基于dna球状纳米结构成像的靶标定位与定量检测方法
阅读说明：本技术 基于dna球状纳米结构成像的靶标定位与定量检测方法 (Target positioning and quantitative detection method based on DNA spherical nanostructure imaging ) 是由 邹秉杰 王琛 宋沁馨 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于DNA球状纳米结构成像的靶标定位与定量检测方法,对靶标的定量检测方法涉及信号放大检测,尤其是样本中低丰度靶标的高灵敏度检测；对靶标的多重检测多重数突破了一般荧光显微镜只能同时检测3～5个靶标的限制。该方法的关键内容涉及将靶标特异性检测物如抗体与单链寡核苷酸标签相连,然后利用DNA环介导的滚环扩增放大单链寡核苷酸标签,扩增放大后的核酸能够在分子内杂交的作用下自发形成球状DNA纳米结构；通过设计成环探针序列,使滚环扩增产物形成的球状DNA纳米结构能与荧光标记特异性核酸探针杂交,使其在荧光显微镜下呈现出亮点,通过对该亮点的定位并且计数,实现对待测靶标的定位与数字化定量检测。(The invention discloses a target positioning and quantitative detection method based on DNA spherical nanostructure imaging, which relates to signal amplification detection, in particular to high-sensitivity detection of low-abundance targets in samples; the multiple detection of the targets breaks through the limitation that a common fluorescence microscope can only detect 3-5 targets at the same time. The key content of the method relates to connecting a target specificity detector such as an antibody with a single-chain oligonucleotide label, then amplifying the single-chain oligonucleotide label by using DNA loop-mediated rolling circle amplification, wherein amplified nucleic acid can spontaneously form a spherical DNA nano structure under the action of intramolecular hybridization; by designing a ring probe sequence, a spherical DNA nano structure formed by rolling circle amplification products can be hybridized with a fluorescence labeling specificity nucleic acid probe, so that the fluorescent probe presents a bright spot under a fluorescence microscope, and the positioning and digital quantitative detection of a target to be detected are realized by positioning and counting the bright spot.)
技术领域
本发明属于定位与量化检测领域，具体涉及基于DNA球状纳米结构成像的细胞与组织中多靶标定位与定量检测方法。
背景技术
蛋白质(Protein)等生物分子是人体一切细胞、组织的重要组成物质，是执行人体生理功能的重要参与者，越来越多的研究表明疾病的发生、发展与组织细胞中一些蛋白质等生物分子的变化密切相关，因此阐明组织细胞等样本中蛋白质等生物分子的种类及含量变化对深入了解疾病的发生发展十分重要。
值得注意的是，细胞合成后的蛋白质等生物分子需要运送至特定的亚细胞位置才能发挥其功能作用，许多研究表明准确解析人类细胞中生物物质组的亚细胞空间分布可以极大地增进我们对疾病的了解。
因此，对组织、细胞等样本进行蛋白质等生物分子分析需要同时满足种类定性、定量、定位的要求，即需要判断靶标的种类、靶标含量、亚细胞分布位置等信息。原位成像技术是满足以上所有条件的生物分子原位分析理想工具，其中最常用的原位成像技术为免疫荧光染色，可以通过检测过程中荧光的颜色、位置、强度分别对生物分子进行定性、定量、定位分析。该检测过程主要依赖荧光染料和荧光显微镜完成，然而，不同荧光染料之间激发光或发射光存在光谱重叠的问题，限制了荧光显微镜可同时利用的荧光检测通道个数，也从而限制了免疫荧光染色方法可同时检测分析的靶标个数，以致该方法一般难以对5种以上的蛋白同时进行检测(如果使用昂贵复杂的仪器则可达到7到9种)。机体细胞在发挥功能作用时是多种生物分子同时作用的，因此，亟待开发原位多重检测的手段。此外，免疫荧光方法没有信号放大或基于二抗法的有限信号放大，所以其检测灵敏度还不够高，不能对低丰度稀有靶标进行有效检测。再加上对生物样本进行荧光检测时，样本会存在自发荧光和光散射的问题，致使利用荧光强度定量的免疫荧光方法在低丰度靶标表征时进一步受限。
