Alkbh5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用
阅读说明：本技术 Alkbh5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用 (Application of ALKBH5 in early diagnosis, risk assessment or prognosis degree prediction of diabetic retinopathy ) 是由 陈婷婷 万鹏霞 朱文珲 王聪尧 于 2021-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及糖尿病视网膜病变检测技术领域,尤其涉及一种ALKBH5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用。本发明提供了检测ALKBH5蛋白的分子在制备用于糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测的试剂盒或检测试剂中的用途。可实现对DR的早期诊断,特别是在出现视网膜明显病变之前进行早期筛查、评估DM患者出现DR的风险,进行早期干预与宣教。以及评估已经发生DR的患者,其疾病进展的风险和预后情况。(The invention relates to the technical field of diabetic retinopathy detection, in particular to application of ALKBH5 in early diagnosis, risk assessment or prognosis degree prediction of diabetic retinopathy. The invention provides application of a molecule for detecting ALKBH5 protein in preparing a kit or a detection reagent for early diagnosis, risk assessment or prognosis degree prediction of diabetic retinopathy. The early diagnosis of DR can be realized, and especially, early screening is carried out before obvious retinopathy appears, the risk of DM patients appearing DR is evaluated, and early intervention and propaganda and education are carried out. And assessing patients who have developed DR for risk and prognosis of disease progression.)
技术领域
本发明涉及糖尿病视网膜病变检测技术领域，尤其涉及一种ALKBH5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用。
背景技术
糖尿病(DM)是我国常见的内分泌疾病，其患病率随着人口增长、老龄化、经济发展及生活习惯的改变，呈逐年上升趋势，预计到2030年全球范围内DM患病总人数达到3.66亿，而中国将成为DM患者最多的国家。DM所致的组织病理病变可累及多个靶器官并引起多种并发症，其中糖尿病视网膜病变(DR)是DM最常见的并发症之一，也是工作年龄人群的首要致盲疾病。在我国，75％的DM患者在确诊后的15-20年内会出现DR，对患者的视力造成严重影响。因此，深入探索DR临床早期诊治方法，显得尤为重要。诊断方面，目前的筛查方式包括眼底照相、光学相干断层扫描、荧光素眼底血管造影等。
在DR诊断方面，目前的检查和诊断方法如眼底检查、OCT等往往需要待疾病进展到一定程度、眼底出现病变时才能被发现，这些检查方法也难以在早期，尚未出现微血管病变时评估DM患者发生DR的风险，及评估已经发展DR患者的进展风险。早期诊断方法的局限也导致了治疗方案效果的有限性，包括激光光凝、抗血管内皮生长因子玻璃体腔内注射、玻璃体视网膜手术等在内的当前多种治疗手段均是针对已经出现病变的重度及增殖期的DR，并未能从根本上阻止DR的发生和其发展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种ALKBH5在糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种检测ALKBH5蛋白的分子在制备用于糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测的试剂盒或检测试剂中的用途。
