一种基于四面体dna纳米探针的电化学分析方法及应用
阅读说明：本技术 一种基于四面体dna纳米探针的电化学分析方法及应用 (Electrochemical analysis method based on tetrahedral DNA (deoxyribonucleic acid) nanoprobe and application ) 是由 郑峻松 陈曦 朱全敬 李艳 黄辉 汪莉娜 朱垂雨 方立超 邓均 刘华敏 李承红 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于DNA甲基化分析技术领域,公开了一种基于四面体DNA纳米探针的电化学分析方法及应用,包括：四面体探针结构序列、不同的DNA甲基化靶序列、信号放大序列及比对序列。在四面体探针固定时间3h、靶序列杂交时间1h、HpaII内切酶酶切时间2h的条件下体现出最优性能,于1amol/L至1pmol/L的范围内表现出较好的检测能力,检出限达到0.93amol/L,灵敏度高。本发明的电化学生物传感技术在DNA甲基化检测方面具有独特的优点：能在较短时间内完成对甲基化DNA靶序列的特异性分析,操作方便、价格低廉、灵敏度高、特异性好、稳定性强,能有效地用于血清等复杂体系中的DNA甲基化检测。(The invention belongs to the technical field of DNA methylation analysis, and discloses an electrochemical analysis method based on a tetrahedral DNA nanoprobe and application thereof, wherein the electrochemical analysis method comprises the following steps: a tetrahedral probe structure sequence, different DNA methylation target sequences, a signal amplification sequence and an alignment sequence. The method has the advantages that the optimal performance is realized under the conditions that the tetrahedral probe fixing time is 3h, the target sequence hybridization time is 1h and the digestion time of the HpaII endonuclease is 2h, the good detection capability is realized in the range of 1amol/L to 1pmol/L, the detection limit reaches 0.93amol/L, and the sensitivity is high. The electrochemical biosensing technology of the invention has unique advantages in the aspect of DNA methylation detection: can complete the specificity analysis of the methylated DNA target sequence in a short time, has convenient operation, low price, high sensitivity, good specificity and strong stability, and can be effectively used for DNA methylation detection in complex systems such as serum and the like.)
技术领域
本发明属于DNA甲基化生物传感分析技术领域，尤其涉及一种基于四面体DNA纳米探针的电化学分析方法及应用。
背景技术
