用于治疗氧化应激相关疾病的硝唑尼特和噻唑化物
阅读说明：本技术 用于治疗氧化应激相关疾病的硝唑尼特和噻唑化物 (Nitazoxanide and thiazolide for the treatment of diseases associated with oxidative stress ) 是由 尼古拉斯·斯坦科维奇-瓦伦丁 克林内·富卡尔 佩吉·帕罗什 罗伯特·瓦尔恰克 于 2020-04-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及硝唑尼特或其类似物的新用途。(The invention relates to a new application of nitazoxanide or analogues thereof.)
技术领域
本发明涉及硝唑尼特或其类似物的新用途。
背景技术
[2-[(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)氨基甲酰基]苯基]乙酸酯(或硝唑尼特，或NTZ)，首次发表于1975(Rossignol和Cavier 1975)，是一种在美国被批准用于治疗由原生动物寄生虫小隐孢子虫(Crystosporidium parvum)和肠贾第虫(Giardia intestinalis)引起的腹泻的药物。NTZ 在拉丁美洲和印度也已商业化，在那里它被指示用于治疗广谱的肠道寄生虫感染。所提出的NTZ发挥其抗寄生虫活性的作用机制是通过抑制丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)依赖性电子转移反应，该反应对厌氧代谢必不可少(Hoffman，Sisson等人2007)。NTZ还表现出抗结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的活性，结核分枝杆菌不具有PFOR的同源物，因此提示了别的作用机制。事实上，作者表明 NTZ也可以作为解偶联剂破坏膜电位和生物体内pH稳态(de Carvalho， Darby等人2011)。
NTZ的药理效应不局限于它的抗寄生虫或抗菌活性，近年来，若干研究揭示，NTZ还可以通过多种方式，包括阻断血凝素(流感)或 VP7(轮状病毒)蛋白的成熟、或激活参与先天免疫反应的蛋白PKR，来干扰病毒复制从而赋予抗病毒活性(综述参见Rossignol 2014)。NTZ 还显示出通过干扰关键性代谢和促死亡信号传导途径而具有抗癌性质 (Di Santo和Ehrisman 2014)。
本申请人最近还表明NTZ具有抗纤维化性质(WO2017178172)，并且目前在评估它对患有NASH诱发的2或3期纤维化的人群的影响。
发明内容
本发明人在本文中表明NTZ具有抗氧化性质，这开辟了新的治疗机会。
本发明源于发明人做出的令人意外的观察，即NTZ激活不同谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的表达。GST是一个酶家族，其通过催化许多疏水性和亲电子性化合物与还原型谷胱甘肽的结合，在解毒中发挥重要作用。GST在保护细胞免受活性氧类和过氧化产物方面具有特别的作用。因此，它们的活化可以有利地用于保护细胞、组织和器官对抗氧化应激。
对由NTZ诱导的肝脏转录组学特征的补充分析揭示了在Nrf2控制下的基因子集(包括GST酶)的富集，Nrf2是细胞内氧化还原稳态的转录主调节因子。体外分析在功能水平上证实了TZ(NTZ的活性代谢物)诱导Nrf2-ARE信号传导途径的能力。此外，证明了TZ能够在氧化应激下在人肝细胞中维护GSH(还原型谷胱甘肽)池，GSH是肝脏中最丰富的抗氧化剂。总之，这些数据证明了NTZ的出乎意料的抗氧化能力。
因此，本发明的一个方面涉及一种如下定义的式(I)的化合物，所述化合物包括NTZ及其类似物，或式(I)的化合物的可药用盐，其用作抗氧化剂。在一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物或其可药用盐因其肝脏抗氧化特性而被使用。
本发明的另一个方面涉及一种式(I)的化合物或其可药用盐，以供在治疗牵涉氧化应激的疾病的方法中使用。牵涉氧化应激的疾病是本领域技术人员公知的，他们可以参考包括de Araujo等人在内的许多其它资源(de Araújo，Martins等人2016)。例如，可受益于本发明的对象包括但不限于患有神经系统障碍例如中枢神经系统障碍、代谢病症、心血管疾病、白内障、动脉粥样硬化、缺血例如心肌缺血、缺血性脑损伤、肺缺血-再灌注损伤、硬皮病和中风、炎症例如炎性肠病、类风湿性关节炎、呼吸系统疾病、自身免疫病、肾病和皮肤病症的那些对象。
