circRNA PRDM5在钙化性主动脉瓣疾病的诊断试剂盒及治疗药物开发中的应用
阅读说明：本技术 circRNA PRDM5在钙化性主动脉瓣疾病的诊断试剂盒及治疗药物开发中的应用 (Application of circRNA PRDM5 in diagnosis kit and therapeutic drug development of calcified aortic valve diseases ) 是由 王勇军 董念国 韩东 周廷文 史嘉玮 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及circRNA PRDM5在钙化性主动脉瓣疾病的诊断试剂盒及治疗药物开发中的应用。本发明通过筛选一种人瓣膜间质细胞成骨分化相关的circRNA PRDM5并验证其应用,通过检测正常与钙化主动脉瓣组织中的circRNA PRDM5的表达水平,并对circRNA PRDM5基因进行细胞功能学研究,发现过表达circRNA PRDM5,可以显著促进人瓣膜间质细胞成骨分化能力,证明circRNA PRDM5及其表达产物可作为诊断钙化性主动脉瓣疾病的标志物,也可作为制备治疗钙化性主动脉瓣疾病药物的靶基因,为治疗主动脉瓣钙化提供新的非手术治疗方案。(The invention relates to application of circRNA PRDM5 in the development of a diagnostic kit and a therapeutic drug for calcified aortic valve diseases. The invention screens circRNA PRDM5 related to osteogenic differentiation of human valve interstitial cells and verifies the application, the expression level of the circRNA PRDM5 in normal and calcified aortic valve tissues is detected, and the cell function research is carried out on the circRNA PRDM5 gene, so that the over-expression of the circRNA PRDM5 is found, the osteogenic differentiation capability of the human valve interstitial cells can be remarkably promoted, and the result proves that the circRNA PRDM5 and the expression product thereof can be used as a marker for diagnosing calcified aortic valve diseases, can also be used as a target gene for preparing medicaments for treating calcified aortic valve diseases, and provides a novel non-operative treatment scheme for treating aortic valve calcification.)
技术领域
：本发明涉及生物医药领域，具体涉及circRNA PRDM5在钙化性主动脉瓣疾病的诊断试剂盒及治疗药物开发中的应用。
背景技术
：钙化主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease，CAVD)是一种高发病率和高死亡率的老年性进行性疾病，主要病理生理改变为主动脉瓣瓣叶纤维增生钙化从而导致瓣膜变硬并引起血流动力学改变，从而影响心脏功能。以往观点均认为CAVD是一种与年龄相关的退行性病变，是随着年龄增长，瓣膜组织的退化硬化过程。然而近年来的基础研究表明，CAVD是一种涉及内皮损伤，炎症细胞浸润、细胞外基质重塑以及瓣膜间质细胞成骨样分化等复杂病理改变的主动进展过程。瓣膜组织中的细胞主要包括瓣膜内皮细胞 (Valvularendothelial cells,VEC)、瓣膜间质细胞(Valvular interstitial cells,VICs)、瓣膜前体细胞等，已有研究证实瓣膜间质细胞成骨样分化所导致的钙盐增多可能是瓣膜钙化发生的重要始动因素。目前，CAVD缺乏有效的临床可用药物治疗方案，其主要治疗手段为主动脉瓣置换手术。然而，接受外科手术的患者必然会承担较高的医疗手术风险及经济负担。因此，探究 CAVD具体发病机制，采用非手术方法有效预防和/或治疗钙化性主动脉瓣疾病是目前临床治疗CAVD的迫切需求。
环状RNA(circRNA)是一类呈闭环结构且不受RNA外切酶影响的非编码 RNA。因为其在真核生物体内广泛表达，稳定，物种间保守性好且不易被降解而成为近年来非编码RNA研究领域的热点。已有大量的研究表明环状RNA在动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病中扮演重要角色，其上述特点使得circRNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有了非常广阔的前景。
