一种基于金纳米粒子放大qcm信号检测5-羟甲基糠醛的方法
阅读说明：本技术 一种基于金纳米粒子放大qcm信号检测5-羟甲基糠醛的方法 (Method for detecting 5-hydroxymethylfurfural based on gold nanoparticle amplification QCM signal ) 是由 卫伟 刘梦珂 李鹏 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于金纳米粒子放大QCM信号检测5-羟甲基糠醛的方法,该方法将单链DNA(ssDNA)功能化的金纳米粒子用于石英晶体微天平(QCM)中检测5-羟甲基糠醛(HMF),利用HMF分子结构中的醛基和ESΙΙ链上醛基相互竞争来阻止DNAzyme的形成,进而影响对金纳米粒子功能化的ssDNA的切割,从而影响与石英晶体微天平中金片上捕获探针DNA(capture DNA)的杂交,使QCM实时频移发生变化,以放大石英晶体微天平QCM的信号,因此可利用QCM检测HMF。本发明无需贵重仪器,操作简单,无标记,灵敏度高。(The invention discloses a method for detecting 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) based on amplification QCM signals of gold nanoparticles, which comprises the steps of using gold nanoparticles with single-chain DNA (ssDNA) functionalization in a Quartz Crystal Microbalance (QCM) to detect 5-Hydroxymethylfurfural (HMF), preventing the formation of DNAzyme by utilizing mutual competition between aldehyde groups in an HMF molecular structure and aldehyde groups on an ES I chain, further influencing the cutting of the gold nanoparticles with the functionalized ssDNA, further influencing the hybridization with capture probe DNA (capture DNA) on a quartz crystal microbalance, changing the real-time frequency shift of the QCM, amplifying the QCM signals, and detecting the HMF by utilizing the QCM. The invention does not need expensive instruments, has simple operation, no mark and high sensitivity.)
技术领域
本发明涉及一种基于金纳米粒子放大QCM信号检测5-羟甲基糠醛的方法，属于生物传感技术领域。
背景技术
5-羟甲基糠醛(HMF)是一种食品中的污染物，主要是由氨基酸和还原糖通过焦糖化反应和美拉德反应所产生的。它主要存在于含糖量较高的物质中，如饼干、咖啡、蜂蜜等。它潜在的毒性逐渐引起了研究者的关注。
目前，5-羟甲基糠醛的常规检测方法有高效液相色谱(HPLC)，液相色谱-质谱联用(LC-MS),气相色谱-质谱联用(GC-MS)。这些方法中的大多数具有耗时且操作复杂的缺点。
QCM是一种实时在线的质量传感平台，其能够检测到晶体表面纳克级别的质量变化，在生化分析方面已经存在广泛的应用。但由于生物分子的质量太小不足以引起频率发生明显的变化，所以需要发展信号放大技术来提高其灵敏度。
目前尚未见有报道将QCM用于5-羟甲基糠醛的检测，急需开发出一种可以将QCM信号放大来检测5-羟甲基糠醛的方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种基于金纳米粒子放大QCM信号检测5-羟甲基糠醛的方法。
技术方案：本发明所述一种基于金纳米粒子放大QCM信号检测5-羟甲基糠醛的方法，所述方法为将ssDNA功能化的金纳米粒子用于QCM传感器中检测5-羟甲基糠醛含量，所述ssDNA序列为SH-(CH2)6TTTTTTTTTTCCACCATCACCAACTAT(A)rGGAAGAGATGTTTGGTGG(参见序列表SEQ ID NO：1)。