因此，需要进行原位信号放大以改善信号、检测通量和灵敏度。此外，为了避免自发荧光及光散射的影响，在对低丰度稀少靶标检测时应当使用一种能够不依赖荧光强度定量的量化分析方法。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种用于检测待分析样本的方法，该方法是通过将分析样本中潜在的待分析靶标结合到靶标特异性结合耦合物，并且通过重复地结合、成像检测并且任选地去除荧光标记探针(例如：通过使用电泳)，按照一定的分析顺序确定此类靶标特异性结合耦合物的存在，该方法是基于DNA球状纳米结构成像的靶标定位与定量检测方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了所述检测方法通过将待测样本与不同靶标特异性结合耦合物直接或间接结合得到不同的寡核酸标签，在不同寡核酸标签介导的滚环复制作用下，形成不同靶标特异性的DNA纳米球，不同靶标特异性的DNA纳米球与特异性荧光标记探针结合后，通过不同颜色，以及不同轮次成像的结果，实现定位和定量检测待测样本中的待测靶标。
其中，所述不同靶标特异性的DNA纳米球的制备过程如下：将不同的寡核苷酸标签介导不同的与之对应的特异性单链DNA分子成环反应与滚环复制，所述寡核苷酸标签每经过一次以所述单链DNA分子为模板的滚环复制，就会在其核酸序列的3’末端增加一段与所述单链DNA分子序列完全互补的单链DNA序列单元，最终经过多次的所述滚环复制，所述寡核苷酸标签会形成一条具有多个重复DNA序列单元的长单链DNA，该长单链DNA会自发形成DNA纳米球。
其中，所述靶标特异性结合耦合物包含一种靶标的特异性结合分子和一种寡核苷酸标签片段，所述靶标特异性结合分子与靶标直接或间接地相互作用，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合耦合物标记的寡核苷酸标签序列不同；在促进靶标的特异性结合分子与所述分析样本中靶标相互结合的条件下，孵育靶标的特异性结合耦合物和分析样本，任选地去除未结合的靶标的特异性结合耦合物。
其中，所述靶标特异性结合耦合物中的寡核苷酸标签片段与一种或多种特异性单链DNA分子接触，所述特异性单链DNA分子两端各包含一段与寡核苷酸标签片段序列互补的部分，并且所述特异性单链DNA分子还至少包含两段与特异性荧光标记探针相同的序列。
其中，所述检测方法还包括通过外加电场或缓冲溶液从DNA纳米球状结构中除去结合的荧光标记探针。
其中，所述分析样本为细胞、冷冻组织或石蜡包埋组织中的一种或多种；所述靶标为核酸、蛋白质、多肽或蛋白多糖中的一种或多种；所述靶标的特异性结合耦合物是非共价或共价偶联或连接到寡核苷酸标签的特异性结合分子。
其中，所述特异性结合分子为抗体、抗体片段、适体、寡核苷酸或小分子，所述寡核苷酸标签片段包含一段与靶标对应的核酸序列，其能与序列匹配的单链DNA分子杂交，并作为引物在合适的延伸条件下沿着杂交的环状DNA模板延伸。
其中，所述特异性单链DNA分子是与所述寡核苷酸标签杂交后能在连接酶作用下连接成环状DNA的分子或单独合成或工程化的环状DNA分子或单链滚环复制产物。
其中，所述外加电场为电泳，所述缓冲溶液为含表面活性剂Triton X-100或Tween20的磷酸缓冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液。
基于DNA球状纳米结构成像的靶标定位与定量检测方法，具体包括以下步骤：
1)使一种或多种靶标的特异性结合耦合物与分析样本接触，其中每种靶标的特异性结合耦合物包含一种靶标的特异性结合分子和一种寡核苷酸标签片段，所述靶标特异性结合分子与靶标直接或间接地相互作用，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合耦合物标记的寡核苷酸标签序列不同；在促进靶标的特异性结合分子与所述分析样本中靶标相互结合的条件下，孵育靶标的特异性结合耦合物和分析样本，任选地去除未结合的靶标的特异性结合耦合物；
2)在步骤1)之前、同时或之后，使所述靶标的特异性结合耦合物中的寡核苷酸标签片段与一种或多种特异性单链DNA分子接触，所述特异性单链DNA分子两端各包含一段与寡核苷酸标签片段序列互补的部分，并且所述特异性单链DNA分子还至少包含两段与特异性荧光标记探针相同的序列；在促进寡核苷酸标签片段与其特异性的单链DNA分子杂交的条件下，孵育所述的寡核苷酸标签片段特异性的单链DNA分子和靶标特异性结合耦合物，任选地去除未结合的单链DNA分子；
3)在步骤2)之后，在促进所述与寡核苷酸标签片段杂交的特异性单链DNA分子连接成环的条件下，使特异性单链DNA分子连接成环；
4)在步骤3)之后，在促进所述寡核苷酸标签片段以所述连接成环的单链DNA分子为模板进行滚环复制的条件下，使寡核苷酸标签片段延伸形成具有重复DNA序列的长链DNA片段，该长链DNA片段可自发形成DNA纳米球状结构；
5)在步骤4)之后，使该分析样本与所述特异性荧光标记探针接触，通过序列互补杂交，以产生稳定结合到所述DNA纳米球状结构的荧光标记探针，任选地去除未结合的荧光标记探针；
6)在步骤5)之后，将该分析样本成像以检测稳定结合有所述荧光标记探针的DNA纳米球的位置和数目，其中检测到荧光的DNA纳米球表明相应靶标的存在；
7)通过外加电场或缓冲溶液从DNA纳米球状结构中除去结合的荧光标记探针；
8)其中去除荧光标记探针的分析样本重复步骤5)、6)、7)，每次使用一种或多种DNA纳米球特异性的荧光标记探针结合不同靶标特异性的DNA纳米球，通过经荧光标记探针的不同颜色，以及不同轮次成像的结果，区分不同的靶标特异性DNA纳米球，从而检测多种待测靶标。
其中，步骤1)中所述的分析样本为细胞、冷冻组织或石蜡包埋组织中的一种或多种；所述靶标为核酸、蛋白质、多肽或蛋白多糖中的一种或多种；所述靶标的特异性结合耦合物是非共价或共价偶联或连接到寡核苷酸标签的特异性结合分子。
其中，步骤1)中所述特异性结合分子为抗体、抗体片段、适体、寡核苷酸或小分子，所述寡核苷酸标签片段包含一段与靶标对应的核酸序列，其能与序列匹配的单链DNA分子杂交，并作为引物在合适的延伸条件下沿杂交的环状DNA模板延伸。