术语“治疗”是指对有需要的对象的疾病进行治愈性或预防性治疗。治疗包括将本发明的化合物施用于患有所宣布的疾病的对象，以预防、治愈、延迟、逆转或减缓疾病的进展，从而改善对象的状况。因此，本发明还涉及一种式(I)的化合物或其可药用盐，以供在预防、治愈、延迟、逆转或减缓疾病进展的方法中使用。本发明的化合物也可以施用于健康的或有患病风险的对象。待治疗的对象是哺乳动物，优选人类。可以基于与寻求治疗的特定疾病相关的若干标准，例如先前的药物治疗、相关病理、基因型、对风险因子的暴露、病毒感染，以及基于与疾病相关的任何生物标志物的检测，来选择本发明的待治疗对象。
另外，本发明涉及一种式(I)化合物或其可药用盐，以供在治疗疾病相关的氧化应激的方法中使用，所述疾病特别是选自神经系统障碍例如中枢神经系统障碍、代谢病症、心血管疾病、白内障、动脉粥样硬化、缺血例如心肌缺血、缺血性脑损伤、肺缺血-再灌注损伤、硬皮病和中风、炎症例如炎性肠病、类风湿性关节炎、呼吸系统疾病、自身免疫病、肝病、肾病、皮肤病症、感染和癌症的疾病。
神经系统障碍包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、迟发性运动障碍、癫痫、和中枢神经系统的急性疾病例如脊髓损伤和/ 或脑外伤。
代谢病症包括但不限于肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常、糖耐量受损、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病如1型或2型糖尿病。代谢病症还包括代谢综合征。
在一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物或其可药用盐用于治疗感染诱导的氧化应激的方法中，所述感染诱导的氧化应激例如病毒诱导的氧化应激，特别是人类免疫缺陷病毒诱导的氧化应激、流感病毒诱导的氧化应激、HBV诱导的氧化应激、丙型肝炎病毒诱导的氧化应激、脑心肌炎病毒诱导的氧化应激、呼吸道合胞病毒诱导的氧化应激和登革热病毒诱导的氧化应激。
本发明还涉及一种式(I)的化合物或其可药用盐，以供在治疗肝病相关的氧化应激的方法中使用。因此，所述式(I)的化合物可用于治疗肝病相关的氧化应激的方法中。特别地，待治疗的对象可能患有肝硬化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、NAFLD伴肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、NASH伴肝纤维化或NASH伴肝硬化。因此，本发明还涉及一种式(I)的化合物或其可药用盐，以供在治疗肝硬化相关的氧化应激、NAFLD相关的氧化应激、NAFLD伴肝纤维化相关的氧化应激、NASH相关的氧化应激、NASH伴肝纤维化相关的氧化应激或NASH伴肝硬化相关的氧化应激的方法中使用。在另一个特定实施方式中，待治疗的对象患有NAFLD、NAFLD伴肝纤维化、NASH或 NASH伴肝纤维化。因此，在本发明的一个特定实施方式中，式(I)的化合物或其可药用盐用于治疗NAFLD相关的氧化应激、NAFLD伴肝纤维化相关的氧化应激、NASH相关的氧化应激或NASH伴肝纤维化相关的氧化应激的方法中。
本发明还涉及一种治疗肝病相关的氧化应激的方法，其中所述方法包括向需要治疗肝病的对象施用治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。在本发明方法的一个特定实施方式中，所述对象患有肝硬化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、NAFLD伴肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、NASH伴肝纤维化或NASH伴肝硬化。
在一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物或其可药用盐用于治疗癌症相关的氧化应激的方法中，所述癌症特别是肝癌，更特别是肝细胞癌(HCC)。
本发明还涉及一种治疗癌症、特别是肝癌、例如肝细胞癌相关的氧化应激的方法，其中所述方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的式(I)的化合物或其可药用盐。
本发明所用的化合物是式(I)的化合物：
其中：