circRNA PRDM5(circbaseID:hsa_circ_0005654)，其在基因组上的定位为：chr4:121675708-121732604，相应的线性基因为PRDM5(NM_018699)，环化序列长度为758个碱基。PRDM5，PR区域蛋白家族(PRDI-BF1 and RIZ domain containing,PRDM)成员5，属于锌指蛋白家族,是一类组织特异性的转录因子,有研究报道其与骨发育有密切关系,但是其在钙化性主动脉瓣疾病中的功能尚缺乏研究。
发明内容
：(一)解决的技术问题
针对上述背景，本发明通过研究circRNA PRDM5在钙化性主动脉瓣中的表达及其对人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的调节作用，提出基于circRNA PRDM5基因的钙化性主动脉瓣疾病诊断试剂盒，以及提出以circRNA PRDM5基因及其表达产物作为靶点在制备或筛选治疗钙化性主动脉瓣疾病药物中的应用，为治疗主动脉瓣钙化提供新的非手术治疗方案。
(二)技术方案
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明公开第一方面，提供一种钙化性主动脉瓣疾病诊断试剂盒，包括检测circRNA PRDM5的试剂，所述circRNA PRDM5的CircbaseID为 hsa_circ_0005654。
进一步地，所述试剂盒包括扩增circRNA PRDM5的引物。
进一步地，所述引物包括由核苷酸序列SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的DNA序列组成的引物对。
本发明公开第二方面，提供一种治疗钙化性主动脉瓣疾病的药物组合，包括抑制或者阻止circRNA PRDM5基因表达的试剂，或与circRNA PRDM5表达产物的结合使其失活的试剂，所述circRNA PRDM5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述试剂包括用于沉默circRNA PRDM5基因表达的shRNA或 siRNA。
进一步地，所述siRNA的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述 siRNA的反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
进一步地，所述治疗钙化性主动脉瓣疾病的药物组合，还包括阴性对照 NC(Negative Control)序列，所述阴性对照NC的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述阴性对照NC的反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示
本发明公开第三方面，提供circRNA PRDM5基因及其表达产物作为靶点在制备或筛选治疗钙化性主动脉瓣疾病药物中的应用，所述circRNA PRDM5 的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
(三)有益效果
本发明产生的有益效果是：(1)本发明通过设计特异性环状RNA引物进行RT-PCR，证实circRNA PRDM5基因的真实存在；(2)本发明通过检测人钙化主动脉瓣组织中的circRNA PRDM5基因表达，证明其表达水平相比正常主动脉瓣组织显著升高，提示circRNAPRDM5可作为钙化性主动脉瓣疾病的诊断标志物；(3)本发明通过研究circRNA PRDM5对人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响，证明过表达circRNA PRDM5显著促进人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化，下调circRNA PRDM5可明显抑制人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化能力，为以circRNA PRDM5为靶点的抗主动脉瓣钙化治疗药物制备提供了依据；(4)本发明提出circRNA PRDM5及其表达产物可作为诊断钙化性主动脉瓣疾病的标志物，也可作为制备治疗钙化性主动脉瓣疾病药物的靶基因，为治疗主动脉瓣钙化提供新的非手术治疗方案。
附图说明
：为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是circRNA PRDM5基因物种间(人、鼠)保守性验证图；
图2是实施例一中QRT-PCR检测正常及钙化主动脉瓣膜组织中circRNA PRDM5的表达水平图。(NC:正常主动脉瓣膜，CAVs：钙化主动脉瓣膜)；
图3是实施例二中circRNA PRDM5过表达质粒及siRNA敲低效能的验证结果图；
图4是实施例三中，在人原代瓣膜间质细胞中转染circRNA PRDM5特异性siRNA干扰circRNA PRDM5基因后，用成骨分化诱导培养基培养14天后进行钙化相关标志蛋白(RUNX2,ALP)检测(图4A)，随后用成骨分化诱导培养基培养21天后行茜素红染色(图4B)，钙盐定量分析(图4C)结果图；
图5是实施例三中，在人原代瓣膜间质细胞中转染circRNA PRDM5特异性过表达质粒，过表达circRNA PRDM5基因后，用成骨分化诱导培养基培养 14天后进行钙化相关标志蛋白(RUNX2,ALP)检测(图5A)，随后用成骨分化诱导培养基培养21天后行茜素红染色(图5B)，钙盐定量分析(图5C)结果图。
具体实施方式
：
