一种检测miRNA-182的生物传感器及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种检测miRNA-182的生物传感器及其制备方法和应用 (Biosensor for detecting miRNA-182 and preparation method and application thereof ) 是由 黄容琴 王�义 梁栋 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测miRNA-182的生物传感器及其制备方法和应用,属于生物传感器领域。所述生物传感器的制备方法包括：制备氨基化Fe-(3)O-(4)磁性纳米球；用单体2,4,6-三羟基苯-1,3,5-三甲醛与氨基化磁性纳米球反应,制备COF层包裹的核壳型MCOF纳米球；将发夹DNA探针1和探针2与miRNA-182室温下孵育后,再与核壳型MCOF纳米球淬灭反应,构建荧光信号放大的miRNA-182的生物传感器。该生物传感器可定量测定脑肿瘤患者血清中的miRNA-182,具有检测限低、线性范围宽和稳定性高的特点,将其结合毛细管系统可实现miRNA检测可视化,有助于脑肿瘤的非侵入性简单快速诊断和预后监测。(The invention discloses a biosensor for detecting miRNA-182, a preparation method and application thereof, and belongs to the field of biosensors. The preparation method of the biosensor comprises the following steps: preparation of aminated Fe 3 O 4 Magnetic nanospheres; reacting 2,4, 6-trihydroxybenzene-1, 3, 5-trimethyl aldehyde monomer with the aminated magnetic nanospheres to prepare core-shell MCOF nanospheres wrapped by COF layers; and (3) incubating the hairpin DNA probe 1 and the probe 2 with miRNA-182 at room temperature, and then carrying out quenching reaction with the core-shell MCOF nanospheres to construct a miRNA-182 biosensor with amplified fluorescence signals. The biosensor can quantitatively measure miRNA-182 in serum of a brain tumor patient, has the characteristics of low detection limit, wide linear range and high stability, can realize miRNA detection visualization by combining the biosensor with a capillary system, and is beneficial to non-invasive simple and rapid diagnosis and prognosis monitoring of the brain tumor.)
技术领域
本发明涉及生物传感器领域，特别是涉及一种检测miRNA-182的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
脑肿瘤预后较差，又由于位置特殊而难以被及时发现，这导致大多数脑肿瘤患者在确诊后错过了最佳治疗期。因此，及时、早期发现和准确诊断脑肿瘤对于有效的临床治疗至关重要。目前，脑肿瘤的临床诊断通常采用磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描(CT)等成像方法。然而，这些方法无法区分良性病变与恶性病变，尤其是早期的小尺寸病变。虽然组织活检可以提高准确性，但因其具有侵袭性而不利于位于中枢神经系统的脑肿瘤的诊断。基于生物体液中肿瘤标志物(包括miRNA、ctDNA、蛋白质、外泌体和CTC)的液体活检因其简单、快速和非侵入性而在癌症诊断中具有极大的应用前景。其中，miRNA作为靶向特定信使RNA以下调某些基因表达的非编码小RNA，在肿瘤发生发展过程中表现出高度特异性。miRNA-182在脑肿瘤细胞的增殖和侵袭中起重要调节作用，有研究报道miRNA-182可高特异性指示脑肿瘤的发生和发展，因此可作为脑肿瘤简单快速诊断和预后监测的生物标志物。然而，miRNA-182在人血液中含量极低且同源miRNA分辨力不高，需解决以上问题方能实现miRNA的灵敏检测。