本发明的发明人研究发现，DR患者外周血单个核细胞中ALKBH5表达异常上调，通过m6A甲基化修饰降低导致下游一系列炎症相关基因表达异常，介导视网膜局部炎症产生，最终引起DR病理过程进展。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述试剂盒或检测试剂用于外周血液样品的检测。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述试剂盒或检测试剂用于外周血液样品中外周血单个核细胞的ALKBH5表达水平的检测。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述检测ALKBH5蛋白的分子是指能够特异性检测ALKBH5蛋白是否表达的分子。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述能够特异性检测ALKBH5蛋白是否表达的分子为核酸或蛋白质。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述蛋白质为抗体。
作为本发明所述用途的优选实施方式，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明同时提供一种用于糖尿病视网膜病变的早期诊断、风险评估或预后程度预测的试剂盒，所述试剂盒包括检测ALKBH5蛋白的分子。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包含：预包被有ALKBH5抗体的96孔板、96孔板覆膜、ALKBH5蛋白标准品、标准品稀释液、生物素标记抗体、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、TMB底物显色液、终止液、洗涤液和ALKBH5检测数值对应指数表。
本发明的有益效果：
(1)实现对DR的早期诊断，特别是在出现视网膜明显病变之前进行早期筛查。
(2)评估DM患者出现DR的风险，进行早期干预与宣教。
(3)评估已经发生DR的患者，其疾病进展的风险和预后情况。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
外周血单个核细胞是人体内重要的免疫细胞，其功能变化、分子表达改变往往预示着疾病状态的发生和发展。既往已有许多研究证实，外周血单个核细胞功能异常或某些标志基因表达的改变，是疾病早期重要标志，可用于临床疾病的早期诊治中。
m6A甲基化修饰是重要RNA表达调控机制，主要指RNA腺嘌呤第6位氮原子上连接的一个氢原子被甲基基团所取代，从而影响RNA的表达、剪切和翻译等多个层面，广泛参与细胞的分化与功能。作为一个RNA去甲基化酶，ALKBH5主要发挥“擦除”基因中m6A甲基化修饰的作用，进而降低mRNA的m6A甲基化修饰水平。
实施例1
本发明的发明人研究发现，DR患者外周血单个核细胞中ALKBH5表达异常上调，通过m6A甲基化修饰降低导致下游一系列炎症相关基因表达异常，介导视网膜局部炎症产生，最终引起DR病理过程进展。
具体实验过程如下：
(1)我们首先抽取DR患者外周血，并以正常人外周血作为对照，使用ficoll法分离其中的单个核细胞，随后通过trizol法提取外周血单个核细胞的RNA并进行逆转录，通过定量PCR法检测ALKBH5表达和炎症相关基因表达。
(2)通过上述方法提取RNA，通过RIP实验检测炎症相关基因的m6A甲基化修饰水平，利用RNAi技术和过表达技术在外周血单个核细胞中敲除/过表达ALKBH5，进而检测炎症相关基因的m6A甲基化修饰水平和表达水平。
实施例2
我们进一步探索外周血单个核细胞中m6A修饰水平和ALKBH5表达水平在DR患者早期诊断和预后评估中的价值。通过制备ELISA试剂盒，我们对DR大鼠模型的外周血单个核细胞的m6A甲基化水平和ALKBH5表达水平进行检测，结果发现对比正常大鼠，DR大鼠外周血单个核细胞中m6A甲基化水平在建模后1周开始降低，在8周时降低最为明显；而ALKBH5表达在建模后1周就开始升高，且在4周时达到峰值，而DR大鼠视网膜在建模后8周才可以观察到病变。此外，m6A甲基化水平与其视网膜病变严重程度呈负相关关系。具体实验过程如下：
(1)DR大鼠模型的制备
8周雄性SPF级SD大鼠，适应性饲养1周后进行建模。糖尿病组建模前禁食16h，称重空腹体重，尾静脉取血测定血糖浓度，一次性腹腔注射链脲佐菌素STZ(65mg/kg)，72h、96h、120h后应用稳步血糖测定仪检测随机血糖，测定体重，观察一般情况如体型及毛发颜色变化。每组取尾静脉血测量血糖，连续3次血糖≥16.7mmol/L，并出现典型的“三多一少”症状者，即可确定为糖尿病模型。
(2)检测DR大鼠和正常大鼠中m6A甲基化水平和ALKBH5表达水平