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明首先通过采集正常与钙化主动脉瓣膜组织各4例，进行高通量测序，筛选正常与疾病组组织circRNA差异表达谱。并筛选出物种间(人、鼠) 高保守性的circRNA PRDM5基因。然后设计能扩增环状RNA的特异性引物，通过QRT-PCR技术大样本验证人钙化主动脉瓣组织中的circRNA PRDM5基因表达，证明其表达水平相比正常主动脉瓣组织显著升高，提示circRNA PRDM5 可作为钙化性主动脉瓣疾病的诊断标志物。
进一步，本发明通过研究circRNA PRDM5对人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响，证明过表达circRNA PRDM5显著促进人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化，下调circRNAPRDM5可明显抑制人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化能力，为以circRNA PRDM5为靶点的抗主动脉瓣钙化治疗药物制备提供了依据。
本发明所涉及的技术均为分子克隆常规技术，所涉及试剂及耗材均属于市售普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员熟知并熟练掌握。
下面通过实施例对本发明技术方案做进一步说明：
实施例一：采集正常与钙化主动脉瓣膜组织各4例，进行高通量测序，筛选正常与疾病组组织circRNA差异表达谱。
本实施例中，基于测序数据中在钙化主动脉瓣膜组织中表达上调的差异表达circRNA筛选出人鼠保守的circRNA PRDM5基因然后利用QRT-PCR技术大样本验证差异表达circRNA PRDM5基因在正常及钙化主动脉瓣膜组织中的表达。
具体实验方案如下：
1、RNA提取
1)组织处理：取50mg左右主动脉瓣膜组织，液氮研磨至满意后加入1ml Trizol试剂，震荡匀浆，充分裂解后，12000rpm，4℃离心15分钟，取上清液。
2)加入氯仿200ul，震荡混匀后室温放置15分钟。
3)4℃，12000rpm，离心15分钟，分三层，取上层水相至新的无酶EP管，加入等体积异丙醇，混匀室温放置10分钟，沉淀RNA。
4)4℃，12000rpm，离心15分钟，小心去掉上清液，RNA沉淀与管底。
5)按照每1ml Trizol加入1ml 75％乙醇，颠倒混匀。
6)4℃，8000g，离心5分钟,弃上清，室温晒干(5-10分钟)。
7)加入适量DEPC水溶解RNA，测定RNA浓度。根据定量结果进行逆转录。
8)RNA A260/A280＝1.8-2.1
2、cDNA逆转录
9)日本TAKARA公司试剂盒逆转录体系(10ul):
反应条件：37℃，15分钟逆转录反应；85℃，5s逆转录酶的失活反应；4℃，反应结束，产物为cDNA。
3、QRT-PCR检测正常及钙化主动脉瓣膜组织中circRNA PRDM5表达， circRNAPRDM5引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的DNA序列组成的引物对。
1)实验体系：
2)反应条件：
95℃，2分钟；40个循环(95℃，10秒；60℃，60秒)；60-95℃溶解曲线。
3)上机扩增，反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，各基因表达强度根据CT值(threshold cycle values)，T检验计算P值。对照的内参管家基因β-actin特异性实时荧光定量PCR引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示引物对。
4)QRT-PCR结果
结果见图2。在30例正常主动脉瓣膜组织及30例钙化主动脉瓣组织样本中检测circRNA PRDM5的表达，结果显示与正常主动脉瓣组织相比，circRNA PRDM5在钙化主动脉瓣膜组织中显著上调。
实施例二：circRNA PRDM5小干扰RNA和过表达质粒构建
1、circRNA PRDM5小干扰RNA设计：circRNA PRDM5 siRNA序列由广州吉赛生物科技公司设计合成。circRNA PRDM5的siRNA正义链序列如SEQ ID NO:6所示，反义链序列如SEQ ID NO:7所示。阴性对照组序列正义链和反义链分别如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
2、pCD5-ciR载体过表达circRNA PRDM5及人瓣膜间质细胞瞬时转染：合成circRNAPRDM5线性全序列，序列退火成双链DNA片段通过多克隆位点插入到pCD5-ciR载体，重组质粒通过测序鉴定，对照组为 pCD5-ciR空载体。
3、siRNA和过表达效能验证：
1)2-5代人瓣膜间质细胞接种至24孔板，37℃、5％CO2培养。
2)待细胞汇合密度至80％后开始转染，取0.5ug过表达质粒或5ul siRNA 以及0.5ug内参质粒溶于250ul opti-MEM中，混匀。
3)1.5ul Lipofectamine 2000溶于250ul opti-MEM中，混匀。
4)两管试剂混合，室温静置20分钟，然后加入24孔板中，37℃、5％CO2 培养。
5)6-8小时后更换完全培养基，继续培养。
6)48小时后收集细胞，QRT-PCR定量分析。
结果见图3。结果显示siRNA能有效降低circRNA PRDM5表达，而过表达质粒能显著上调circRNA PRDM5表达水平。
实施例三：敲低或过表达circRNA PRDM5基因对人瓣膜间质细胞成骨分化能力的影响。