其中，步骤1)中所述特异性单链DNA分子是与所述寡核苷酸标签杂交后能在连接酶作用下连接成环状DNA的分子或单独合成或工程化的环状DNA分子或单链滚环复制产物。
其中，其中步骤1)中每种靶标特异性结合耦合物和每种寡核苷酸标签均不相同，不同的靶标特异性结合耦合物的寡核苷酸标签序列不同，不同的寡核苷酸标签介导不同的与之对应的特异性单链DNA分子(可以作为对应寡核苷酸标签复制延伸的模板分子)成环反应与滚环复制，所述寡核苷酸标签每经过一次以所述单链DNA分子为模板的滚环复制，就会在其核酸序列的3’末端增加一段与所述单链DNA分子序列完全互补的单链DNA序列单元，最终经过多次的所述滚环复制，所述寡核苷酸标签会形成一条具有多个重复DNA序列单元的长单链DNA，该长单链DNA会在分子内杂交的作用下自发卷曲，皱缩形成尺寸在数百纳米的DNA纳米球。
其中，所述DNA纳米球通过靶标特异性结合耦合物上的寡核苷酸标签与靶标相连，其中每一个靶标特异性结合耦合物与一个靶标结合，每一个具有重复DNA序列的纳米球对应一个靶标分子，其中在不同的分析样品中通过DNA纳米球产生的数目和位置指示分析的靶标的数目和位置。
其中，所述DNA纳米球产生的数目和位置是通过将所述DNA纳米球与对应互补的荧光标记探针杂交使各纳米球在特定激发光下能发出特定荧光，并且利用荧光显微镜或荧光扫描仪器进行分析的；多靶标对应的多种DNA纳米球结构采用与特定序列DNA纳米球互补杂交的不同激发与发射波长的荧光标记探针来进行区分，并进行多轮次杂交成像实现更多靶标对应的DNA纳米球状结构的分析。
其中，在步骤1)、2)、5)或7)中通过使用外加电场或缓冲溶液任选地去除未结合的靶标特异性结合耦合物、未结合的寡核苷酸标签特异性的单链DNA分子、未结合的荧光标记探针和结合的荧光标记探针，所述外加电场为电泳，所述缓冲溶液为含表面活性剂TritonX-100或Tween 20的磷酸缓冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液。
其中，步骤3)中通过使用具有DNA连接活性的酶使特异性单链DNA分子连接成环；步骤4)中使用具有链置换活性的DNA聚合酶使寡核苷酸标签延伸形成具有重复序列的DNA纳米球状结构。
本发明提供了用于快速多重检测、定位并且量化感兴趣靶标(例如：蛋白质)，尤其是对低丰度靶标进行数字化定量的方法。在此提供的方法中的一些包括(1)使一个有待分析的样本(例如：可能含一个或多个有待分析靶标的样品)与特异性结合这些靶标的耦合物接触(给定靶标特异性结合的耦合物，包含靶标特异性结合部分和靶标特异性寡核苷酸标签，在这里，寡核苷酸标签可作为下游滚环复制引物)，任选地去除多余未结合的耦合物(例如：通过使用含表面活性剂Triton X-100、Tween20等的磷酸缓冲盐溶液以及磷酸缓冲盐溶液)，(2)使一种或多种寡核苷酸标签特异性的单链DNA分子与已经结合靶标的靶标特异性结合耦合物接触，这些单链DNA分子互补于并且因此特异于其中一种寡核苷酸标签的核苷酸序列，任选地去除未结合的寡核苷酸标签特异性的单链DNA分子(例如：通过使用电泳，将分析样本放置在电泳槽内的电泳缓冲液中，在外加电场的作用力下去除非特异性结合单链DNA分子)，(3)在促进所述连接至寡核苷酸标签的特异性单链DNA分子连接成环的条件下，使特异性单链DNA分子连接成环(例如：通过使用T4 DNA连接酶)，(4)在促进所述寡核苷酸标签以连接成环的单链DNA分子为模板进行复制的条件下，使寡核苷酸标签延伸形成具有重复DNA序列的纳米球(例如：通过使用phi29 DNA聚合酶，复制反应时间优选70-100分钟，更优选50-70分钟)，(5)使该分析样本与具有互补于DNA纳米球的核苷酸序列的荧光标记探针接触，以产生稳定结合到所述DNA纳米球的荧光标记探针，并通过外加电场去除非特异性结合的荧光标记探针(例如：通过使用电泳，将分析样本放置在电泳槽内的电泳缓冲液中，在外加电场的作用力下去除样本中非特异性结合的荧光标记探针)，(6)将该分析样本成像以检测稳定结合有所述荧光标记探针的DNA纳米球的位置和数目。其中检测到稳定结合有所述荧光标记探针的DNA纳米球表明相应的靶标的存在，(7)通过外加电场从DNA纳米球除去特异性结合的荧光标记探针(例如：通过使用电泳，将分析样本放置在电泳槽内的电泳缓冲液中，在外加电场的作用力下去除特异性结合在DNA纳米球的荧光标记探针)，(8)去除荧光标记探针的分析样本可以重复步骤(5)、(6)、(7)，每次使用一种或多种DNA纳米球特异性的荧光标记探针结合不同靶标特异性的DNA纳米球，通过荧光标记探针不同颜色的成像区分不同的靶标特异性DNA纳米球，最终完成突破荧光显微镜检测通道数的多重靶标检测。
该DNA纳米球通过靶标特异性结合耦合物上的寡核苷酸标签与靶标相连，其中每一个靶标特异性结合耦合物与一个靶标结合。因此，每一个DNA纳米球对应一个靶标分子。其中在不同的分析样品中通过纳米球产生的数目和位置指示分析的靶标的数目和位置。也因此，通过对单个DNA纳米球的成像及计数来判断单个靶标分子的位置信息并进行数字化定量分析。
具有不同序列的荧光标记探针可以是相同的标记，包括被相同的荧光团标记。这种方法只需要单一激发波长和检测器。在其它实施例中，具有不同序列的荧光标记探针可以是不同的标记。这种方法可以利用多种激发波长和多通道检测器的荧光显微镜。
应当理解，在分析样本之前，其靶标是已知的、怀疑的、未知的或不被怀疑的。靶标特异性结合耦合物能否结合在分析样本上，取决于待分析样本中是否存在给定靶标(例如：当给定靶标存在于待分析样本上，则靶标特异性结合耦合物能够与待分析样本结合)。“结合在分析样本上”是指靶标特异性结合耦合物结合在其对应靶标上。
靶标特异性结合耦合物上的特异性结合分子可以是一种抗体或抗体片段。当该特异性结合分子是一种抗体或抗体片段时，寡核苷酸标签可以偶联到其恒定区域。