作为一种简单有效的等温信号放大技术，杂交链反应在生物传感、生物成像和生物医学应用颇多，并在低丰度miRNA检测方面表现出优势。然而杂交链反应需要合适的信号放大传感平台。传统的荧光猝灭剂如石墨烯、二硫化钼、黑磷(BP)纳米片可以通过与核酸的π-π作用实现荧光传感检测，但协同该传感的平台很少利用荧光信号放大来增强miRNA检测的灵敏度。二维共价有机框架纳米片可以结合杂交链反应，通过晶体共价有机框架(COF)和特殊DNA链之间的灵敏的相互作用实现基于荧光信号放大的DNA传感。然而大多数COF纳米片聚集严重、结晶度低且易降解(不稳定性)，这极大地降低了纳米片的生物传感性能。而且COF有机纳米材料掺入复杂的检测系统(血液)后，难以在检测过程中实现分离。这些都会降低基于COF的荧光生物传感器的灵敏度和稳定性。因此迫切需要制备具有高结晶度的磁性COF纳米球，以实现它们与核酸分子的相互作用，同时也实现简便的磁分离，用于灵敏的miRNA检测和快速的脑肿瘤诊断和预后监测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测miRNA-182的生物传感器及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该miRNA生物传感器可定量测定脑肿瘤患者血清中的miRNA-182，具有检测限低、线性范围宽和稳定性高的特点，结合该生物传感器和毛细管系统可实现miRNA检测可视化，有助于脑肿瘤的非侵入性简单快速诊断和预后监测。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种检测miRNA-182的生物传感器的制备方法，，包括以下步骤：
步骤1：通过在Fe3O4纳米球添加原硅酸四乙酯TEOS和(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷APTES，制备氨基化磁性纳米球；
步骤2：用单体2,4,6-三羟基苯-1,3,5-三甲醛与所述氨基化磁性纳米球反应，制备2,4,6-三羟基苯-1,3,5-三甲醛功能化的磁性纳米球；
再将所述2,4,6-三羟基苯-1,3,5-三甲醛功能化的磁性纳米球进行COF介导的原位生长，制备核壳型MCOF纳米球；
步骤3：将发夹DNA探针1和发夹DNA探针2与miRNA-182室温下孵育后，再与所述核壳型MCOF纳米球淬灭反应，构建荧光信号放大的miRNA-182的生物传感器。
优选的是，步骤2中，通过Schiff碱反应将单体2,4,6-三羟基苯-1,3,5-三甲醛接枝到氨基化纳米球表面，之后所述2,4,6-三羟基苯-1,3,5-三甲醛功能化的磁性纳米球与单体2,4,6-三羟基苯-1,3,5-三甲醛、联苯胺高温下进行COF的原位生长，制备核壳型MCOF纳米球。
优选的是，高温条件为：60℃～240℃反应10～72h。
优选的是，步骤3中，所述发夹DNA探针1和发夹DNA探针2为两个可发生杂交链反应的长度为18～32个碱基的序列。
优选的是，步骤3中，所述发夹DNA探针1和发夹DNA探针2终浓度为1nM～1μM；核壳型MCOF纳米球终浓度为0.02mg/ml～1mg/ml。
优选的是，步骤3中，孵育时间为：30min～24h；淬灭时间为5min～2h。
优选的是，核壳型MCOF纳米球尺寸分布为300nm～600nm，Zeta电位为-50.0mV～50.0mV。
本发明还提供了一种所述的制备方法制备的检测miRNA-182的生物传感器。
本发明还提供所述的生物传感器在制备检测miRNA-182试剂中的应用。
优选的是，构建上述生物传感器后，待磁场作用分离，取上清液进行荧光测定，以检测待测样品中miRNA-182的含量。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过单体介导的原位界面生长策略制备了分散且高结晶的磁性共价有机骨架(COF)包裹的Fe3O4磁性纳米球(MCOF)。利用MCOF与发夹DNA分子之间独特的相互作用，构建了荧光信号放大的miRNA生物传感器。凭借特殊的磁性COF纳米球和独特的传感系统，该miRNA生物传感器可以实现对不同基质中miRNA-182的灵敏检测。通过实验验证，该生物传感器可以定量测定脑肿瘤患者血清中的miRNA-182，检测限、线性范围和回归系数(R2)分别达到20fM、0.1pM～10pM和0.991，具有检测限低、线性范围宽和稳定性高的特点。此外，该生物传感器具有良好的稳定性、准确度和精密度。在此基础上提出了一种结合该生物传感器与毛细管芯片系统，可实现微量样品中miRNA-182的可视化检测的策略。这为脑肿瘤的非侵入性简单快速诊断和预后监测提供了一种可靠的候选方法，具有极大的应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为核壳型MCOF纳米球的结构表征；a：磁性Fe3O4纳米球的TEM图像和ED图(插图)；b：多个核壳型MCOF纳米球的TEM图像和ED图；c：单个核壳型MCOF纳米球的TEM图像；d：COF壳的HRTEM图像；e：磁性Fe3O4核的HRTEM图像；f：MCOF的STEM图像和EDS元素映射；g：MCOF的XRD图；h：单体(TT：2,4,6-三羟基苯-1,3,5-三甲醛；联苯胺)、中间产物(Fe3O4、Fe3O4@SiO2)和MCOF纳米球的FT-IR光谱；
图2为核壳型MCOF纳米球的结构分析；a：XPS总光谱；b：与总光谱相对应的C1s、c：与总光谱相对应的N1s、d：与总光谱相对应的O1s；e：与总光谱相对应的Fe 2p光谱；f：氮吸附-解吸等温线和孔径分布曲线；
图3为荧光信号放大生物传感器的优化；a-b分别在不存在H2和同时存在H1和H2的情况下，用于miRNA生物传感的荧光信号放大生物传感器的荧光光谱；c-f分别在不同杂交链反应温度、不同H1和H2探针浓度、有或没有磁分离以及在不同介质中，用于miRNA生物传感的荧光信号放大生物传感器的相对荧光强度；