采用断尾法收集大鼠血清，按照上述方法分离外周血单个核细胞并提取RNA进行逆转录，通过荧光定量PCR法检测ALKBH5表达水平，通过m6A甲基化检测试剂盒检测其总m6A甲基化水平。
实施例3
我们进一步采集DR患者外周血单个核细胞，检测其m6A甲基化水平和ALKBH5表达水平，结果提示对比正常对照和不伴DR的DM患者，DR患者的m6A甲基化水平明显降低、ALKBH5表达明显升高，且与其视网膜病变严重程度明显相关。这些结果提示外周血单个核细胞的m6A甲基化修饰水平和ALKBH5表达水平可以作为DR的早期诊断和预后评估指标。具体实验过程如下：
筛选正常人、不伴DR的DM患者、患有DR的DM患者，按照上述方法分离外周血单个核细胞，提取其RNA并进行逆转录，通过荧光定量PCR法检测ALKBH5表达水平，并与患者视网膜病变评分进行相关性分析。
实施例4 m6A甲基化修饰检测试剂盒及其制备
(1)m6A甲基化修饰检测试剂盒的组成
96孔板、96孔板覆膜、m6A结合抗体、m6A结合溶液、m6A修饰片段标准品、标准品稀释液、生物素标记抗体、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、TMB底物显色液、终止液、洗涤液、m6A甲基化检测数值对应指数表。
(2)m6A试剂盒制备步骤
①96孔板包被：配置pH＝9.6的碳酸盐缓冲液，加入m6A结合溶液500ul，同时加入待测样本1ml，于4℃孵育过夜。弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟。
②标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液配置：吸取100ml PBS缓冲液，加入0.1g BSA，充分混匀。
③洗涤液配置：1000ml PBS缓冲液，加入1ml Tween溶液，充分混匀。
④终止液：配置2mol/L硫酸溶液，室温静置备用。
实施例5 ALKBH5检测试剂盒及其制备
(1)ALKBH5检测试剂盒的组成
预包被有ALKBH5抗体的96孔板、96孔板覆膜、ALKBH5蛋白标准品、标准品稀释液、生物素标记抗体、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、TMB底物显色液、终止液、洗涤液、ALKBH5检测数值对应指数表。
(2)ALKBH5试剂盒制备步骤
①96孔板抗体包被：配置pH＝9.6的碳酸盐缓冲液，稀释ALKBH5抗体至5ug/ml，每孔加入0.2ml，于4℃孵育过夜。弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，每次3分钟。
②标准品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液配置：吸取100ml PBS缓冲液，加入0.1g BSA，充分混匀。
③洗涤液配置：1000ml PBS缓冲液，加入1ml Tween溶液，充分混匀。
④终止液：配置2mol/L硫酸溶液，室温静置备用。
实施例6检测m6A甲基化修饰和ALKBH5的方法
(1)抽取DR患者外周血5ml，加入ficoll溶液，10000×g离心15min，留取中间白膜层，用反复液氮冻融法进行裂解。
(2)从试剂盒取一支标准品，10000rpm离心1min，用1ml样本稀释液溶解，通过倍比稀释法进行稀释7次(15.6-1000ng)。
(3)每孔加入标准品或检测样品(ALKBH5试剂盒)或m6A抗体溶液(m6A试剂盒)100ul，贴上覆膜，于摇床室温孵育2h。
(4)弃去液体，每孔加入洗涤液200ul，洗涤3次，每次1min。
(5)用生物素标记抗体稀释液溶解稀释生物素标记抗体，每孔加入100ul，于摇床室温孵育1h。
(6)同步骤(4)。
(7)用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液溶解稀释辣根过氧化物酶标记亲和素，每孔加入100ul，于摇床室温孵育1h。
(8)同步骤(4)。
(9)每孔加入TMB底物显色液100ul，室温避光孵育30min。
(10)每孔加入终止液50ul。
(11)通过酶标仪在450nm波长检测各孔光密度，通过拟合标准曲线计算出实际数值。
结果分析：
(1)检测范围：0.1-100ng/ml。
(2)特异性：与其他RNA甲基化修饰和m6A相关酶等无交叉反应。
(3)回收率：
样本
回收率范围(％)
平均回收率(％)
血清(n＝10)
100-106
103
血浆(n＝10)
82-93
88
细胞培养上清(n＝10)
85-94
90
(4)线性：
(5)准确性：批内差CV<6.4％，批间差CV<5.8％
(6)研究结果
表1 m6A检测数值对应指数
表2 ALKBH5检测数值对应指数
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。