寡核苷酸标签可以通过一个中间接头连接至特异性结合分子。在一些实施例中，一个中间接头包含链霉亲和素和/或生物素。
在一些实施例中，荧光标记探针的核酸可以标记的荧光团是一个、多个或更多个。
该分析样本可以是细胞或者来自细胞的裂解物。该靶标可以是蛋白质或者多肽。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明的方法可以检测、定位并且量化待分析样本中的一个或多个靶标。滚环复制的DNA纳米球与荧光标记探针杂交后在常规荧光显微镜下能够形成与背景明显区分的分散亮点，特别适合检测低丰度靶标，尤其是对靶标进行单分子成像式的检测。此外，无论靶标的位置如何，包括不同靶标间的相互位置如何接近，本方法都可以通过不同荧光标记探针加以区别，也因此靶标间的空间距离可以小于成像系统的分辨距离。因此，这种检测方式不依赖高分辨显微镜进行成像定位分析。用这种方法可以对多种靶标进行表征，并在原位形成靶标特异性的DNA纳米球，通过每轮次对其中一种或几种(不大于显微镜检测器检测通道数)靶标特异性DNA纳米球进行基于荧光标记探针的检测分析，然后通过外加电场去除荧光标记探针并进行下一轮其它靶标特异性DNA纳米球的检测分析。最终通过多轮的成像分析能够实现对更多种靶标的检测。因此，这种方法突破了显微镜成像系统的检测多重数的限制。
附图说明
图1为本发明方法用于待测样本(如生物样本)中多种靶标(如蛋白质)检测的原理示意图。
图2为基于外加电场的高通量和本质上可高度多重成像检测的原理示意图。
图3为本发明提供的一种寡核苷酸标签及对应用于形成环状模板的单链DNA分子(图中Padlock分子)设计原理的示意图。
图4为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)蛋白质检测结果。
图5为用于靶标检测的信号放大效率考察结果。
图6为经过上皮间质转化过程的人乳腺癌细胞系MCF-7中表达的上皮细胞粘附分子(Epithelial cellular adhesion molecule)蛋白质检测结果。
具体实施方式
本发明特别提供了例如基于核酸的原位滚环扩增及经标记探针的细胞原位环境中一个或多个靶标单分子成像或高通量、快速多重成像的方法。此方法涉及分析一个或多个特定样本(例如：生物样本)中的一种或多种靶标(例如：蛋白质)。在一些情况下，靶标是否存在样本中是未知的，一个样本可能含有一个或多个给定的待分析靶标。因此，本发明的方法可以用于确定一个或多个给定的靶标是否存在特定样本中。
因此，本发明提供了一种基于核酸的原位滚环扩增和经标记探针的靶标单分子成像或高通量、快速多重成像的方法。此方法依赖于采用一种正交DNA标签，这些标签可以稳定地结合在靶标特异性结合分子上(例如：抗体)，然后通过添加与这些DNA标签互补的核酸而形成稳定的部分双链杂交结构，并发生成环反应和后续原位滚环复制反应，继而形成具有重复DNA序列的DNA纳米球。该DNA纳米球通过靶标特异性结合耦合物上的寡核苷酸标签与靶标相连，其中每一个靶标特异性结合耦合物与一个靶标结合。因此，每一个DNA纳米球对应一个靶标分子。然后将样本进行成像，这种方法就实现了对靶标进行单分子成像(参见图1)。
此外，在一个实施例中，这些方法通过同时进行多种靶标特异性结合耦合物(例如：连接有DNA标签的抗体)与多种靶标的接触，最终能够同时形成多种靶标特异性的DNA纳米球。在靶标特异性的荧光标记探针与一种靶标的DNA纳米球杂交并成像后，进行荧光标记探针的去除(例如：外加电场)以便消除来自荧光标记探针的荧光。随后重复荧光标记探针的杂交和成像过程，以便进行另一种或多种DNA纳米球的成像，从而实现多重靶标的成像(参见图2)。
对于本发明披露的快速多重检测，不会受到传统成像方法中有限检测通道数或光谱重叠的限制。正交DNA标签设计容易，此方法可以通过重复步骤地多轮成像实现理论上的无限个靶标的检测与分析。
这些方法具有在例如医疗诊断(例如：肿瘤细胞恶性程度及肿瘤分型检测、循环肿瘤细胞的检测与表征)中的适用性。
在此披露的方法还可以用于分析一个或多个靶标，并通过靶标特异性的DNA纳米球的形成对靶标进行绝对定量和原位成像；或者对同一个样本或不同样本中靶标之间的相对含量进行分析。
在本发明中，术语“靶标”是希望观察或量化分析的并且存在能与其特异性结合耦合物的任何生物成分。在一些实施例中，靶标可以是工程化的或非天然存在的生物分子。此“生物分子”是由一种活体生物产生的任何分子，包括大分子，诸如蛋白质、蛋白多糖、脂质及核酸，以及小分子，诸如代谢产物以及天然产物。生物分子的实例包括但不限于：DNA、RNA、cDNA、或经受逆转录的RNA的DNA产物。
在一些实施例中，一种靶标可以是一种蛋白质靶标，例如，一种细胞环境的蛋白质(例如：细胞质蛋白、细胞膜蛋白或细胞核蛋白)。蛋白质的实例包括但不限于：纤维状蛋白质，诸如细胞支架蛋白质(例如，肌动蛋白、arp2/3、冠蛋白、肌养蛋白、FtsZ、角蛋白、肌球蛋白、伴肌动蛋白、血影蛋白、tau蛋白、肌联蛋白、原肌球蛋白、微管蛋白以及胶原质)，以及细胞外基质蛋白(例如，胶原质、弹性蛋白、底板反应蛋白、皮卡丘素、以及纤连蛋白)；球状蛋白质，诸如血浆蛋白质(例如，血清淀粉样蛋白P成分和血清白蛋白)、凝血因子(例如，补体蛋白质、C1-抑制剂以及C3-转化酶、因子VIII、因子XIII、纤维蛋白、蛋白质C、蛋白质S、蛋白质Z、蛋白质Z相关蛋白酶抑制剂、凝血酶、血管假性血友病因子)，以及急性期蛋白质，诸如C反应蛋白质；血红素蛋白；细胞粘附蛋白(例如，钙粘蛋白、室管膜蛋白、整合蛋白、Ncam以及选择蛋白)；跨膜运输蛋白质(例如，CFTR、血型糖蛋白D和混杂酶)，诸如离子通道(例如，配体门控离子通道，诸如烟碱型乙酰胆碱受体和GABAa受体，以及电压门控离子通道，诸如钾、钙和钠通道)，同向运输/反向运输蛋白质(例如，葡萄糖转运蛋白)；激素和生长因子(例如，表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肽类激素(诸如胰岛素、胰岛素样生长因子以及催产素)以及类固醇激素(诸如雄激素、雌激素和黄体酮)；受体，诸如跨膜受体(例如，G蛋白偶联受体、视紫红)和细胞内受体(例如，雌激素受体)；DNA结合蛋白质(例如，组蛋白、鱼精蛋白、CI蛋白)；转录调节物(例如，c-myc、FOXP2、FOXP3、MyoD以及P53)；免疫系统蛋白质(例如，免疫球蛋白、主要组织相容性抗原以及T细胞受体)；营养物储存/转运蛋白质(例如，铁蛋白)；以及酶。
