Shank3片段序列甲基化检测试剂在制备精神分裂症诊断试剂盒中的用途
阅读说明：本技术 Shank3片段序列甲基化检测试剂在制备精神分裂症诊断试剂盒中的用途 (Application of SHANK3 fragment sequence methylation detection reagent in preparation of schizophrenia diagnostic kit ) 是由 李涛 倪培艳 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了SHANK3片段序列甲基化检测试剂在制备精神分裂症诊断试剂盒中的用途,属于体外诊断试剂技术领域。本发明研究发现SHANK3基因启动子长度为144bp的片段序列可以作为诊断精神分裂症的生物标记物。与健康人群相比,精神分裂症患者该片段序列第83、84位的CG和第109、110位的CG甲基化水平显著升高。因此,SHANK3基因启动子长度为144bp的片段序列甲基化检测试剂可制备精神分裂症诊断试剂盒,用于精神分裂症早期诊断,具有良好的应用前景。(The invention provides an application of a SHANK3 fragment sequence methylation detection reagent in preparation of a schizophrenia diagnostic kit, belonging to the technical field of in-vitro diagnostic reagents. The research of the invention finds that the segment sequence with the length of 144bp of the SHANK3 gene promoter can be used as a biomarker for diagnosing schizophrenia. Compared with healthy people, the methylation level of CG at 83 th and 84 th positions and CG at 109 th and 110 th positions of the fragment sequence of the schizophrenia patient is obviously increased. Therefore, the methylation detection reagent of the segment sequence with the length of 144bp of the SHANK3 gene promoter can be used for preparing a schizophrenia diagnosis kit, is used for early diagnosis of schizophrenia, and has good application prospect.)
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及SHANK3片段序列甲基化检测试剂在制备精神分裂症诊断试剂盒中的用途。
背景技术
精神分裂症是(schizophrenia,SCZ)一类以思维、情感、意志行为等多方面损害为特征的慢性致残性脑病，多起病于青少年晚期或成年早期，其终生患病率约为1％，可严重影响患者的生活、工作、学习及社会功能。然而，迄今对精神分裂症的病理生理机制尚未完全阐明，精神分裂症的诊断和分类标准仍然是基于患者临床症状和行为学描述，缺少指导临床诊断和治疗的可靠生物学基础，极大地限制了临床上对精神分裂症进行客观诊断、早期干预及有效治疗，因此亟需开发一种精神分裂症的客观诊断试剂。
诊断试剂是指采用免疫学、微生物学、分子生物学等原理或方法制备的、在体外用于对人类疾病的诊断、检测及流行病学调查等的诊断试剂。诊断试剂可以用于疾病早期诊断，对疾病的早期干预及有效治疗具有重要意义。因此，开发有效的精神分裂症诊断试剂对于精神分裂症的诊断和治疗十分重要。
但是，缺少诊断精神分裂症的标记物是目前诊断精神分裂症困难的重要原因。由于大脑的高度复杂性，准确找到诊断精神分裂症的生物标记物是很困难的。
因此，亟需找到一种用于诊断精神分裂症的生物标记物用于诊断精神分裂症。
发明内容
本发明的目的是提供SHANK3片段序列甲基化检测试剂在制备精神分裂症诊断试剂盒中的用途。
本发明提供了检测SHANK3基因启动子片段序列甲基化的试剂在制备精神分裂症诊断试剂盒中的用途；所述片段序列如下：
TCAGCTGCACCACTCAGGCCAGGCCAGTGGCCTTGGGAGGGGCCTGTGATGCTGGGACCACAGTTCCTGGGCAGGGAGCAACCGTCTAGGCGTGGGGAGAACGCAGGACGTGACCCACACACCGCACTGGAGGCTCCGCTCTGC。
进一步地，所述片段序列甲基化的位点为该片段序列第83、84位的CG以及第109、110位的CG。
