染色体，并利用遗传群体构建基于不同变异染色体类型的混合分离群体，然后通过小麦芯片杂交、表型鉴定和混池转录组测序(Bulked Segregant RNA-seq，BSR-seq)分析，鉴定小麦优势变异染色体并揭示变异染色体在基因组分化、表型性状及基因表达调控上的效应，为发掘和利用小麦优势变异染色体及其关键基因(簇)进行小麦品种改良及进化研究提供了新的方案。
三、
发明内容
技术问题：
本发明的目的在于公开一种鉴定小麦优势变异染色体及其遗传效应的方法。
技术方案：
1.为明确小麦变异染色体的类型，对基于变异染色体分离群体的双亲A和B进行寡核苷酸探针套FISH分析，比较双亲间具有差异的多态染色体或结构变异类型，总结成对的变异染色体差异区段的信号分布特征。寡核苷酸探针利用探针套ONPM#4：包含6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，FAM，绿色)修饰的重复序列pSc119.2-1和(GAA)10以及6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxy tetramethylrhodamine，TAMRA，红色)修饰的重复序列pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、AFA-3和AFA-4。所有探针序列参考Du P，Zhuang L，Wang Y，YuanL，Wang Q，Wang D，Dawadondup，Tan L，Shen J，Xu H，Zhao H，Chu C，Qi Z.Development ofoligonucleotides and multiplex probes for quick and accurate identificationof wheat and Thinopyrum bessarabicum chromosomes[J].Genome，2017，60：93-103。
2.为揭示小麦变异染色体的遗传传递特点，首先构建涉及变异染色体的亲本A/亲本B的杂种F2，对F2单株进行基于ONMP#4的寡核苷酸探针套FISH分析，对变异染色体在杂种F2中的分布进行鉴定，分析各类变异类型纯合数目、杂合数目，对其进行卡方检验，进一步分析遗传传递特点。其次对同组合的重组自交系(Recombinant Inbred Lines，RIL)高代系群体中的家系进行染色体组成分析，明确不同家系涉及的变异染色体。根据染色体变异类型将鉴定的家系划分为不同的成对类群。
3.为探讨不同变异染色体类群间群体分化特点，对上述鉴定的亲本A/亲本B RIL高代系群体进行小麦育种芯片的基因型分析，按照小麦变异染色体类型划分的成对类群进行遗传分化指数分析(Fst)(见参考文献：Danecek P，Auton A，Abecasis G，Albers C，Banks E，DePristo M，Handsaker R，Lunter G，Marth G，Sherry S，McVean G，Durbin R，Genomes Project Analysis G.The variant call format and VCFtools[J].Bioinformatics，2011，27：2156-2158；Guo W，Xin M，Wang Z，Yao Y，Hu Z，Song W，Yu K，Chen Y，Wang X，Guan P，Appels R，Peng H，Ni Z，Sun Q.Origin and adaptation to highaltitude of Tibetan semi-wild wheat[J].Nature Communications，2020，11：5085)，发现成对类群间相应结构变异或多态性区段附近均存在差异SNP区间，明确差异区段的大小。对区间内的基因进行注释分析其涉及分子功能、细胞组分、生物学过程等方面的功能(见参考文献：Tian T，Liu Y，Yan H，You Q，Yi X，Du Z，Xu W，Su Z.agriGO v2.0：a GO analysistoolkit for the agricultural community，2017 update[J].Nucleic Acids Research，2017，45：122-129)。
4.为分析变异染色体对基因表达的效应，对亲本A/亲本B RIL高代群体基于染色体变异类型进行BSR-seq分析(见参考文献：Wang Y，Xie J，Zhang H，Guo B，Ning S，ChenY，Lu P，Wu Q，Li M，Zhang D，Guo G，Zhang Y，Liu D，Zou S，Tang J，Zhao H，Wang X，Li J，Yang W，Cao T，Yin G，Liu Z.Mapping stripe rust resistance gene YrZH22 inChinese wheat cultivar Zhoumai 22 by bulked segregant RNA-Seq(BSR-Seq)andcomparative