实施例1
(1)实验材料及试剂：
MDA-MB-231细胞系购自上海ATCC细胞库；细胞培养级磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液，不含氯化钙、氯化镁，1×PBS pH 7.4)购自美国DMEM培养基(含青霉素-链霉素双抗)购自凯基生物；胰蛋白酶(Trypsin)购自美国无菌胎牛血清(FBS)购自阿根廷Natocor-Industria牛血清白蛋白(bovine serum albu分钟，BSA)购自美国Amresco公司；Glass Bottom Cell Culture Dish细胞培养皿购自无锡耐思生物科技有限公司；生物素、甲酰胺、二甲基亚砜(DMSO)及聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-100)购自美国Sigma-Aldrich公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自武汉博士德(Boster)公司；所有寡核苷酸探针、生物素化寡核苷酸探针、磷酸化寡核苷酸探针、荧光基团修饰寡核苷酸探针均由上海生工生物有限公司合成制备，纯化级别为HPLC级；dNTPs购自北京赛百盛生物科技有限公司；鲑鱼精DNA溶液(Salmon Sperm DNA Solution)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Human TGF-betal因子购自Peprotech公司；生物素化抗体Anti-EpCAM(Biotin)、Anti-GAPDH(Biotin)购自Abcam公司；T4 DNA ligase连接酶、phi29 DNA polymerase聚合酶购自New England Biolabs公司；氯化铵、氢氧化钠购自国药集团化学试剂有限公司；实验用去离子水(出水测量值18.2MΩ)来自净水仪器Explorer series Water Purificationsystem，购自美国Blue细胞级实验用水来自经高压灭菌的分析级实验用水；其它分子生物学实验用水购自屈臣氏蒸馏水；其它试剂均为分析纯；荧光显微镜为Nikon ECLIPSENi显微镜，购自日本尼康公司。
寡核苷酸标签1：Biotin-AAAAA AAAAA AAAAA GAGAG CGACA CTATG AGACA GGTGATCCCA TCCTG AGC
寡核苷酸标签2：Biotin-AAAAA AAAAA AAAAA CCTGA GACAT CATAA TAGCG GACGATCATC CAGCA CTAG
单链DNA分子(Padlock分子)1：PO4-GTCTC ATAGT GTCGC TCTCT GA TTC GCGCCGAGGT TGTCT CAGCT TTAGT TTAAT ACGCG CCGAG GTAGG GCTCA GGATG GGATC ACCT
单链DNA分子(Padlock分子)2：PO4-GCTAT TATGA TGTCT CAGGT AGATG GACGCGGAGT TGTCT CAGCT TTAGT TTAAT AGGAC GCGGA GTACC TAGTG CTGGA TGATC GTCC
单链DNA分子(Padlock分子)3：Alexa Fluor 488-GTCTC ATAGT GTCGC TCTCT GATTC GCGCC GAGGT TGTCT CAGCT TTAGT TTAAT ACGCG CCGAG GTAGG GCTCA GGATG GGATCACCT
荧光探针1：Alexa Fluor 488-CGCGC CGAGG T
荧光探针2：Cy5-GGACG CGGAG T
(2)细胞培养实验步骤、内容及条件：
MDA-MB-231细胞系使用含10％FBS和50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素双抗混合溶液的DMEM培养基培养。细胞培养条件为：95％相对湿度，5％二氧化碳气体，37℃。当细胞生长到约90％融合度时开始传代，为保证细胞生长处于对数生长期，需要控制细胞接种密度，以细胞传代周期为2～3天为宜。传代时，使用0.25％胰酶-EDTA在37℃下对贴壁细胞进行消化，当细胞呈现流沙状脱落时，立即使用含10％FBS的培养基终止消化。重悬后的细胞悬液经血球计数板计数后，按细胞大小及生长速度取合适密度的细胞接种于细胞培养瓶或培养皿内继续培养。
(3)寡核苷酸标签标记抗体修饰实验步骤、内容及条件：
取25μL体积的2.5μM寡核苷酸标签1或2，与25μL体积的2.5μM链霉亲和素充分混合，在37℃下恒温孵育30分钟。然后，在反应混合液中加入50μL的1.25μM生物素化抗体Anti-GAPDH(Biotin)(对应寡核苷酸标签1)或生物素化抗体Anti-EpCAM(Biotin)(对应寡核苷酸标签2)，充分混匀，在25℃下恒温孵育30分钟。最后加入1mM生物素，25℃下恒温孵育20分钟。该过程中的反应稀释液为Assay Buffer(8mM Na2HPO4，2mM NaH2PO4，150mM NaCl，0.1％BSA，0.025％Tween 20，pH 7.4)。最终用于样本检测的寡核苷酸标签标记抗体浓度以未修饰的生物素化抗体的当量浓度计算，为0.5～2.5μg/100μL范围。寡核苷酸标签标记抗体稀释溶液为含有鲑鱼精DNA的Assay Buffer(8mM Na2HPO4，2mM NaH2PO4，150mM NaCl，0.1％BSA，0.025％Tween 20，pH 7.4，0.5mg/mL鲑鱼精DNA)。