目前：DNA甲基化在基因转录过程中发挥重要作用，一旦发生异常，可导致阿尔兹海默症、心脑血管疾病以及恶性肿瘤的发生、发展。目前已有多种DNA甲基化分析方法，如甲基化特异性聚合酶链反应、荧光定量、甲基化特异性高分辨率溶解曲线、焦磷酸测序等基于重亚硫酸盐转化的方法，利用甲基化限制性内切酶、甲基结合域蛋白、抗5-甲基胞嘧啶抗体、锌指蛋白等基于甲基化特异性识别分子的分析方法，还有高效液相色谱、高效毛细管电泳、质谱分析、表面增强拉曼光谱等方法。总体来说，这些传统方法都能完成DNA甲基化的分析，但由于操作繁琐、稳定性差、特异性差、能导致DNA降解等原因，以及需要特定的大型设备、实验场地及专业数据分析技术人员，导致临床应用较为局限，难以满足开展临床标本DNA甲基化分析的条件。因此研制一种操作便捷、灵敏度高、特异性好的DNA甲基化检测方法具有较大的临床应用价值。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统DNA甲基化分析方法操作繁琐、稳定性差、特异性差，会导致待测DNA降解，需要特定的大型设备、实验场地及专业数据分析技术人员，临床应用较为局限。
解决以上问题及缺陷的难度和意义：随着医学的发展，DNA甲基化在疾病的发生、发展中的作用日益凸显，在疾病的“早发现、早诊断、早治疗”中发挥重要作用，传统分析方法难以满足当前的DNA甲基化临床检测需求。生物传感分析方法操作方便、成本低、灵敏度高、易于小型化、特别适合床旁检测，可在较短时间内提供准确的检测结果。本项目在于建立一种超灵敏的DNA甲基化电化学生物传感分析方法，为癌症及其他甲基化相关疾病的诊断提供准确、灵敏的检测手段，解决临床样本对于DNA甲基化超灵敏检测的技术需求。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于四面体DNA纳米探针的电化学分析方法及应用。
本发明是这样实现的，一种四面体DNA纳米探针，所述四面体DNA纳米探针包括：四面体探针结构序列、不同的DNA甲基化靶序列、信号放大序列及比对序列：
四面体巯基化结构序列为SEQ ID NO：1；四面体巯基化结构序列为SEQ ID NO：2；四面体巯基化结构序列为SEQ ID NO：3；四面体探针结构序列为SEQ ID NO：4；
非甲基化靶序列为SEQ ID NO：5；甲基化靶序列为SEQ ID NO：6；单碱基错配甲基化靶序列为SEQ ID NO：7；多碱基错配甲基化靶序列为SEQ ID NO：8；
杂交链反应序列1为SEQ ID NO：9；杂交链反应序列2为SEQ ID NO：10；普通信号探针放大法比对靶序列T1为SEQ ID NO：11；普通信号探针放大法信号探针序列为SEQ ID NO：12。
本发明的另一目的在于提供一种使用所述四面体DNA纳米探针的电化学分析方法，所述电化学分析方法包括：
第一步，从-20℃取出所有DNA序列冻干粉，加入对应体积TE缓冲液:使其溶解至100umol/L；
第二步，用TE缓冲液稀释S1-S4序列至50umol/L，分别吸取1uL加入同一支EP管中，加入41uLTM缓冲液及5uL TCEP溶液，总量为50uL，终浓度为1umol/L；涡旋混匀后瞬时离心，按95℃2min，4℃1min设置PCR仪，采用一步法合成四面体DNA纳米探针，将EP管涡旋混匀后瞬时离心，保存于4℃备用；
第三步，配制10％聚丙烯酰胺凝胶及9种样品，分别吸取10uL各组样品至200uL EP管中，再分别加入2uL上样缓冲液，轻轻吹打混匀，分别取10uL加入2-10泳道，最后再向1泳道内加入10uL DNA标记物；
第四步，在150V的电压下电泳5min后调整至80V继续电泳2h，直至上样缓冲液中的溴酚兰接近凝胶底部时切断电源；将70mL超纯水倒入大号培养皿，加入30uL核酸染料混匀；取出凝胶转至培养皿，震荡染色30min后取出，放入数码凝胶图像分析系统进行分析；
第五步，用镊子剥离完整的云母片薄层，用50uL 1％APTES溶液覆盖新鲜剥离的云母表面，作用30min使其钝化后用大量超纯水彻底冲洗，氮气吹干；再滴加15uL四面体DNA纳米探针，作用20min使其自然吸附于云母片表面，用超纯水轻柔淋洗后放入干燥盒，待水分蒸发后进行原子力显微镜检测。
进一步，所述电化学分析方法的工作电极的处理包括：用超纯水将麂皮浸润，将裸金电极垂直于麂皮表面，在0.5um粒径的Al2O3匀浆中打磨2min，用超纯水彻底冲洗后，再于0.05um粒径的Al2O3匀浆中抛光打磨至镜面，用超纯水彻底冲洗；随后以超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序分别超声清洗5min；用超纯水彻底冲洗，氮气吹干，将电极浸入新鲜配制的食人鱼溶液中活化15min以上，取出后用超纯水彻底冲洗，氮气吹干备用；
在电化学工作站上搭建三电极检测体系，以Ag/AgCl电极为参比电极、铂电极为对电极、打磨好的金电极为工作电极。用循环伏安法在0.5mol/L硫酸溶液中进行电化学清洗，直至出现标准、重复的曲线；