1、实验方法
1)种人瓣膜间质细胞于6孔板内，待细胞汇合度达到80％后，按照实施例二中方法，分别转染siRNA和过表达circRNA PRDM5质粒。培养14天后收集细胞，行western blot检测钙化标志基因RUNX2、Osterix蛋白表达变化。培养21天后，行茜素红染色、钙定量分析检测不同处理对瓣膜间质细胞成骨分化的影响。
2)瓣膜间质细胞成骨分化诱导方法
待各组细胞转染24小时后，观察细胞汇合度，取培养密度90％左右的人瓣膜间质细胞，用含2％胎牛血清的DMEM高糖培养基饥饿过夜，第二日以新配置成骨诱导培养基(50mg/mL维生素C，5mmol/Lβ-甘油磷酸,100nmol/L 地塞米松，溶剂为含2％胎牛血清的高糖DMEM培养基)对人瓣膜间质细胞进行成骨分化诱导，每三天换液，诱导14天。
2、结果分析
成骨诱导培养基诱导14天，western blot检测钙化标志基因RUNX2、 Osterix蛋白表达变化。成骨诱导培养基诱导21天，进行茜素红染色、钙定量分析检测。结果如图4所示，与si-NC组相比，circRNA PRDM5 siRNA组钙化标志基因RUNX2、Osterix蛋白表达显著降低(A)；茜素红染色阳性钙结节明显减少(B)，钙盐沉积量也明显减少(C)；相反，如图5所示，circRNA PRDM5 过表达组与对照组相比，钙化标志基因RUNX2、Osterix蛋白表达显著增高(A)；茜素红染色阳性钙结节(B)及盐沉积量也显著增多(C)。
结论
circRNA PRDM5及其表达产物可作为诊断钙化性主动脉瓣疾病的标志物，也可作为制备治疗钙化性主动脉瓣疾病药物的靶基因为治疗主动脉瓣钙化提供新的非手术治疗方案。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院
<120> circRNA PRDM5在钙化性主动脉瓣疾病的诊断试剂盒及治疗药物开发中的应用
<130> 20210616
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 758
<212> DNA
<213> 人类(Homo)
<400> 1
gagatcctaa gaaaaagctt atatgttcag tgtgcaataa aaagtgttct tcagcatcaa 60
gcctacagga acatagaaag attcatgaga tatttgattg tcaagaatgt atgaagaaat 120
ttatttcagc taatcagcta aaacgtcata tgatcaccca ctcagaaaaa cgaccctata 180
attgcgagat ttgtaataag tctttcaaga ggcttgatca agtgggtgct cacaaagtaa 240
tacacagcga agacaaacct tacaaatgca aactttgtgg aaagggattt gcccacagaa 300
atgtttacaa gaatcataag aagacccact ctgaggagag accgttccaa tgtgaagaat 360
gtaaagcttt gttccggacc ccattttctt tacagagaca cctgctaata cataacagtg 420
agaggacttt caagtgccat cactgcgatg ctacctttaa gaggaaggat acattaaatg 480
ttcatgtcca ggtggttcat gaaagacaca agaagtatag gtgtgagcta tgtaataagg 540
cctttgttac accttcagtg cttagaagtc ataagaaaac acatacagga gaaaaggaga 600
aaatctgtcc atattgtggc cagaaatttg ccagcagtgg tacactcaga gttcatatcc 660
ggagccacac aggtgagcgt ccctatcaat gtccttactg tgaaaaagga ttcagtaaaa 720
atgatggact gaagatgcac attcgtactc acaccagg 758
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gagcgtccct atcaatgtcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcctgtaggc ttgatgctga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtggccgagg actttgattg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cctgtaacaa cgcatcatat t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
accagggaga tcctaagaaa a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ttttcttagg atctccctgg t 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
uucuccgaac gugucacguu u 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
acgugacacg uucggagaau u 21