实施例2寡核苷酸标签及对应用于形成环状模板的单链DNA分子设计
参见图3，在该实施例中，具体实验材料及试剂参见实施例1，寡核苷酸标签1的5’端进行了生物素化修饰，以使该标签与靶标特异性结合分子之间通过生物素-链霉亲和素系统进行桥连。单链DNA分子(Padlock分子1)包含与核酸标签互补部分，以形成环状模板，还包含用于荧光标记探针1杂交序列生成的模板序列，因此只有当寡核苷酸标签1发生了扩增反应，才能产生与荧光标记探针1互补杂交的序列，也因此保证了荧光信号的特异性。
实施例3甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)蛋白质检测
参见图4，在该实施例中，具体实验材料及试剂，细胞培养实验步骤、内容及条件，寡核苷酸标签标记抗体修饰实验步骤、内容及条件参见实施例1，将经过4％多聚甲醛固定处理后的MDA-MB-231细胞样本与靶标特异性结合耦合物接触，以使其稳定特异性结合在样本上，在靶标特异性结合耦合物上核酸标签介导的滚环复制作用下，形成靶标特异性的DNA纳米球，并能够与特异性的荧光标记探针杂交形成杂交体，在荧光显微镜下形成与背景明显区分的荧光亮点。
靶标检测实验步骤、内容及条件：玻底培养皿中的MDA-MB-231细胞生长至50％～60％，1×PBS充分润洗3次，除去血清、培养基成份与细胞分泌物，4％多聚甲醛溶液常温孵育45分钟，然后在100mM NH4Cl的1×PBS溶液中淬灭反应20分钟，1×PBS清洗5分钟，将细胞在0.1％Triton X-100的1×PBS中透化10分钟，1×PBS溶液润洗三次，然后在5％BSA溶液中封闭2小时，然后37℃下摇晃孵育在0.05mg/mL RNase A中，1×PBS润洗三次，加入0.1mg/mL链霉亲和素(含0.5mg/mL Salmon Sperm DNA)37℃下摇晃孵育30分钟，弃去溶液，加入1mM生物素37℃下摇晃孵育30分钟，并用1×PBS润洗3次。将样品与Assay Buffer稀释后的寡核苷酸标签1标记抗体Anti-GAPDH(Biotin)(含0.5mg/mL Salmon Sperm DNA，其中Anti-GAPDH(Biotin)抗体当量浓度为0.5～2.5μg/100uL)于4℃下过夜摇晃孵育，第二天用含0.1％Triton X-100和2％BSA的1×PBS洗涤3次，每次持续10分钟。然后将样品用1×PBS洗涤两次，每次5分钟，蒸馏水润洗一次。
将样品与100nM单链DNA分子(Padlock分子1)(稀释在含2×SSC，20％甲酰胺，0.5mg/mL Salmon Sperm DNA的溶液中)，于37℃下摇晃孵育15～30分钟，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次，吸去所有液体后立即加入T4连接酶体系(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，0.1U/μL T4 DNA ligase，pH 7.5)，l×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次，吸去所有液体后立即加入phi29聚合酶体系(0.5mM dNTPs，0.25U/μL phi29 DNApolymerase，0.2mg/mL BSA，50mM Tris-HCl，l0mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mM DTT，pH7.5)，于37℃下摇晃孵育60分钟，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次。加入0.5μM靶标特异性荧光探针1(稀释在含2×SSC，20％甲酰胺，0.5mg/mL Salmon Sperm DNA的溶液中)，于37℃下摇晃孵育20～30分钟。用含0.1％Triton X-100的1×PBS清洗10分钟，然后1×PBS洗涤两次，每次5分钟。1μg/μL DAPI染色5分钟，然后1×PBS洗涤5分钟。然后通过荧光显微镜进行成像。
实验结果参见图4，左侧图为MDA-MB-231细胞样本中检测到的蛋白质靶标甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的信号，结果显示靶标信号呈现出与背景明显区分的一个个荧光亮点，表明这是由寡核苷酸标签经过滚环扩增之后形成的DNA纳米球与靶标特异性荧光探针杂交之后呈现的结果。右侧图是细胞核的成像图与左侧图融合之后的图像，增加的中心区域图像为细胞核的成像结果。右侧图结果显示，蛋白质靶标甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的信号主要集中在细胞质中，细胞核区域信号分布较少，这与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)在MDA-MB-231细胞中的实际位置分布一致，这些结果表明该方法具有良好的靶标定位检测准确性。
实施例4用于靶标检测的信号放大效率比较
参见图5，在该实施例中，具体实验材料及试剂，细胞培养实验步骤、内容及条件，寡核苷酸标签标记抗体修饰实验步骤、内容及条件参见实施例1，该实施例检测的是单细胞样本中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)蛋白质，将样本与靶标特异性结合耦合物接触，以使其稳定特异性结合在样本上。然后，(1)将与靶标特异性结合耦合物上核酸标签互补的荧光标记探针与核酸标签杂交，形成杂交体，能够在荧光显微镜下形成没有经过核酸标签扩增放大的靶标特异性信号，(2)在靶标特异性结合耦合物上核酸标签介导的滚环复制作用下，形成靶标特异性的DNA纳米球，并能够与特异性的荧光标记探针杂交形成杂交体，在荧光显微镜下形成与背景明显区分的经过滚环扩增放大的荧光信号。通过相对荧光定量的计算可知，在该实施例中，原位靶标信号放大了至少301倍。