电化学清洗完毕后，用超纯水彻底淋洗电极，氮气吹干后浸入[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征，直至出现标准、重复的曲线且氧化/还原峰的电位差小于0.1V，其代表裸金电极清洗完成，将其命名为AuE，用于后续实验；若其电位差大于0.1V，则舍弃不用。
进一步，所述电化学分析方法的电沉积纳米金：将裸金电极浸入纳米金工作液中进行纳米金的电位溶出分析法电化学沉积；
电沉积完成后，将其命名为AuNPs/AuE，用超纯水彻底淋洗电极，氮气吹干，对其进行扫描式电子显微镜和电化学循环伏安法的表征。
进一步，所述电化学分析方法的工作电极的四面体DNA纳米探针修饰：将准备好的AuNPs/AuE倒插于泡沫板上，滴加4uL的四面体DNA纳米探针(1umol/L)至电极表面，盖上电极塑胶套。室温孵育3h后分别用PBS及超纯水彻底冲洗电极，氮气吹干，记为TSP/AuNPs/AuE，于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征后用超纯水冲洗，用氮气吹干。
进一步，所述电化学分析方法的甲基化DNA靶序列的检测：将100umol/L靶DNA序列B0/B1用杂交缓冲液稀释至1nmol/L，于PCR仪上以95℃加热变性5min，经涡旋混匀、瞬时离心后分别滴加10uL至各电极表面；将电极垂直插入泡沫板并放入水浴箱中，37℃孵育1h后取出，分别用PBS及超纯水彻底冲洗电极并用氮气吹干，此电极记为DNA/TSP/AuNPs/AuE，于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征后用超纯水冲洗，氮气吹干；
从-20℃取出缓冲液，在冰盒上用超纯水将其稀释至工作浓度(1×)，再从-20℃取出HpaII限制性内切酶原液，在冰盒上用缓冲液稀释至50Unit/mL；滴加10uL至各直立放置的电极表面，于水浴箱中37℃孵育2h后取出，分别用PBS及超纯水彻底冲洗并用氮气吹干，此电极记为HpaII/DNA/TSP/AuNPs/AuE，于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征后用超纯水冲洗，氮气吹干。
进一步，将100umol/L的H1、H2序列用TE缓冲液稀释至1umol/L，于PCR仪上以95℃加热变性5min后置于4℃复性15min以上，使H1、H2序列自发形成茎环结构；将H1、H2以1:1的比例混合，用HCR扩增缓冲液稀释至0.1umol/L，涡旋混匀、瞬时离心后滴加15uL至各电极表面；水浴箱中37℃孵育2h后，再分别用PBS及超纯水彻底冲洗并用氮气吹干，该电极记为HCR/HpaII/DNA/TSP/AuNPs/AuE，于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征后用超纯水冲洗，氮气吹干。
进一步，从-20℃取出链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶S-HRP液，用稀释液将其稀释至0.01mg/mL，滴加5uL至各电极表面，盖上电极塑胶套，室温孵育20min后分别用PBS及超纯水彻底冲洗电极以清除未结合的S-HRP，氮气吹干，该电极记为HRP/HCR/HpaII/DNA/TSP/AuNPs/AuE，于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征后用超纯水冲洗，氮气吹干。
进一步，将三电极体系放入TMB检测液中进行电流分析法与循环伏安法的检测，每次检测皆更换TMB检测液。电流分析法参数设置：InitE：0.1V，RunTime：100s，QuietTime：2s，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置。循环伏安法参数设置：InitE：0.7V，HighE：0.7V，LowE：0V，FinalE：0V，InitialScanPolarity：Negative，ScanRate：0.05V/s，SweepSegments：2，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置。
本发明的另一目的在于提供一种所述四面体DNA纳米探针在DNA甲基化高灵敏检测中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明的电化学生物传感技术在DNA甲基化检测方面具有独特的优点：能在较短时间内完成对甲基化DNA靶序列的特异性分析，操作方便、价格低廉、特异性好、稳定性强；同时，得益于多重信号放大体系的综合作用，检测灵敏度能力得以大大提升，能在血清等复杂体系中完成痕量DNA的甲基化检测，得到明显区别于非甲基化DNA序列的响应信号，从而为癌症及其他甲基化相关疾病的诊断提供准确、灵敏的检测结果。此外，本发明所涉仪器设备皆为小型化设备，可用于各类临床实验室开展DNA甲基化检测工作。