进一步地，所述ssDNA功能化金纳米粒子的制备包括如下步骤：将过量的二水合双(对磺酰苯基)苯基膦二钾盐(BSPP)加入到金纳米粒子溶液中，孵育过夜，得到BSPP保护的金纳米粒子溶液，加入ssDNA，避光反应，再加入PEG-800反应，离心分离，清洗，将沉淀复溶于Tris-NaCl缓冲溶液中得到AuNPs-ssDNA溶液。
进一步地，ssDNA的初始浓度为10～12μM，PEG-800的浓度为20～25mM，三者的体积比为600～500:3:4，所述沉淀复溶用的Tris-Nacl缓冲溶液为：10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH为7.4。
进一步地，所述金纳米粒子采用柠檬酸钠还原法制备，包括如下步骤：将HAuCl4·4H2O水溶液加热回流，再加入柠檬酸钠溶液继续加热回流，冷却得到金纳米粒子溶液。
进一步地，所述HAuCl4·4H2O水溶液的浓度为1～1.2mM，所述柠檬酸钠溶液的浓度为0.0114～0.0138g/mL，所述HAuCl4·4H2O水溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为10～12:1，所述继续加热回流的温度为132℃，时间为15～18min。
进一步地，所述QCM传感器的制备包括如下步骤：将预处理过的QCM金片装入测量池内，用Tris-NaCl缓冲溶液作为流动相冲洗QCM金片至QCM频率稳定，通入已在室温下孵育好的捕获探针DNA和还原剂三(2-甲酰乙基)膦的混合液反应，用Tris-NaCl缓冲溶液冲洗金片至QCM频率稳定，通入6-巯基己醇溶液，用Tris-NaCl缓冲溶液冲洗QCM金片至频率信号稳定，所述捕获探针DNA为capture DNA，其序列为SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTCCACCAAACATCTCTTCCT(参见序列表SEQ ID NO：2)。
进一步地，所述捕获探针DNA与还原剂三(2-甲酰乙基)膦的摩尔浓度比为1:2.5～5，所述混合溶液反应的时间为60～90min。
进一步地，所述步骤3)QCM金片的预处理是将金片在水、氨水、双氧水的混合溶液中浸泡，用水清洗，氮气干燥即可。
进一步地，所述氨水的浓度为25～28％，双氧水的浓度为25～30％，所述水、氨水、双氧水的体积比5～7:1:1，所述浸泡的温度为75℃，浸泡的时间为5～10min。
进一步地，所述检测方法包括如下步骤：将氨基修饰的DNA链、醛基修饰的DNA链和HMF加入到离心管中，水浴反应，加入AuNPs-ssDNA溶液和Mg2+缓冲溶液水浴下继续反应，离心分离，沉淀溶解于Tris-NaCl缓冲液中，将其通入QCM测量池中进行检测5-羟甲基糠醛的含量，所述氨基修饰的DNA链为ESΙ，其序列为catctcttctccgagccggtcgnh2(参见序列表SEQID NO：3)，所述醛基修饰的DNA链为ESΙΙ，其序列为cho-aaatagttggtcgctggggggctgacc(参见序列表SEQ ID NO：4)。
进一步地，所述氨基修饰的DNA链、醛基修饰的DNA链、HMF、AuNPs-ssDNA溶液和Mg2+缓冲溶液的体积比为18～12:12:25:10:135，所述水浴反应的温度为37℃，反应时间为90～120min，所述继续水热反应的时间为60～90min，所述Mg2+缓冲溶液为：10mM Tris-HCl、0.2MNaCl、0.02M MgSO4，pH为7.4。
发明原理：如图1所示，在没有HMF的情况下，ESΙ的氨基与ESΙΙ的醛基发生席夫碱缩合反应，将两者连接起来形成DNAzyme。当Mg2+的存在时，DNAzyme被激活并切割AuNPs-ssDNA，此时捕获探针DNA(capture DNA)的互补序列被切掉。在目标物HMF存在的情况下，由于其分子质量小，其分子结构中的醛基优先与ESΙ中的氨基反应，从而阻止了ESΙ和ESII的连接。此时，DNAzyme不能有效形成，AuNPs-ssDNA不能被切割。因此，HMF的浓度对AuNPs-ssDNA含量有很大的影响。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：本发明主要利用氨基和醛基之间的席夫碱缩合反应以及金纳米粒子的信号放大作用。HMF抢先与ESΙ上的氨基反应后，使DNAzyme不能形成，从而也就不能切割AuNPs-ssDNA，此时，大量的AuNPs-ssDNA可以和QCM金片上的捕获探针DNA(capture DNA)进行互补杂交，从而引起QCM传感器的频率变化。HMF加入的越多，ESΙ被占据的就越多，形成的DNAzyme就越少，由此对AuNPs-ssDNA的切割就越少，完整的AuNPs-ssDNA保留的就越多，QCM传感器的频率变化就越大，以此实现对HMF的定量检测。本发明原理简单，并且无复杂程序，无需大型仪器，具有操作简单，成本低，灵敏度较高的有点。