图4为真实血液样本中miRNA检测的标准曲线；
图5为基于MCOF的生物传感器在不同靶标序列时的相对荧光强度；T：靶标miRNA；SM：单碱基错配miRNA；FM：四碱基错配miRNA；R：随机miRNA；
图6为通过基于MCOF的生物传感器检测12名健康供体血清、12名神经胶质瘤患者手术前后血清样本中miRNA-182的浓度；GP：手术前的胶质瘤患者；AS：手术后；HD：健康供体；
图7为不同miRNA浓度下的基于MCOF的毛细管辅助的可视化传感系统的荧光图像和示意图；
图8为MCOF的TGA曲线；
图9为磁吸附前后MCOF溶液的图像；
图10为H1序列和H2序列结构示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1一种检测miRNA-182的生物传感器
(1)150mg Fe3O4纳米球分散在100ml乙醇中，然后加入25ml纯水和1.2ml氨水并混匀。加入100μl TEOS乙醇溶液反应9h。高速离心分离并洗涤获得颗粒。将产物分散到120ml异丙醇中，添加0.5ml APTES，机械搅拌9h后离心分离产物，洗涤，冷冻干燥得到氨基化磁性纳米球。
上述所得氨基化磁性纳米球分散到10ml二恶烷中，加入10mg单体2,4,6-三羟基苯-1,3,5-三甲醛(TT)，150μl纯乙酸，混匀后转移到反应釜中120℃加热1h，高速离心分离产物，并依次用DMF、二恶烷和均三甲苯洗涤，冷冻干燥得到TT功能化的磁性纳米球。随后上述产物与21mg单体TT、27.6mg联苯胺分散在5ml均三甲苯/二恶烷(1:1)中，混匀后转移至反应釜中60℃反应48h进行COF的原位生长，制备核壳型MCOF纳米球。
(2)使用总RNA快速抽提试剂盒，按照抽提步骤从血清样品中提取总RNA。将发夹DNA探针1(H1)(终浓度50nM)和发夹DNA探针2(H2)(终浓度50nM)与miRNA-182加入到PBS中，充分混合均匀后，在室温下孵育1h。然后将核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)添加到上述混合物中，淬灭15min，磁场作用分离后，取上清进行荧光测定。
其中，H1序列(5’-3’)：
AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAACAAAGTTTTGGCAA
H2序列(5’-3’)：
TTTGGCAATGGTAGAACTCACACTAGTTCTACCATTGCCAAAACTTTG
针对目标序列设计的两条链，H1序列可与目标序列和H2序列的一部分互补，H1序列的5’端修饰有Texas Red荧光基团，且H1和H2序列在目标序列(相当于引物)存在的条件下，可以继续自行互补延伸实现级联反应(如图10所示)。
实施例2一种检测miRNA-182的生物传感器
(1)150mg Fe3O4纳米球分散在100ml乙醇中，然后加入25ml纯水和1.2ml氨水并混匀。加入100μl TEOS乙醇溶液反应9h。高速离心分离并洗涤获得颗粒。将产物分散到120ml异丙醇中，添加0.5ml APTES，机械搅拌9h后离心分离产物，洗涤，冷冻干燥得到氨基化磁性纳米球。
上述所得氨基化磁性纳米球分散到10ml二恶烷中，加入10mg单体2,4,6-三羟基苯-1,3,5-三甲醛(TT)，150μl纯乙酸，混匀后转移到反应釜中120℃加热1h，高速离心分离产物，并依次用DMF、二恶烷和均三甲苯洗涤，冷冻干燥得到TT功能化的磁性纳米球。随后上述产物与21mg单体TT、27.6mg联苯胺分散在5ml均三甲苯/二恶烷(1:1)中，混匀后转移至反应釜中120℃反应48h进行COF的原位生长，制备核壳型MCOF纳米球。
(2)使用总RNA快速抽提试剂盒，按照抽提步骤从血清样品中提取总RNA。将发夹DNA探针1(H1)(终浓度50nM)和发夹DNA探针2(H2)(终浓度50nM)与miRNA-182加入到PBS中，充分混合均匀后，在室温下孵育1h。然后将核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)添加到上述混合物中，淬灭15min，磁场作用分离后，取上清进行荧光测定。
实施例3一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例1不同之处在于：将实施例1的“随后上述产物与21mg单体TT、27.6mg联苯胺分散在5ml均三甲苯/二恶烷(1:1)中，混匀后转移至反应釜中60℃反应48h进行COF的原位生长，制备核壳型MCOF纳米球”中的60℃替换为180℃，其他条件和步骤均不变。
实施例4一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例1不同之处在于：将实施例1的“随后上述产物与21mg单体TT、27.6mg联苯胺分散在5ml均三甲苯/二恶烷(1:1)中，混匀后转移至反应釜中60℃反应48h进行COF的原位生长，制备核壳型MCOF纳米球”中的60℃替换为240℃，其他条件和步骤均不变。
实施例5一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：将实施例2的“随后上述产物与21mg单体TT、27.6mg联苯胺分散在5ml均三甲苯/二恶烷(1:1)中，混匀后转移至反应釜中60℃反应48h进行COF的原位生长，制备核壳型MCOF纳米球”中的“反应48h”替换为“反应10h”，其他条件和步骤均不变。