附图说明
图1是本发明实施例提供的的电化学分析方法流程图。
图2是本发明实施例提供的四面体DNA纳米探针的原子力显微图像示意图。
图3是本发明实施例提供的四面体DNA纳米探针的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图像示意图。
图4是本发明实施例提供的电极覆盖纳米金前后在硫酸溶液(A)与[Fe(CN)6]3+/4+溶液(B)中的CV曲线以及覆盖纳米金后电极表面的SEM图像及其逐级放大图像，比例尺分别为300um(C)、300nm(D)、50nm(E)。
图5是本发明实施例提供的生物传感器的步步修饰过程CV表征曲线示意图。
图6是本发明实施例提供的四面体DNA纳米探针固定时间(A)、靶序列杂交时间(B)及HpaII酶切时间(C)的优化实验结果示意图。
图7是本发明实施例提供的信号放大方法的对比示意图。
图8是本发明实施例提供的甲基化靶序列的循环伏安法曲线(A)；甲基化与非甲基化靶序列的电流分析法检测曲线(B)；不同浓度甲基化靶序列的电流分析法检测曲线(C)；不同浓度甲基化靶序列的电流分析法检测浓度-信号曲线及检测线性范围(D)。
图9是本发明实施例提供的完全互补靶序列(B1)、单碱基错配靶序列(BC1)及多碱基错配靶序列(BCx)的电流分析法检测信号(A)；传感器于4℃储存0-30天的电流分析法检测信号(B)示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于四面体DNA纳米探针的电化学分析方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明提供的电化学分析方法包括以下步骤：
S101：设计与合成特异性四面体DNA纳米探针及靶序列、信号探针；
S102：金电极步步自组装及表征；
S103：DNA甲基化电化学传感检测条件优化；
S104：DNA甲基化电化学传感检测及信号分析；
本发明提供的电化学分析方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的电化学分析方法仅仅是一个具体实施例而已。
本发实施例提供的四面体DNA纳米探针利用PrimerPremier、DNASis软件设计四面体探针结构序列、不同的DNA甲基化靶序列、信号放大序列及比对序列：
(1)四面体巯基化结构序列(S1，5’巯基修饰)SEQ ID NO：1：
5’-SH-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3’
(2)四面体巯基化结构序列(S2，5’巯基修饰)SEQ ID NO：2：
5’-SH-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3’
(3)四面体巯基化结构序列(S3，5’巯基修饰)SEQ ID NO：3：
5’-SH-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3’
(4)四面体探针结构序列(S4)SEQ ID NO：4：
5’-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTAGGTCGCAACACCCGGCGAGCACTGCGACCT-3’
(5)非甲基化靶序列(B0)SEQ ID NO：5：
5’-AGTCTAGGATTCTGAGTGGGTTAAAGGTCGCAGTGCTCGCCGGGTGT-3’
(6)甲基化靶序列(B1)SEQ ID NO：6：
5’-AGTCTAGGATTCTGAGTGGGTTAAAGGTCGCAGTGCTCGCCGGGTGT-3’
(7)单碱基错配甲基化靶序列(BC1)SEQ ID NO：7：
5’-AGTCTAGGATTCTGAGTGGGTTAAAGGTCGCAGTGCTCGCCAGGTGT-3’
(8)多碱基错配甲基化靶序列(BCx)SEQ ID NO：8：
5’-AGTCTAGGATTCTGAGTGGGTTAAACGTAGCAGGGCTTGCCAGGTGT-3’
(9)杂交链反应序列1(H1，5’修饰生物素)SEQ ID NO：9：
5’-biotin-TTAACCCACTCAGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCTGAGTG-3’
(10)杂交链反应序列2(H2，5’修饰生物素)SEQ ID NO：10：