附图说明
图1为HMF与ESΙΙ竞争性相互作用的原理图；
图2为QCM法检测HMF的流程图；
图3为QCM传感平台的实时变化图；
图4为金纳米粒子的透射电镜图；
图5为AuNPs和ssDNA功能化的金纳米粒子的紫外光谱图；
图6为实施例1中QCM金片的扫描电镜图；
图7为实施例1中QCM金片的原子力显微镜图；
图8为定量检测HMF的频率变化图；
图9为实施例2中QCM金片的扫描电镜图；
图10为实施例2中QCM金片的原子力显微镜图；
图11为实施例3中QCM金片的扫描电镜图；
图12为实施例3中QCM金片的原子力显微镜图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明技术方案作进一步的说明。
单链DNA(ssDNA)的序列为SH-(CH2)6TTTTTTTTTTCCACCATCACCAACTAT(A)rGGAAGAGATGTTTGGTGG(参见序列表SEQ ID NO：1)；
捕获探针DNA(capture DNA)的序列为SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTCCACCAAACATCTCTTCCT(参见序列表SEQ ID NO：2)；
氨基修饰的DNA链(ESΙ)的序列为CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGNH2(参见序列表SEQID NO：3)；
醛基修饰的DNA链(ESΙΙ)的序列为CHO-AAATAGTTGGTCGCTGGGGGGCTGACC(参见序列表SEQ ID NO：4)。
实施例1
1、柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子
首先，实验中使用的所有玻璃器皿均用王水(HCl与HNO3体积比为3:1)浸泡洗涤，再用去离子水、超纯水冲洗后烘干。将1mM，50mL的HAuCl4·4H2O的水溶液倒入两口烧瓶中，油浴加热至132℃并持续搅拌使其回流；然后迅速加入现配的柠檬酸钠溶液(0.057g柠檬酸钠+5mL H2O)，继续搅拌并保持沸腾15min，溶液从黄色变为透明，然后依次变为黑色、紫色最后变为深红色，关闭加热器，让溶液自然冷却至室温，得到金纳米粒子溶液。最后，将金纳米粒子(AuNPs)溶液存储在的深色玻璃瓶中，并于4℃保存。
将10μL经过稀释的AuNPs溶液滴加到铜网上，室温下自然晾干之后，进行透射电子显微镜检测，结果如图4所示。图4为金纳米粒子的透射电镜图，标尺为50nm，从图4中可以看出合成的金纳米粒子具有很好的分散性。
2、单链DNA(ssDNA)功能化金纳米粒子的制备
将过量的二水合双(对磺酰苯基)苯基膦二钾盐(BSPP)加入到900μL的金纳米粒子溶液中，在室温下孵育过夜，以增加溶液的稳定性，纯化后得到BSPP保护的金纳米粒子溶液；然后加入4.5μL 10μM的ssDNA(上海生工生物技术有限公司(中国上海)合成和纯化)，避光反应24h；然后继续加入6μL浓度为20mM的聚乙二醇800(PEG-800)反应2h以阻断金纳米粒子上未结合的活性位点；最后在12000rpm，10℃下离心20min，并用超纯水清洗三次，将沉淀复溶于50μL Tris-NaCl缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH为7.4)中，得到AuNPs-ssDNA溶液，并于4℃保存。
采用紫外-可见分光光度计测试AuNPs溶液及AuNPs-ssDNA溶液的吸收光谱，结果如图5所示。图5为AuNPs和ssDNA功能化的金纳米粒子的紫外光谱图，其中，Bare AuNPs为AuNPs，Functionalized AuNPs为AuNPs-ssDNA。由图5可见，金纳米粒子AuNPs溶液的紫外吸收峰大约为520nm，修饰了ssDNA的金纳米粒子溶液的紫外吸收峰大约偏移至524nm，说明修饰成功。
3、石英晶体微天平(QCM)金片的预处理
将金片(5MHz,AT-cut)浸泡在体积比为5:1:1(超纯水、25％氨水、30％双氧水)的混合溶液中，75℃下浸泡5min，然后用去离子水冲洗金片，氮气干燥后备用。
4、QCM传感器的制备