靶标检测实验步骤、内容及条件：玻底培养皿中的MDA-MB-231细胞生长至50％～60％，1×PBS充分润洗3次，除去血清、培养基成份与细胞分泌物，4％多聚甲醛溶液常温孵育45分钟，然后在100mM NH4Cl的1×PBS溶液中淬灭反应20分钟，1×PBS清洗5分钟，将细胞在0.1％Triton X-100的1×PBS中透化10分钟，1×PBS溶液润洗三次，然后在5％BSA溶液中封闭2小时，然后37℃下摇晃孵育在0.05mg/mL RNase A中，1×PBS润洗三次，加入0.1mg/mL链霉亲和素(含0.5mg/mL Salmon Sperm DNA)37℃下摇晃孵育30分钟，弃去溶液，加入1mM生物素37℃下摇晃孵育30分钟，并用1×PBS润洗3次。将样品与Assay Buffer稀释后的寡核苷酸标签1标记抗体Anti-GAPDH(Biotin)(含0.5mg/mL Salmon Sperm DNA，其中Anti-GAPDH(Biotin)抗体当量浓度为0.5～2.5μg/100uL)于4℃下过夜摇晃孵育，第二天用含0.1％Triton X-100和2％BSA的1×PBS洗涤3次，每次持续10分钟。然后将样品用1×PBS洗涤两次，每次5分钟，蒸馏水润洗一次。
然后将样品分为两组，一组样品用于没有经过核酸标签扩增放大的靶标特异性信号检测，即将样品与100nM Alexa Fluor 488荧光基团修饰的单链DNA分子(Padlock分子3)(稀释在含2×SSC，20％甲酰胺，0.5mg/mL Salmon Sperm DNA的溶液中)，于37℃下摇晃孵育20分钟，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次，1μg/μL DAPI染色5分钟，然后1×PBS洗涤5分钟。另一组样品用本发明方法对核酸标签扩增放大，然后检测特异性信号增强效率倍数，即将样品与100nM单链DNA分子(Padlock分子1)(稀释在含2×SSC，20％甲酰胺，0.5mg/mLSalmon Sperm DNA的溶液中)，于37℃下摇晃孵育20分钟，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次，吸去所有液体后立即加入T4连接酶体系(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1mMATP，0.1U/μL T4 DNA ligase，pH 7.5)，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次，吸去所有液体后立即加入phi29聚合酶体系(0.5mM dNTPs，0.25U/μL phi29 DNA polymerase，0.2mg/mLBSA，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mM DTT，pH7.5)，于37℃下摇晃孵育60分钟，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次。加入0.5μM Alexa Fluor 488荧光基团修饰的靶标特异性荧光探针1(稀释在含2×SSC，20％甲酰胺，0.5mg/mL Salmon Sperm DNA的溶液中)，于37℃下摇晃孵育20～30分钟。用含0.1％Triton X-100的1×PBS清洗10分钟，然后1×PBS洗涤两次，每次5分钟。1μg/μL DAPI染色5分钟，然后1×PBS洗涤5分钟。
然后，使用荧光显微镜，在相同条件下对两组样品进行成像分析。
实验结果参见图5，图中较中心区域为细胞核的成像结果，靶标蛋白质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的信号主要集中在细胞核以外的区域。利用公认的图像处理软件Fiji Image J对一组样品(没有经过核酸标签扩增放大)和另一组样品(用本发明方法对核酸标签扩增放大)的成像结果进行靶标信号的量化统计分析，并计算二者信号量化后的倍数。结果表明，使用本发明方法对核酸标签滚环扩增放大后检测到的靶标信号与未放大标签检测到的靶标信号相比，本发明方法将靶标信号强度提高了301倍，也即是本发明方法提高了靶标检测的灵敏度，尤其适合对低丰度靶标的检测。
实施例5检测经过上皮间质转化过程的人乳腺癌细胞系MCF-7中表达的上皮细胞粘附分子(Epithelial cellular adhesion molecule)蛋白质
参见图6，在该实施例中，通过对靶标特异性DNA纳米球的计数，实现对靶标的数字化定量。
样本处理及靶标检测实验步骤、内容及条件：将人乳腺癌细胞系MCF-7培养在玻底培养皿中，待细胞贴壁生长后，在培养基中加入10ng/mL肿瘤转化生长因子TGF-beta 1，每隔30小时换一次培养基并加入10ng/mL肿瘤转化生长因子TGF-beta1，从初次加入TGF-beta1开始计算，培养120小时。
取出含有细胞样品的玻底培养皿，1×PBS充分润洗3次，除去血清、培养基成份与细胞分泌物，4％多聚甲醛溶液常温孵育45分钟，然后在100mM NH4Cl的1×PBS溶液中淬灭反应20分钟，1×PBS清洗5分钟，将细胞在0.1％Triton X-100的l×PBS中透化2分钟，1×PBS溶液润洗三次，然后在5％BSA溶液中封闭2小时，然后37℃下摇晃孵育在0.05mg/mLRNase A中，1×PBS润洗三次，加入0.1mg/mL链霉亲和素(含0.5mg/mL Salmon Sperm DNA)37℃下摇晃孵育30分钟，弃去溶液，加入1mM生物素37℃下摇晃孵育30分钟，并用1×PBS润洗3次。将样品与Assay Buffer稀释后的寡核苷酸标签2标记抗体Anti-EpCAM(Biotin)(含0.5mg/mL Salmon Sperm DNA，其中Anti-EpCAM(Biotin)抗体当量浓度为0.5～2.5μg/100uL)于4℃下过夜摇晃孵育，第二天用含0.1％Triton X-100和2％BSA的1×PBS洗涤3次，每次持续10分钟。然后将样品用1×PBS洗涤两次，每次5分钟，蒸馏水润洗一次。