5’-biotin-AGTCTAGGATTCTGAGTGGGTTAACACTCAGAATCCTAGACTACTTTG-3’
(11)普通信号探针放大法比对靶序列(T1)SEQ ID NO：11：
5’-TAGTGACTAGGTCGCAGTGCTCGCCGGGTGT-3’
(12)普通信号探针放大法信号探针序列(R1，3’修饰生物素)SEQ ID NO：12：
5’-AGTCACTA-biotin-3’
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
本发明提供的电化学分析方法具体包括以下步骤：
(1)从-20℃取出所有DNA序列冻干粉，按试剂厂家要求加入对应体积TE缓冲液(10mmol/LTris、1mmol/LEDTA，pH＝8.0)使其溶解至100umol/L。
(2)用TE缓冲液稀释S1-S4序列至50umol/L，分别吸取1uL加入同一支EP管中，加入41uLTM缓冲液(20mmol/L Tris、50mmol/L MgCl2，pH＝8.0)及5uL TCEP溶液(30mmol/L)，总量为50uL，DNA终浓度为1umol/L。涡旋混匀后瞬时离心，按参数(95℃2min，4℃1min)设置PCR仪，进行“一步法”合成四面体DNA纳米探针。随后将EP管涡旋混匀后瞬时离心，保存于4℃备用。
(3)配制10％聚丙烯酰胺凝胶及9种样品(具体成分见表1)，制作过程同四面体DNA纳米探针。分别吸取10uL各组样品至200uL EP管中，再分别加入2uL上样缓冲液，轻轻吹打混匀，分别取10uL加入2-10泳道，最后再向1泳道内加入10uL DNA标记物。在150V的电压下电泳5min后调整至80V继续电泳2h，直至上样缓冲液中的溴酚兰接近凝胶底部时切断电源。将70mL超纯水倒入大号培养皿，加入30uL核酸染料混匀。取出凝胶转至培养皿，震荡染色30min后取出，放入数码凝胶图像分析系统进行分析。
表1各组样品的成分
(4)用镊子剥离完整的云母片薄层，避免碎屑残留。用50uL 1％APTES溶液覆盖新鲜剥离的云母表面，作用30min使其钝化后用大量超纯水彻底冲洗，氮气吹干。再滴加15uL四面体DNA纳米探针，作用20min使其自然吸附于云母片表面，用超纯水轻柔淋洗后放入干燥盒，待水分蒸发后进行原子力显微镜检测。
在本发明的实施例中工作电极的处理：用超纯水将麂皮浸润，将裸金电极垂直于麂皮表面，在0.5um粒径的Al2O3匀浆中打磨2min，用超纯水彻底冲洗后，再于0.05um粒径的Al2O3匀浆中抛光打磨至镜面，用超纯水彻底冲洗。随后以超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序分别超声清洗5min。用超纯水彻底冲洗，氮气吹干，将电极浸入新鲜配制的食人鱼溶液(98％浓硫酸与30％过氧化氢体积比为3:1)中活化15min以上，取出后用超纯水彻底冲洗，氮气吹干备用。在电化学工作站上搭建三电极检测体系，以Ag/AgCl电极为参比电极、铂电极为对电极、打磨好的金电极为工作电极。用循环伏安法在0.5mol/L硫酸溶液中进行电化学清洗，直至出现标准、重复的曲线(参数设置：InitE：-0.3V，HighE：1.6V，LowE：-0.3V，FinalE：0V，InitialScanPolarity：Positive，ScanRate：0.05V/s，SweepSegments：10，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置)。电化学清洗完毕后，用超纯水彻底淋洗电极，氮气吹干后浸入[Fe(CN)6]3+/4+溶液(1mmol/L K3Fe(CN)6、1mmol/L K4Fe(CN)6及0.1mol/L KCl)中进行循环伏安法表征，直至出现标准、重复的曲线且氧化/还原峰的电位差小于0.1V(参数设置：InitE：-0.3V，HighE：0.7V，LowE：-0.3V，FinalE：0V，InitialScanPolarity：Positive，ScanRate：0.05V/s，SweepSegments：10，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置)，其代表裸金电极清洗完成，将其命名为AuE，可用于后续实验；若其电位差大于0.1V，则舍弃不用。