进一步地，所述检测片段序列甲基化的试剂为测序用试剂；
和/或，所述检测片段序列甲基化的试剂为PCR试剂。
进一步地，所述检测片段序列甲基化的试剂为焦磷酸测序法用试剂。
进一步地，所述检测SHANK3基因启动子片段序列甲基化的试剂是检测人皮层中间神经元中SHANK3基因启动子片段序列甲基化的试剂；
和/或，所述检测SHANK3基因启动子片段序列甲基化的试剂是检测人外周单核细胞中SHANK3基因启动子片段序列甲基化的试剂。
进一步地，所述人皮层中间神经元为由人诱导多能干细胞定向诱导的皮层中间神经元。
进一步地，所述人诱导多能干细胞为由人皮肤细胞重编程而得。
本发明还提供了一种精神分裂症诊断试剂盒，它包括用于检测SHANK3基因启动子片段序列甲基化的试剂；所述片段序列如下：
TCAGCTGCACCACTCAGGCCAGGCCAGTGGCCTTGGGAGGGGCCTGTGATGCTGGGACCACAGTTCCTGGGCAGGGAGCAACCGTCTAGGCGTGGGGAGAACGCAGGACGTGACCCACACACCGCACTGGAGGCTCCGCTCTGC；
优选地，所述片段序列甲基化的位点为该片段序列第83、84位的CG以及第109、110位的CG。
进一步地，所述检测片段序列甲基化的试剂为测序用试剂；
和/或，所述检测片段序列甲基化的试剂为PCR试剂；
优选地，所述检测片段序列甲基化的试剂为焦磷酸测序法用试剂。
进一步地，所述检测SHANK3基因启动子片段序列甲基化的试剂是检测人皮层中间神经元中SHANK3基因启动子片段序列甲基化的试剂；
和/或，所述检测SHANK3基因启动子片段序列甲基化的试剂是检测人外周单核细胞中SHANK3基因启动子片段序列甲基化的试剂；
优选地，所述人皮层中间神经元为由人诱导多能干细胞定向诱导的皮层中间神经元；
更优选地，所述人诱导多能干细胞为由人皮肤细胞重编程而得。
本发明研究发现SHANK3基因启动子长度为144bp的片段序列可以作为诊断精神分裂症的生物标记物。与健康人群相比，精神分裂症患者该片段序列第83、84位的CG和第109、110位的CG甲基化水平显著升高。因此，SHANK3基因启动子长度为144bp的片段序列甲基化检测试剂可制备精神分裂症诊断试剂盒，用于精神分裂症早期诊断，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为利用本发明生物标记物诊断精神分裂症的结果；其中，a为皮层中间神经元定向分化的过程，b为精神分裂症患者(SCZ)和正常对照组(HC)皮层中间神经元免疫荧光染色结果，c为精神分裂症患者(SCZ)和正常对照组(HC)SHANK3基因启动子片段序列中第83、84位的CG(CG1)和第109、110位的CG(CG4)甲基化水平的比较。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、利用生物标记物诊断精神分裂症
1、基因名字：SHANK3
2、片段序列(长度为144bp，下划线的两个CG是高甲基化位点)：
TCAGCTGCACCACTCAGGCCAGGCCAGTGGCCTTGGGAGGGGCCTGTGATGCTGGGACCACAGTTCCTGGGCAGGGAGCAACCGTCTAGGCGTGGGGAGAACGCAGGACGTGACCCACACACCGCACTGGAGGCTCCGCTCTGC(SEQ ID NO.1)
上述高甲基化位点分别是片段序列第83、84位的CG以及第109、110位的CG。
3、实验方法
采用重编程技术，制备5例精神分裂症患者和4例正常对照来源的诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)，并将其定向诱导为皮层中间神经元。在这些神经元中验证了精神分裂症患者与正常对照相比，上述基因片段序列甲基化水平显著升高，证明该片段的甲基化水平升高可以作为精神分裂症诊断的生物学标记。
具体方法如下：
a.皮层中间神经元分化方法：参考文献Peiyan Ni,Haneul Noh,Zhicheng Shao,Qian Zhu,Youxin Guan,Joshua J.Park,Fatima Arif,James M.Park,Chiderah Abani,Cameron Beaudreault,Joy S.Park,Elizabeth Berry,Alexander Moghadam,PatricStanton,John N.Hutchinson,Bill Andrews,Clare Faux,John Parnevelas,LeonardM.Eisenberg,Kyungjoon Park,Vadim Y.Bolshakov,Sangmi Chung*,Large-ScaleGeneration and Characterization of Homogeneous Populations of MigratoryCortical Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells.Mol Ther Methods ClinDev,2019,13:414-430.