将预处理过的石英晶体微天平(QCM)金片装入测量池内，在空气状态下测定基频。首先用Tris-NaCl缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH为7.4)作为流动相冲洗QCM金片至QCM频率稳定，接着通入含有已在室温下孵育好的的捕获探针DNA(capture DNA)样品(40nM)和还原剂三(2-甲酰乙基)膦(TECP)(100nM)的混合液60min，然后用Tris-NaCl缓冲溶液冲洗金片以去除未结合的capture DNA，直至频率稳定；随后通入100nM的6-巯基己醇(MCH)溶液30min以封闭金片表面的未结合的活性位点。最后，用Tris-NaCl缓冲溶液冲洗金片以去除未结合的MCH，直至频率信号稳定。
5、QCM定量检测5-羟甲基糠醛(HMF)
将90μL 0.9μM氨基修饰的DNA链(ESΙ)、60μL 0.6μM醛基修饰的DNA链(ESΙΙ)和125μL 5μM的HMF加入到1.5mL离心管中，在37℃水浴下反应120min；然后加入50μL 0.1μM的AuNPs-ssDNA溶液和675μL的Mg2+缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.2M NaCl，0.02M MgSO4，pH为7.4，)，在37℃水浴下继续反应60min。反应结束后，在12000rpm，10℃条件下离心20min；弃去上清液，重新溶解于1000μL Tris-NaCl缓冲液中，然后将其通入QCM测量池中进行检测定量。QCM法检测HMF的流程如图2所示，QCM传感平台的实时变化如图3所示，实验结果如图8所示。测量结束后取出金片，用扫描电镜测试金片表面形态，结果如图6所示；用原子力显微镜测试金片表面粗糙度，结果如图7所示。
图3为QCM传感平台的实时变化图。由图3可知，首先通入Tris-Nacl缓冲溶液(10mMTris-HCl，0.1M NaCl，pH为7.4)使基频稳定，然后通入室温下孵育好的捕获探针DNA(capture DNA)60min，可以看到频率开始逐渐下降，并趋于稳定，约下降4.2Hz，说明捕获探针DNA很好的修饰在金晶片上了；继续通入Tris-Nacl缓冲溶液，以除去未结合的DNA；接着通入MCH以占据金晶片表面的活性位点；最后通入反应过的AuNPs-ssDNA溶液，可以看到频率发生骤降，说明大量的金纳米粒子被捕获到了QCM金片表面。
图6为实施例1中QCM金片的扫描电镜图；其中，A为不存在HMF时的QCM金片表面形貌图，B为存在HMF时的QCM金片表面形貌图。从图中可以看出，HMF不存在时，分裂DNAzyme片段通过席夫碱缩合重组，实现对ssDNA的切割，从而使其不能和QCM金片表面上的捕获探针DNA(capture DNA)杂交，所以QCM金片表面没有金纳米粒子存在；当大浓度HMF存在时，由于其分子质量小，其分子结构中的醛基可以优先于ESΙ上的氨基进行反应，从而减少了DNAzyme的重组，进而阻止了对金纳米粒子功能化的ssDNA的切割，此时大量完整的ssDNA依旧可以和QCM金片表面的捕获探针DNA(capture DNA)进行杂交，从而将大量的金纳米粒子引入到QCM金片表面，如图6B中所示，QCM金片表面分布了大量金纳米粒子。
图7为实施例1中QCM金片的原子力显微镜图；其中，A为不存在HMF时的QCM金片表面粗糙度图，B为存在HMF时的QCM金片表面粗糙度图。图7A中显示金片表面整齐平整无凸起，图7B中可以看到金片表面存在大量明显的凸起部位。该结果符合传感器对HMF的特异性和敏感性。
实验结果如图8所示。其中，A为不同浓度HMF作用下得到的频移图，其中，HMF的浓度a-h依次为0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μM(从上至下)；B为频移值(ΔF)与HMF浓度之间的线性关系图，插图为HMF浓度的线性校准曲线。从图中可以看出HMF在0.005μM到5μM呈良好的线性关系。
实施例2
1、柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子
首先，实验中使用的所有玻璃器皿均用王水(HCl与HNO3体积比为3:1)浸泡洗涤，再用去离子水、超纯水冲洗后烘干。将1.2mM，50mL的HAuCl4·4H2O的水溶液倒入两口烧瓶中，油浴加热至132℃并持续搅拌使其回流；然后迅速加入现配的柠檬酸钠溶液(0.0684g柠檬酸钠+5mL H2O)，继续搅拌并保持沸腾18min，溶液从黄色变为透明，然后依次变为黑色、紫色最后变为深红色，关闭加热器，让溶液自然冷却至室温，得到金纳米粒子溶液。最后，将金纳米粒子(AuNPs)溶液存储在的深色玻璃瓶中，并于4℃保存。
2、单链DNA(ssDNA)功能化金纳米粒子的制备