在本发明的实施例中电沉积纳米金：将裸金电极浸入纳米金工作液(10mmol/LHAuCl4、0.5mol/L硫酸)中进行纳米金的电位溶出分析法电化学沉积(参数设置：InitE：-0.2V，DepositionTime：60s，QuiteTime：2s，其余参数使用默认设置)。电沉积完成后，将其命名为AuNPs/AuE，用超纯水彻底淋洗电极，氮气吹干，对其进行扫描式电子显微镜和电化学循环伏安法的表征(参数设置：InitE：-0.3V，HighE：0.7V，LowE：-0.3V，FinalE：0V，InitialScanPolarity：Positive，ScanRate：0.05V/s，SweepSegments：10，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置)。
在本发明的实施例中工作电极的四面体DNA纳米探针修饰：将准备好的AuNPs/AuE倒插于泡沫板上，滴加4uL、1umol/L的四面体DNA纳米探针至电极表面，盖上电极塑胶套。室温孵育3h后分别用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)及超纯水彻底冲洗电极，氮气吹干，记为TSP/AuNPs/AuE，于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征(参数设置：InitE：-0.3V，HighE：0.7V，LowE：-0.3V，FinalE：0V，InitialScanPolarity：Positive，ScanRate：0.05V/s，SweepSegments：10，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置)后用超纯水冲洗，用氮气吹干后进行下一步操作。
在本发明的实施例中甲基化DNA靶序列的检测：将100umol/L靶DNA序列(B0/B1)用杂交缓冲液(20mmol/L MgCl2、1mol/L NaCl，用PBS溶解)稀释至1nmol/L，于PCR仪上以95℃加热变性5min，经涡旋混匀、瞬时离心后分别滴加10uL至各电极表面，将电极垂直插入泡沫板并放入水浴箱中，37℃孵育1h后取出，分别用PBS及超纯水彻底冲洗电极并用氮气吹干，此电极记为DNA/TSP/AuNPs/AuE，于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征(参数设置：InitE：-0.3V，HighE：0.7V，LowE：-0.3V，FinalE：0V，InitialScanPolarity：Positive，ScanRate：0.05V/s，SweepSegments：10，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置)后用超纯水冲洗，氮气吹干。
从-20℃取出适量缓冲液(含50mmol/L醋酸钾、20mmol/L Tris-醋酸、10mmol/L醋酸镁、100ug/mL BSA，pH＝7.9)，在冰盒上用超纯水将其稀释至工作浓度(1×)，再从-20℃取出HpaII限制性内切酶原液(10000Unit/mL)，在冰盒上用缓冲液稀释至50Unit/mL。滴加10uL至各直立放置的电极表面，于水浴箱中37℃孵育2h后取出，分别用PBS及超纯水彻底冲洗并用氮气吹干，此电极记为HpaII/DNA/TSP/AuNPs/AuE，于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征(参数设置：InitE：-0.3V，HighE：0.7V，LowE：-0.3V，FinalE：0V，InitialScanPolarity：Positive，ScanRate：0.05V/s，SweepSegments：10，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置)后用超纯水冲洗，氮气吹干。
将100umol/L的H1、H2序列用TE缓冲液稀释至1umol/L，于PCR仪上以95℃加热变性5min后置于4℃复性15min以上，使H1、H2序列自发形成茎环结构。将H1、H2以1:1的比例混合，用HCR扩增缓冲液(1mol/L NaCl、50mmol/L Na2HPO4，pH＝7.5)稀释至0.1umol/L，涡旋混匀、瞬时离心后滴加15uL至各电极表面。水浴箱中37℃孵育2h后，再分别用PBS及超纯水彻底冲洗并用氮气吹干，该电极记为HCR/HpaII/DNA/TSP/AuNPs/AuE，于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征(参数设置：InitE：-0.3V，HighE：0.7V，LowE：-0.3V，FinalE：0V，InitialScanPolarity：Positive，ScanRate：0.05V/s，SweepSegments：10，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置)后用超纯水冲洗，氮气吹干后进行下一步操作。