i.诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)的制备
采用常规技术手段，由受试者来源的皮肤细胞重编程而来。受试者(精神分裂症患者和正常对照)全部来自哈佛医学院Mclean医院，具体信息参考(Mol Psychiatry,2020,25(11):2873–2888.)文章中的部分样本，即文章Figure 3a中HC组(正常对照组)的ID 292、L5、L7和L9，以及SCZ组(精神分裂症患者)的ID 58、285、483、1442和L8。
ii皮层中间神经元定向分化
皮层中间神经元定向分化如图1a所示。
(1)将制备得到的iPSCs第1周培养在KSR培养基(在DMEM培养基中加入20％血清替代物，2mM L-谷氨酰胺和10μMβ-巯基乙醇)中，添加L(LDN193189,100nM)，S(SB431542,10μM)，Sg(SHH信号通路激动剂SAG,0.1μM)及W(Wnt信号通路抑制剂IWP2,5μM)培养，分化当天添加10μM的ROCK抑制剂(Y-27632)。分化后得到神经球。
(2)第2周KSR培养基添加L(LDN193189,100nM)和Sg(SHH信号通路激动剂SAG,0.1μM)；并将神经球转移到spinner条件下培养(80rpm)，得到的3D类胚体大小均一，细胞活力稳定。
(3)第3周使用N2培养基(在DF12培养基中加入2％N2和200μM抗坏血酸)添加Sg(0.1μM)和FGF8(100ng/ml)；三周后即获得神经前体细胞，优化的胰酶(0.5％胰酶，2U/mlTurbo DNA酶，1mM Trehalose)消化后，接种在玻片上，固定后免疫荧光染色鉴定Nkx2.1和Nestin的比例。同时开始为期一周的同步化处理Cultureone(1‰)，DAPT(10μM)和PD0332991(2μM)。
(4)4周后换成B27培养基(在DF12培养基中加入2％B27)添加10ng/ml GDNF和10ng/ml BDNF；8周后即获得皮层中间神经元(cINs)，优化的胰酶(0.5％胰酶，2U/ml TurboDNA酶，1mM Trehalose)消化后，接种在玻片上，固定后免疫荧光染色鉴定GAD，SOX6和β-Tublin的比例。
b.皮层中间神经元的表型鉴定：
采用免疫荧光染色方法对各受试者分化后的皮层中间神经元进行表型鉴定，图1b为典型的染色结果，表1为每个受试来源的iPSC分化的皮层中间神经元每个标记物具体的表达量。结论是精神分裂症患者和正常对照两者之间表型没有差异，说明后续的甲基化水平差异并不是因为细胞表型异常引起的。
表1.每个受试来源的iPSC分化的皮层中间神经元每个标记物具体的表达量
c.在皮层中间神经元中SHANK3基因启动子上述片段序列甲基化水平升高
提取受试者皮层中间神经元的基因组DNA，采用焦磷酸测序方法，对SHANK3基因启动子上述片段序列(SEQ ID NO.1，144bp)进行甲基化测序。结果发现与正常对照相比，精神分裂症患者该片段序列中两个CG位点(片段序列中有下划线标记，分别是片段序列第83、84位的CG以及第109、110位的CG)甲基化水平显著升高，结果展示为柱状图(图1c，图1c中第83、84位的CG为CG1，第109、110位的CG为CG4)。
实施例2、利用生物标记物诊断精神分裂症
除了检测实施例1的皮层中间神经元中SHANK3基因启动子上述片段序列甲基化水平升高；通过检测外周单核细胞中SHANK3基因启动子上述片段序列甲基化水平升高也可以诊断精神分裂症。
综上，本发明研究发现SHANK3基因启动子长度为144bp的片段序列可以作为诊断精神分裂症的生物标记物。与健康人群相比，精神分裂症患者该片段序列第83、84位的CG和第109、110位的CG甲基化水平显著升高。因此，SHANK3基因启动子长度为144bp的片段序列甲基化检测试剂可制备精神分裂症诊断试剂盒，用于精神分裂症早期诊断，具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> SHANK3片段序列甲基化检测试剂在制备精神分裂症诊断试剂盒中的用途
<130> GYKH1970-2021P0113328CCR4
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcagctgcac cactcaggcc aggccagtgg ccttgggagg ggcctgtgat gctgggacca 60
cagttcctgg gcagggagca accgtctagg cgtggggaga acgcaggacg tgacccacac 120
accgcactgg aggctccgct ctgc 144