genomics analyses[J].Theoretical and Applied Genetics，2017，130：2191-2201)，利用欧式距离算法和SNP-index法发现混池间存在SNP差异的染色体区域(见参考文献：Hill J，Demarest B，Bisgrove B，Gorsi B，Su Y-C，Yost H.MMAPPR：mutationmapping analysis pipeline for pooled RNA-seq[J].Genome research，2013，23：687-697；Ramirez R，Segovia V，Bird N，Fenwick P，Holdgate S，Berry S，Jack P，Caccamo M，Uauy C.RNA-Seq bulked segregant analysis enables the identification of high-resolution genetic markers for breeding in hexaploid wheat[J].PlantBiotechnology Journal，2014，13：613-624.)，确定差异染色体区域内的基因，筛选其中在亲本之间及混池之间同时差异表达显著的基因(EBSeq程序，阈值：FDR＜0.05，差异倍数大于2倍)，对其进行功能注释。
5.为揭示变异染色体对小麦表型的效应，利用亲本A/亲本B RIL高代系群体进行多年多点表型数据的调查，将家系的表型数据基于染色体变异类型划分为成对类群，利用IBM SPSS Statistics 22进行T-test分析，明确变异染色体对表型的影响。
有益效果：
1、本专利公开的基于ONMP#4荧光原位杂交可以清晰揭示小麦变异染色体，为富含高度串联重复序列的着丝粒、端粒以及其他异染色质区域测序及序列组装提供了重要参考；
2、本专利公开的利用小麦芯片技术揭示变异染色体类群间SNP差异区间的方法，能够从分子水平快速识别变异染色体的分化，与细胞学结果相结合辅助判断变异发生断点，鉴定差异区间内的功能基因及代谢通路，为重复序列变异引起的基因组分化与品种起源与演化研究及选择性基因区段发掘提供了便利；
3、本专利公开的基于小麦变异染色体混池转录组测序鉴定差异基因和表型的方法为发掘优势变异染色体及其关键区段涉及的有利基因(簇)提供了新方案，为小麦起源与演化研究、品种改良和骨干亲本培育提供了重要信息；
4、本专利公开的鉴定小麦优势变异染色体及其遗传效应的方法可以用于小麦自然群体以及其它植物，为发掘植物优势变异染色体和关键性状基因提供了重要借鉴。
四、
附图说明
图1：扬麦158(Y158)与翻山小麦(FSXM)核型及其变异染色体鉴定
蓝色信号为DAPI套染；绿色信号为FAM修饰的寡核苷酸探针pSc119.2-1和(GAA)10；红色信号为TAMRA修饰的寡核苷酸探针pAs1-1，pAs1-3，pAs1-4，pAs1-6，AFA-3和AFA-4。a：Y158；b：FSXM；c：Y158与FSXM核型的比较；红色框表示亲本间存在的多态染色体；箭头示多态染色体区段
图2：Y158/FSXM F2单株FISH，颜色同图1
图3：基于小麦15K芯片染色体多态类型perInv6B和6B-1的遗传分化指数分析
横坐标示标记在染色体上的位置，单位为bp，纵坐标示Fst值
图4：基于小麦15K芯片染色体多态类型5A-1和5A-4的遗传分化指数分析
横坐标示标记在染色体上的位置，单位为bp，纵坐标示Fst值
图5：6B差异区段内基因的GO注释
图6：5A差异区段内基因的GO注释
图7：perInv6B和6B类群间性状T-test分析
*表示差异显著，**表示差异极显著，NS表示差异不显著；a：南京；b：临汾
图8：4A-1和4A-3类群间性状T-test分析
*表示差异显著，**表示差异极显著，NS表示差异不显著；a：南京；b：临汾
图9：5A-1和5A-4类群间性状T-test分析
*表示差异显著，**表示差异极显著，NS表示差异不显著；a：南京；b：临汾
图10：4B-1和4B-2类群间性状T-test分析
*表示差异显著，**表示差异极显著，NS表示差异不显著；a：南京；b：临汾
五、
具体实施方式
1、扬麦158与翻山小麦中变异染色体的鉴定
利用Du et al.2017(见参考文献Du P，Zhuang L，Wang Y，Yuan L，Wang Q，WangD，Dawadondup，Tan L，Shen J，Xu H，Zhao H，Chu C，Qi Z.Development ofoligonucleotides and multiplex probes for quick and accurate identificationof wheat and Thinopyrum bessarabicum chromosomes[J].Genome，2017，60：93-103)开发的寡核苷酸探针套，由Huang et al.2018(见参考文献：Huang X，Zhu M，Zhuang L，ZhangS，Wang J，Chen X，Wang D，Chen J，Bao Y，Guo J，Zhang J，Feng Y，Chu C，Du P，Qi Z，WangH，Chen P.Structural chromosome rearrangements and polymorphisms identified inChinese wheat cultivars by high-resolution multiplex oligonucleotide FISH[J].Theoretical and Applied Genetics，2018，131：1967-1986)加以改进的ONMP#4对小麦品种扬麦158和翻山小麦进行染色体组成分析。