从-20℃取出链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(S-HRP)液，用稀释液(1％BSA、0.5％酪蛋白)将其稀释至0.01mg/mL，滴加5uL至各电极表面，盖上电极塑胶套，室温孵育20min后分别用PBS及超纯水彻底冲洗电极以清除未结合的S-HRP，氮气吹干，该电极记为HRP/HCR/HpaII/DNA/TSP/AuNPs/AuE，于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征(参数设置：InitE：-0.3V，HighE：0.7V，LowE：-0.3V，FinalE：0V，InitialScanPolarity：Positive，ScanRate：0.05V/s，SweepSegments：10，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置)后用超纯水冲洗，氮气吹干。
将三电极体系放入TMB检测液(即用型溶液，预含H2O2)中进行电流分析法与循环伏安法的检测，每次检测皆更换TMB检测液。电流分析法参数设置：InitE：0.1V，RunTime：100s，QuietTime：2s，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置。循环伏安法参数设置：InitE：0.7V，HighE：0.7V，LowE：0V，FinalE：0V，InitialScanPolarity：Negative，ScanRate：0.05V/s，SweepSegments：2，Sensitivity1e-0.05A/V，其余参数使用默认设置。
下面结合实验对本发明的技术效果做详细的描述。
(1)实验条件的优化：将四面体DNA纳米探针固定到电极表面的时间分别设置为0、1、2、3、4h，靶DNA杂交的时间分别设置为0、0.5、1、1.5、2、2.5h，HpaII酶切的时间分别设置为0、0.5、1、1.5、2、2.5h，在其余条件不变的情况下检测最终的电流分析法信号差异，找到最佳反应条件。
(2)靶DNA的浓度梯度检测：分别配制不同浓度的靶DNA溶液，从1amol/L开始，以10倍为梯度逐级递增至100nmol/L，共12个数量级进行浓度梯度的检测，记录最终的电流分析法信号差异。
(3)信号放大方法的比对将100umol/L T1、R1序列分别用TE缓冲液稀释至1umol/L，分别用杂交缓冲液稀释至0.1umol/L，再次涡旋混匀、瞬时离心后用于表2中“无放大”及“AuNPs放大”组的实验。将电极分为5组进行对比实验，除下表所述项目的区别以外，其余实验操作同前。
表2对比实验条件设置
(4)重复性、特异性及稳定性实验：配制1pmol/L的靶DNA溶液，分别滴加10uL至同一批处理的5组共15根(每组3根)电极表面，按照前述实验操作及参数进行重复性实验检测。
分别配制1pmol/L的完全互补靶DNA(B1)及错配靶DNA(BC1/BCx)溶液，按照前述实验操作，重复3次，对传感器的碱基错配识别能力进行检测。
将100umol/L靶DNA序列用血清稀释至1、10、20、50、100fmol/L，经涡旋混匀、瞬时离心后分别滴加10uL至不同的电极表面进行杂交，按照前述实验操作重复3次，模拟真实检测样本对传感器的检测能力进行验证。
按照前述实验操作准备4根电极，完成首次电流分析法检测后用PBS及超纯水冲洗电极，氮气吹干后盖上电极塑胶套，储存于4℃冰箱中。后每隔10日进行一次电极的电流分析法检测并再次冲洗、放回4℃冰箱储存，直至第三次(第30日)检测完成。
(5)四面体DNA纳米探针的原子力显微镜表征：如图2所示，原子力显微镜图像显示，云母片基底较为平整，经自然沉降固定后，四面体DNA纳米探针在镜下呈山峰状，其平均高度约为4.73nm。
(6)四面体DNA纳米探针的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征：如图3所示，染色后的凝胶置于紫外灯下显像，各组样品分离良好，无拖尾现象。各泳道加载的样品依组成成分的不同，在凝胶中呈现明显的电泳速率差异，其中位于第10泳道的四面体DNA纳米探针(S1+S2+S3+S4)电泳速率最慢。
(7)金电极的处理：金电极经过打磨抛光、超声清洗、食人鱼溶液活化后，于硫酸溶液中进行电化学清洗，直至出现稳定、重复的曲线。如图4的A黑色实线，可见+0.93V处有一个较大的阴极还原峰，+1.15～+1.6V处有多重阳极氧化峰。用[Fe(CN)6]3+/4+溶液进行循环伏安法表征，得到的稳定曲线如图3的B中黑色实线，可见+0.18V处出现一个阳极氧化峰，+0.26V处出现一个阴极还原峰，两个峰的峰型对称，电位差约为0.08V。