将过量的二水合双(对磺酰苯基)苯基膦二钾盐(BSPP)加入到750μL的金纳米粒子溶液中，在室温下孵育过夜，以增加溶液的稳定性，纯化后得到BSPP保护的金纳米粒子溶液；然后加入4.5μL 12μM的ssDNA，避光反应24h；然后继续加入6μL浓度为25mM的聚乙二醇800(PEG-800)反应2h以阻断金纳米粒子上未结合的活性位点；最后在12000rpm，10℃下离心20min，并用超纯水清洗三次，将沉淀复溶于50μLTris-NaCl缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH为7.4)中，得到AuNPs-ssDNA溶液，并于4℃保存。
3、石英晶体微天平(QCM)金片的预处理
将QCM金片(5MHz,AT-cut)浸泡在体积比为5:1:1(超纯水、28％氨水、30％双氧水)的混合溶液中，75℃下浸泡7min，然后用去离子水冲洗金片，氮气干燥后备用。
4、QCM传感器的制备
将预处理过的石英晶体微天平(QCM)金片装入测量池内，在空气状态下测定基频。首先用Tris-NaCl缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH为7.4)作为流动相冲洗QCM金片至QCM频率稳定，接着通入已在室温下孵育1h的捕获探针DNA(capture DNA)样品(40nM)和还原剂三(2-甲酰乙基)膦(TECP)(100nM)的混合液60min，然后用Tris-NaCl缓冲溶液冲洗金片以去除未结合的capture DNA，直至频率稳定；随后通入100nM的6-巯基己醇(MCH)溶液30min以封闭金片表面的未结合的活性位点。最后，用Tris-NaCl缓冲溶液冲洗金片以去除未结合的MCH，直至频率信号稳定。
5、QCM定量检测5-羟甲基糠醛(HMF)
将90μL 0.9μM氨基修饰的DNA链(ESΙ)、60μL 0.6μM醛基修饰的DNA链(ESΙΙ)和125μL 0.5μM的HMF加入到1.5mL离心管中，在37℃水浴下反应90min；然后加入50μL 0.1μM的AuNPs-ssDNA溶液和675μL的Mg2+缓冲溶液(10mM Tris-HCl、0.2M NaCl、0.02M MgSO4，pH为7.4)，在37℃水浴下继续反应90min。反应结束后，在12000rpm，10℃条件下离心20min；弃去上清液，重新溶解于1000μL Tris-NaCl缓冲液中，然后将其通入QCM测量池中进行检测定量。测量结束后取出金片，用扫描电镜测试金片表面形态，结果如图9所示；用原子力显微镜测试金片表面粗糙度，结果如图10所示。图9为实施例2中QCM金片的扫描电镜图；其中，A为不存在HMF时的QCM金片表面形貌图，B为存在HMF时的QCM金片表面形貌图。从图中可以看出，HMF不存在时，分裂DNAzyme片段通过席夫碱缩合重组，实现对ssDNA的切割，从而使其不能和QCM金片表面上的捕获探针DNA(capture DNA)杂交，所以QCM金片表面没有金纳米粒子存在；当HMF存在时，由于其分子质量小，其分子结构中的醛基可以优先于ESΙ上的氨基进行反应，从而减少了DNAzyme的重组，进而阻止了对金纳米粒子功能化的ssDNA的切割，此时完整的ssDNA依旧可以和QCM金片上的捕获探针DNA(capture DNA)进行杂交，从而将金纳米粒子引入到QCM金片表面，如图9B中所示，QCM金片表面存在一些金纳米粒子。
图10为实施例2中QCM金片的原子力显微镜图；其中，A为不存在HMF时的QCM金片表面粗糙度图，B为存在HMF时的QCM金片表面粗糙度图。图10A中显示金片表面整齐平整无凸起，图10B中可以看到金片表面存在明显的凸起部位。该结果符合传感器对HMF的特异性和敏感性。
实施例3
1、柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子
首先，实验中使用的所有玻璃器皿均用王水(HCl与HNO3体积比为3:1)浸泡洗涤，再用去离子水、超纯水冲洗后烘干。将1.1mM，60mL的HAuCl4·4H2O的水溶液倒入两口烧瓶中，油浴加热至132℃并持续搅拌使其回流；然后迅速加入现配的柠檬酸钠溶液(0.0627g柠檬酸钠+5mL H2O)，继续搅拌并保持沸腾15min，溶液从黄色变为透明，然后依次变为黑色、紫色最后变为深红色，关闭加热器，让溶液自然冷却至室温，得到金纳米粒子溶液。最后，将金纳米粒子(AuNPs)溶液存储在的深色玻璃瓶中，并于4℃保存。
2、单链DNA(ssDNA)功能化金纳米粒子的制备
将过量的二水合双(对磺酰苯基)苯基膦二钾盐(BSPP)加入到825μL的金纳米粒子溶液中，在室温下孵育过夜，以增加溶液的稳定性，纯化后得到BSPP保护的金纳米粒子溶液；然后加入4.5μL 10μM的ssDNA，避光反应24h；然后继续加入6μL浓度为20mM的聚乙二醇800(PEG-800)反应2h以阻断金纳米粒子上未结合的活性位点；最后在12000rpm，10℃下离心20min，并用超纯水清洗三次，将沉淀复溶于50μLTris-NaCl缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH为7.4)中，得到AuNPs-ssDNA溶液，并于4℃保存。