实施例6一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：将实施例2的“随后上述产物与21mg单体TT、27.6mg联苯胺分散在5ml均三甲苯/二恶烷(1:1)中，混匀后转移至反应釜中60℃反应48h进行COF的原位生长，制备核壳型MCOF纳米球”中的“反应48h”替换为“反应24h”，其他条件和步骤均不变。
实施例7一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：将实施例2的“随后上述产物与21mg单体TT、27.6mg联苯胺分散在5ml均三甲苯/二恶烷(1:1)中，混匀后转移至反应釜中60℃反应48h进行COF的原位生长，制备核壳型MCOF纳米球”中的“反应48h”替换为“反应72h”，其他条件和步骤均不变。
实施例8一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：H1终浓度为1nM和H2终浓度为1nM；其他条件和步骤不变。
实施例9一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：H1终浓度为5nM和H2终浓度为5nM；其他条件和步骤不变。
实施例10一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：H1终浓度为10nM和H2终浓度为10nM；其他条件和步骤不变。
实施例11一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：H1终浓度为20nM和H2终浓度为20nM；其他条件和步骤不变。
实施例12一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：H1终浓度为100nM和H2终浓度为100nM；其他条件和步骤不变。
实施例13一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：H1终浓度为500nM和H2终浓度为500nM；其他条件和步骤不变。
实施例14一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：H1终浓度为1μM和H2终浓度为1μM；其他条件和步骤不变。
实施例15一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“室温孵育1h”替换为“室温孵育30min”；其他条件和步骤不变。
实施例16一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“室温孵育1h”替换为“室温孵育2h”；其他条件和步骤不变。
实施例17一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“室温孵育1h”替换为“室温孵育10h”；其他条件和步骤不变。
实施例18一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“室温孵育1h”替换为“室温孵育24h”；其他条件和步骤不变。
实施例19一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)”替换为“核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.02mg/ml)”；其他条件和步骤不变。
实施例20一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)”替换为“核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.05mg/ml)”；其他条件和步骤不变。
实施例21一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)”替换为“核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.1mg/ml)”；其他条件和步骤不变。
实施例22一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)”替换为“核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.5mg/ml)”；其他条件和步骤不变。
实施例23一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)”替换为“核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度1mg/ml)”；其他条件和步骤不变。
实施例24一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“淬灭15min”替换为“淬灭5min”；其他条件和步骤不变。
实施例25一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“淬灭15min”替换为“淬灭10min”；其他条件和步骤不变。