电极进行电镀金之后，在硫酸溶液及[Fe(CN)6]3+/4+溶液都表现出了峰电流增大的现象，如图4的A及4的B的虚线。将镀金后的电极置于扫描电镜上检测，图4的C、D、E显示电极表面聚有大量平均粒径40±5nm左右的颗粒物。
(8)生物传感器的修饰：准备好的传感器经过四面体DNA纳米探针的覆盖后与靶序列杂交，再经HpaII、HCR及S-HRP的处理，每一步完成后都于[Fe(CN)6]3+/4+溶液中进行循环伏安法表征，如图5所示，AuE与AuNPs/AuE呈现出较大的峰电流，随着后续操作的进行，电极的峰电流逐步降低，表明电化学生物传感器每一步的修饰成功。
(9)实验条件的优化：四面体DNA纳米探针的固定时间从0至4h的优化实验电流分析法检测结果如图6的A所示，随着固定时间的增加，电流分析法检测信号逐渐增大，超过3h之后，电流分析法信号趋于平缓；靶序列的杂交时间从0至2.5h的优化实验结果(n＝3)如图6的B所示，随着杂交时间的增加，检测信号迅速增大，达到1h后，电流分析法信号升高的幅度趋于平缓；限制性内切酶HpaII的酶切时间从0至2.5h的优化实验结果(n＝3)如图6的C所示，随着酶切时间的增加，非甲基化靶序列B0的电流分析法检测信号逐渐降低，超过2h之后其电流分析法信号下降幅度趋于平缓，与此同时，甲基化靶序列B1的电流分析法检测信号变化不大。
(10)信号放大方法的对比信号放大：对比实验的电流分析法检测结果如图7所示，随着信号放大体系的加入，电流呈现出上升的趋势，其中HCR的提升效果较AuNPs更加显著。与未用信号放大的实验组相比，AuNPs+HCR组的电流提升约3.9倍。
(11)靶DNA的检测：图8的A为传感器在TMB底物中的循环伏安法表征曲线，在空白对照中(黑色实线)，可见两对氧化还原峰，随着靶序列浓度的增加，+0.24V处的还原峰电流亦随之升高，发生非对称性变化。
图8的B为传感器分别检测1nmol/L的甲基化靶序列(B1)与非甲基化靶序列(B0)的电流分析法检测曲线，可见非甲基化靶序列的信号几乎接近于空白信号值，而甲基化靶序列的信号更强。
图8的C为传感器分别检测不同浓度甲基化靶序列的电流分析法检测曲线，从上至下分别为空白对照与1amol/L至100nmol/L的靶序列(以10倍为梯度递增)，其电流与靶序列浓度正相关，各组取3次重复实验的均值作图后如图8的D所示。图8的D内嵌图显示在1amol/L至1pmol/L的浓度范围内，该传感器检测到的电流与靶序列浓度的对数呈现出良好的线性关系，线性方程可表述为Y＝4130.28LogC+206.09，相关系数R＝0.9909。
传感器用1pmol/L甲基化靶序列于TMB溶液中用电流分析法检测5组，所得各组的平均检测信号如表3所示，总体平均电流≈1780±86nA，RSD≈4.846％。
表3重复性实验结果
(12)传感器的特异性及稳定性实验：图9的A显示了1pmol/L完全互补甲基化靶序列(B1)、单碱基错配甲基化靶序列(BC1)及多碱基错配甲基化靶序列(BCx)的电流分析法检测信号，可见错配序列的电流明显降低。
图9的B显示了1pmol/L的甲基化靶序列完成首次电流分析法检测后储存于4℃，10日后再次取出检测，反复储存-取出检测3次后的电流分析法检测信号。可见随着时间的延长，检测信号逐渐降低，第30天时检测信号约为原信号的91.97％。
(13)血清回收实验：向健康人血清中加入甲基化靶序列后检测其电流分析法信号，结果如表4所示，回收率在96.02至105.43％之间，RSD为1.22至6.74％。
表4血清回收实验结果
综上所述，本发明所用的四面体DNA纳米探针合成有效、产率较高，成功按照设想形成立体结构。电化学传感检测结果证明传感器的每一步修饰成功、有效，将各种生物分子修饰于电极表面。该传感器在四面体探针固定时间3h、靶序列杂交时间1h、HpaII内切酶酶切时间2h的条件下体现出最优性能，于1amol/L至1pmol/L的范围内表现出较好的检测能力，检出限达到0.93amol/L，灵敏度高。碱基错配甲基化靶序列的检测实验及人血清加标回收实验结果证明该传感器有良好的特异性及抗干扰能力，30天的储存稳定性亦通过验证。结果证明该DNA甲基化电化学生物传感器能完成痕量甲基化DNA靶序列的检测，能为DNA甲基化相关疾病的早期诊断与治疗跟踪提供准确、灵敏的方法。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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