3、石英晶体微天平(QCM)金片的预处理
将QCM金片(5MHz,AT-cut)浸泡在体积比为7:1:1(超纯水、25％氨水、25％双氧水)的混合溶液中，75℃下浸泡10min，然后用去离子水冲洗金片，氮气干燥后备用。
4、QCM传感器的制备
将预处理过的石英晶体微天平(QCM)金片装入测量池内，在空气状态下测定基频。首先用Tris-NaCl缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH为7.4)作为流动相冲洗QCM金片至QCM频率稳定，接着通入已在室温下孵育1h的捕获探针DNA(capture DNA)样品(40nM)和还原剂三(2-甲酰乙基)膦(TECP)(200nM)的混合液90min，然后用Tris-NaCl缓冲溶液冲洗金片以去除未结合的capture DNA，直至频率稳定；随后通入100nM的6-巯基己醇(MCH)溶液30min以封闭金片表面的未结合的活性位点。最后，用Tris-NaCl缓冲溶液冲洗金片以去除未结合的MCH，直至频率信号稳定。
5、QCM定量检测5-羟甲基糠醛(HMF)
将60μL 0.9μM氨基修饰的DNA链(ESΙ)、60μL 0.6μM醛基修饰的DNA链(ESΙΙ)和125μL 0.005μM的HMF加入到1.5mL离心管中，在37℃水浴下反应100min；然后加入50μL 0.1μM的AuNPs-ssDNA溶液和675μL的Mg2+缓冲溶液(10mM Tris-HCl、0.2M NaCl、0.02M MgSO4，pH为7.4)，在37℃水浴下继续反应80min。反应结束后，在12000rpm，10℃条件下离心20min；弃去上清液，重新溶解于1000μL Tris-NaCl缓冲液中，然后将其通入QCM测量池中进行检测定量。测量结束后取出QCM金片，用扫描电镜测试金片表面形态，结果如图11所示；用原子力显微镜测试金片表面粗糙度，结果如图12所示。图11为实施例3中QCM金片的扫描电镜图；其中，A为不存在HMF时的QCM金片表面形貌图，B为存在HMF时的QCM金片表面形貌图。从图中可以看出，HMF不存在时，分裂DNAzyme片段通过席夫碱缩合重组，实现对ssDNA的切割，从而使其不能和QCM金片表面上的捕获探针DNA(capture DNA)杂交，所以QCM金片表面没有金纳米粒子存在；当HMF存在时，由于其分子质量小，其分子结构中的醛基可以优先于ESΙ上的氨基进行反应，从而减少了DNAzyme的重组，进而阻止了对金纳米粒子功能化的ssDNA的切割，此时完整的ssDNA依旧可以和QCM金片上的捕获探针DNA(capture DNA)进行杂交，从而将金纳米粒子引入到QCM金片表面，如图11B中所示，QCM金片表面分布了一些金纳米粒子，但数量没有实施例1的多，这正是符合了与HMF浓度之间的定量关系。
图12为实施例3中QCM金片的原子力显微镜图；其中，A为不存在HMF时的QCM金片表面粗糙度图，B为存在HMF时的QCM金片表面粗糙度图。图12A中显示金片表面整齐平整无凸起，图12B中可以看到金片表面存在凸起部位。该结果符合传感器对HMF的特异性和敏感性。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种基于金纳米粒子放大QCM信号检测5-羟甲基糠醛的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 51
<212> DNA
<213> ssDNA(Artificial Sequence)
<400> 1
shchtttttt ttttccacca tcaccaacta targgaagag atgtttggtg g 51
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> capture DNA(Artificial Sequence)
<400> 2
shchtttttt ttttccacca aacatctctt cct 33
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> ESI(Artificial Sequence)
<400> 3
catctcttct ccgagccggt cgnh 24
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> ESII(Artificial Sequence)
<400> 4
chaaatagtt ggtcgctggg gggctgacc 29