据Huang et al.(2018)中多态染色体的命名，Y158-4A、Y158-5A、Y158-4B、Y158-6B、Y158-7B分别对应4A-3、5A-4、4B-2、perInv6B、7B-1；FSXM-4A、FSXM-5A、FSXM-4B、FSXM-6B、FSXM-7B分别对应4A-1、5A-1、4B-1、6B-1、7B-7。两亲本间共发现五对染色体具有差异，涉及1种染色体结构变异和5对多态性染色体，分别为：4A-3 vs 4A-1、5A-4 vs 5A-1、4B-2 vs 4B-1、perInv6B vs 6B-1、7B-1 vs 7B-7(图1)。4A-1长臂端部比4A-3多绿色信号；5A-4比5A-1长臂中部多了一对弱绿信号，5A-1的红色信号明显强于5A-4；4B-1与4B-2差别在于短臂近端部绿点的有无，4B-1没有，4B-2有；6B的差异在于有无perInv6B；7B-1长臂端部有明显的强于7B-7的绿色信号。
2、变异染色体的遗传传递
为了解4A、5A、4B、6B、7B多态染色体在Y158/FSXM杂种F2中的分布，对288株F2进行鉴定(图2)，发现共有145种核型，其中Y158类型纯合数目、杂合类型数目、FSXM类型纯合数目如表1所示。经卡方检验，Y158-4A纯合类型、杂合类型和FSXM-4A纯合类型比例与1∶2∶1的理论分离比值差异显著(df＝2，χ2＞5.99，P＜0.05)；Y158-perInv6B纯合类型、双亲混合类型和FSXM-6B纯合类型比例与1∶2∶1的理论分离比值差异极显著(df＝2，χ2＞9.21，P＜0.01)；其余多态染色体与理论分离比值均无显著差异(df＝2，χ2＜5.99，P＞0.05)，表明传递正常。
对Y158/FSXM RIL-F8的62个家系进行鉴定表明：只有染色体perInv6B和6B-1的分布偏分离(df＝1，χ2＞3.84，P＜0.05)(表1)，其它染色体分离正常。
对RIL F8中的杂合perInv6B单株自交后代的124粒种子进行鉴定，perInv6B纯合类型、杂合类型和6B-1纯合类型为31∶67∶26，符合1∶2∶1。
表1多态染色体在扬158/翻山小麦F2和F8中的分布
3、变异染色体对群体分化的效应
对上述鉴定的Y158/FSXM RIL-F8进行小麦15K芯片的基因型分析，按照小麦变异染色体类型划分的五对类群进行遗传分化指数分析(Fst)，发现perInv6B vs 6B-1(图3)和5A-4 vs 5A-1(图4)两对类群间相应倒位或多态性区段附近均存在差异SNP区间，差异区段分别
表2多态染色体差异区段信息
为367.05Mb、51.97Mb(表2)，其它变异染色体类群间差异位点较少或需要进一步利用更高密度的标记进行确证。基因注释显示perInv6B vs 6B-1差异区间的基因显著富集于10种功能，主要涉及细胞发育、细胞表面受体信号转导途径等(图5)；5A-4 vs 5A-1差异区间的基因显著富集于分子功能，如β-葡糖苷酶活性、酰基甘油O-酰基转移酶活性等(图6)。
4、变异染色体对基因表达的影响
对Y158/FSXM RIL-F10基于染色体变异类型进行BSR-seq分析，发现在perInv6B和6B-1混池间在6B染色体的五个区域存在SNP差异，共包含801个基因，其中21个基因表达在亲本间及混池间同时差异表达显著，涉及α-淀粉酶、丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶、过氧化物酶等(表3)。
表3混池间差异显著6B区域内差异基因的基因注释
5、变异染色体对表型的影响
利用Y158/FSXM RIL-F10两点三重复的数据分析五对变异类群间的差异，发现不同变异染色体的效应在不同的环境中表现存在差异，其中perInv6B在南京具有降低株高，在南京郑州两地具有降低有效小穗数和穗粒数的效应(图7)，4A-3在郑州具有降低株高、减少分蘖、缩短穗长、减少穗粒数的效应(图8)，5A-4在郑州具有降低株高、缩短穗长的效应(图9)，4B-2在郑州具有降低株高、增加穗粒数、在南京具有缩短穗长的效应(图10)，说明变异染色体存在明显的表型效应，但受多种因素的影响，在两地表现不完全一致，还需要进一步重复确证。
上述实施方式仅为了说明专利公开的体系而采用的示例性实施方式，然而本专利发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。