实施例26一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“淬灭15min”替换为“淬灭30min”；其他条件和步骤不变。
实施例27一种检测miRNA-182的生物传感器
与实施例2不同之处在于：(2)中，“淬灭15min”替换为“淬灭2h”；其他条件和步骤不变。
实施例28
通过场发射透射电子显微镜观察实施例2所制备的核壳型MCOF纳米球的形貌、晶格和元素组成，通过Bruker D8衍射仪记录核壳型MCOF纳米球的粉末X射线衍射，通过红外光谱仪获得了红外光谱。
如图1所示，结果显示核壳型MCOF纳米球以均匀的Fe3O4纳米球为核，高结晶共价有机骨架(COF)为壳。
实施例29
通过X射线光电子能谱和比表面及孔径分析仪分析实施例2所制备的核壳型MCOF纳米球的分子结构、元素含量、比表面积和孔径分布。
如图2所示，结果显示了C、O和N元素的分布，并证实了结晶COF框架，XPS中没有明显的Fe信号证实Fe3O4被COF壳完整包裹。MCOF的BET表面积和孔体积分别达到224m2/g和0.32cc/g。
实施例30
通过荧光光谱仪分析探针协同、杂交链反应温度、探针浓度、磁场作用和不同介质对实施例2所制备的生物传感器检测的影响。
通过将H1和H2(或不加H2)与miRNA-182(或不加miRNA-182)加入到PBS中，充分混合均匀后，在室温下孵育1h。然后将核壳型MCOF纳米球溶液(或不加MCOF纳米球溶液)添加到上述混合物中，淬灭15min，磁场作用分离后，取上清进行荧光测定，考察探针协同的影响。
通过将H1(终浓度50nM)和H2(终浓度50nM)与miRNA-182加入到PBS中，充分混合均匀后，在室温(或4℃、37℃)下孵育1h。然后将核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)添加到上述混合物中，淬灭15min，磁场作用分离后，取上清进行荧光测定，考察杂交链反应温度的影响。
通过实施例8-实施例14考察了不同探针浓度的影响。
通过将H1(终浓度50nM)和H2(终浓度50nM)与miRNA-182加入到PBS中，充分混合均匀后，在室温下孵育1h。然后将核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)添加到上述混合物中，淬灭15min，磁场作用分离(或无磁场作用)后，取上清进行荧光测定，考察磁场作用的影响。
通过将H1(终浓度50nM)和H2(终浓度50nM)与miRNA-182加入到PBS(或大鼠血浆、血清、全血)中，充分混合均匀后，在室温下孵育1h。然后将核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)添加到上述混合物中，淬灭15min，磁场作用分离后，取上清进行荧光测定，考察不同介质的影响。
如图3所示，结果显示在没有H2的情况下无法形成dsDNA，MCOF通过特殊吸附淬灭了H1的荧光，在H1和H2同时存在的情况下，由于miRNA与H1和H2杂交成不可吸附的dsDNA这种淬灭被显著阻断。结果显示检测温度为25℃，H1+H2探针浓度为50nM以及与磁分离协同作用的条件下，具有最佳的检测性能。
实施例31
通过荧光光谱仪分析血清基质中实施例2所制备的生物传感器的检测方法的线性、特异性。
通过将H1(终浓度50nM)和H2(终浓度50nM)与miRNA-182(设置终浓度梯度为10fM～1nM)加入到PBS中，充分混合均匀后，在室温下孵育1h。然后将核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)添加到上述混合物中，淬灭15min，磁场作用分离后，取上清进行荧光测定，考察线性。
通过将H1(终浓度50nM)和H2(终浓度50nM)与miRNA-182(或单碱基错配序列、四碱基错配序列、随机序列)加入到PBS中，充分混合均匀后，在室温下孵育1h。然后将核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)添加到上述混合物中，淬灭15min，磁场作用分离后，取上清进行荧光测定，考察特异性。
如图4和图5所示，结果显示该生物传感器对血清中miRNA具有高度特异性和良好的线性。
实施例32
通过实施例2所制备的生物传感器检测了12例胶质瘤患者术前/术后血清和12例健康受试者血清。
如图6所示，结果胶质瘤患者术前血清中miRNA-182的平均浓度均显着高于健康人。术后1周，数值明显下降至接近正常水平。
实施例33
将H1(终浓度50nM)和H2(终浓度50nM)与miRNA-182加入到PBS中，充分混合均匀后，在室温下温育1h。然后将实施例2所制备的核壳型MCOF纳米球溶液(终浓度0.2mg/ml)添加到上述混合物中，淬灭15min，磁场作用分离后，以毛细管取上清，通过激光扫描共聚焦显微镜观察不同miRNA浓度下毛细管芯片生物传感器系统的反馈，结果显示毛细管中的红色荧光随着miRNA浓度的增加而逐渐增强。这种特殊而灵敏的生物传感性能与上述荧光光谱测量结果非常吻合，如图7所示。
实施例34
通过热重分析表征MCOF材料的热稳定性，通过施加磁场作用观察MCOF材料的磁分离能力，结果显示MCOF材料具有良好的热稳定性和磁分离能力，如图8和图9所示。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种高灵敏即时检测miRNA的分析方法