将样品与100nM单链DNA分子(Padlock分子2)(稀释在含2×SSC，20％甲酰胺，0.5mg/mL Salmon Sperm DNA的溶液中)，于37℃下摇晃孵育15～30分钟，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次，吸去所有液体后立即加入T4连接酶体系(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，0.1U/μL T4 DNA ligase，pH 7.5)，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次，吸去所有液体后立即加入phi29聚合酶体系(0.5mM dNTPs，0.25U/μL phi29 DNApolymerase，0.2mg/mL BSA，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mM DTT，pH7.5)，于37℃下摇晃孵育60分钟，1×PBS润洗三次，蒸馏水润洗一次。加入0.5μM靶标特异性荧光探针2(稀释在含2×SSC，20％甲酰胺，0.5mg/mL Salmon Sperm DNA的溶液中)，于37℃下摇晃孵育20～30分钟。用含0.1％Triton X-100的1×PBS清洗10分钟，然后1×PBS洗涤两次，每次5分钟。1μg/μL DAPI染色5分钟，然后1×PBS洗涤5分钟。然后通过荧光显微镜进行成像。
实验结果参见图6，左侧图是根据细胞在明场中实际的位置进行了圈定，分别圈定了细胞1、细胞2、细胞3，每个细胞区域较中心的位置图像为细胞核的成像，细胞核以外分散的荧光亮点为本发明方法检测到的上皮细胞粘附分子(Epithelial cellular adhesionmolecule)蛋白质的信号。肿瘤转化生长因子TGF-beta 1能够诱导乳腺癌细胞MCF-7经历上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程，随着TGF-beta 1刺激时间的延长，细胞EpCAM表达水平会逐渐降低。表达量降低后的EpCAM蛋白质需要高灵敏度的方法才能有效检测，传统免疫荧光的方法难以检出，因此使用本发明的方法进行检测分析。图中结果显示，尽管EpCAM蛋白质的表达量降低，但是本发明的方法依然能够检测到分散的靶标信号，这些信号呈现出与背景明显区分的荧光亮点，易于识别判断，还能够通过本发明的数字化定量策略对每个细胞中的靶标信号进行计数分析，不涉及分析亮点的荧光亮度强弱，避免了自发荧光背景造成的定量影响，突破了传统方法对荧光强度定量法的依赖。此外，图中结果还表明三个细胞的数字化定量结果有差异，从一定程度反映了肿瘤细胞固有的异质性。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 基于DNA球状纳米结构成像的靶标定位与定量检测方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 寡核苷酸标签1(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaagagag cgacactatg agacaggtga tcccatcctg agc 53
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 寡核苷酸标签2(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaacctga gacatcataa tagcggacga tcatccagca ctag 54
<210> 3
<211> 89
<212> DNA
<213> 单链DNA分子（padlock分子）1(Artificial Sequence)
<400> 3
gtctcatagt gtcgctctct gattcgcgcc gaggttgtct cagctttagt ttaatacgcg 60
ccgaggtagg gctcaggatg ggatcacct 89
<210> 4
<211> 89
<212> DNA
<213> 单链DNA分子（padlock分子）2(Artificial Sequence)
<400> 4
gctattatga tgtctcaggt agatggacgc ggagttgtct cagctttagt ttaataggac 60
gcggagtacc tagtgctgga tgatcgtcc 89
<210> 5
<211> 89
<212> DNA
<213> 单链DNA分子（padlock分子）3(Artificial Sequence)
<400> 5
gtctcatagt gtcgctctct gattcgcgcc gaggttgtct cagctttagt ttaatacgcg 60
ccgaggtagg gctcaggatg ggatcacct 89
<210> 6
<211> 11
<212> DNA
<213> 荧光探针1(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcgccgagg t 11
<210> 7
<211> 11
<212> DNA
<213> 荧光探针2(Artificial Sequence)
<400> 7
ggacgcggag t 11