R1表示氢原子，氘原子，卤素原子，(C6-C14)芳基基团，杂环基团，(C3-C14)环烷基基团，(C1-C6)烷基基团，磺酰基基团，亚砜基团， (C1-C6)烷基羰基基团，(C1-C6)烷氧基，羧酸基团，羧酸酯基团，硝基基团(NO2)，氨基基团(NH2)，(C1-C6)烷基氨基基团，酰胺基团，(C1-C6)烷基酰胺基团，或(C1-C6)二烷基酰胺基团；
R2表示氢原子，氘原子，NO2基团，(C6-C14)芳基基团，杂环基团，卤素原子，(C1-C6)烷基基团，(C3-C14)环烷基基团，(C2-C6)炔基基团，(C1-C6)烷氧基基团，(C1-C6)烷硫基基团，(C1-C6)烷基羰基基团，(C1-C6)烷基羰基氨基基团，(C6-C14)芳基羰基氨基基团，羧酸或羧酸酯基团，酰胺基团，(C1-C6)烷基酰胺基团，(C1-C6)二烷基酰胺基团，NH2基团，或(C1-C6)烷基氨基基团；
或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成取代或未取代的5- 至8-元的环烷基、杂环或芳基基团；
R3、R4、R5、R6和R7相同或不同地表示氢原子，氘原子，卤素原子，羟基基团，(C1-C6)烷基羰基基团，(C1-C6)烷基基团，(C1-C6) 烷氧基基团，(C1-C6)烷硫基基团，(C1-C6)烷基羰氧基基团，(C6-C14) 芳氧基基团，(C6-C14)芳基基团，杂环基团，(C3-C14)环烷基基团，NO2 基团，磺酰氨基烷基基团，NH2基团，氨基(C1-C6)烷基基团，(C1-C6) 烷基羰基氨基基团，羧酸基团，羧酸酯基团，或R9基团；
R9表示O-R8基团，或选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸的氨基酸，或式(A)的部分：
其中R’表示(C1-C6)烷基基团，(C2-C6)烯基基团，(C2-C6)炔基基团，(C3-C14)环烷基基团，(C3-C14)环烷基烷基基团，(C3-C14)环烷基 (C2-C6)烯基基团，(C3-C14)环烯基基团，(C3-C14)环烯基(C1-C6)烷基基团，(C3-C14)环烯基(C2-C6)烯基基团或(C3-C14)环烯基(C2-C6)炔基基团；其中R”和R”’独立地表示氢原子，(C1-C6)烷基基团，或氮保护基团；并且
R8表示氢原子、氘原子、葡糖醛酸基基团或基团，其中R8a、R8b和R8c相同或不同地表示氢原子或氘原子。
在另一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物如下：
R1表示氢原子，氘原子，卤素原子，(C6-C14)芳基基团，杂环基团，(C3-C14)环烷基基团，(C1-C6)烷基基团，磺酰基基团，亚砜基团， (C1-C6)烷基羰基基团，(C1-C6)烷氧基，羧酸基团，羧酸酯基团，NO2基团，NH2基团，(C1-C6)烷基氨基基团，酰胺基团，(C1-C6)烷基酰胺基团，或(C1-C6)二烷基酰胺基团；
R2表示氢原子，氘原子，NO2基团，(C6-C14)芳基基团，杂环基团，卤素原子，(C1-C6)烷基基团，(C3-C14)环烷基基团，(C2-C6)炔基基团，(C1-C6)烷氧基基团，(C1-C6)烷硫基基团，(C1-C6)烷基羰基基团，(C1-C6)烷基羰基氨基基团，(C6-C14)芳基羰基氨基基团，羧酸或羧酸酯基团，酰胺基团，(C1-C6)烷基酰胺基团，(C1-C6)二烷基酰胺基团，NH2基团，或(C1-C6)烷基氨基基团；
或R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成取代或未取代的5- 至8-元的环烷基、杂环或芳基基团；
R3表示氢原子，氘原子，卤素原子，O-R8基团，(C1-C6)烷基羰基基团，(C1-C6)烷基基团，(C1-C6)烷氧基基团，(C1-C6)烷硫基基团， (C1-C6)烷基羰氧基基团，(C6-C14)芳氧基基团，(C6-C14)芳基基团，杂环基团，(C3-C14)环烷基基团，NO2，磺酰氨基烷基基团，NH2基团，氨基(C1-C6)烷基基团，(C1-C6)烷基羰基氨基基团，羧酸基团，羧酸酯基团，选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸的氨基酸，或式(A)的部分：
其中R’表示(C1-C6)烷基基团，(C2-C6)烯基基团，(C2-C6)炔基基团，(C3-C14)环烷基基团，(C3-C14)环烷基烷基基团，(C3-C14)环烷基 (C2-C6)烯基基团，(C3-C14)环烯基基团，(C3-C14)环烯基(C1-C6)烷基基团，(C3-C14)环烯基(C2-C6)烯基基团，或(C3-C14)环烯基(C2-C6)炔基基团；其中R”和R”’独立地表示氢原子，(C1-C6)烷基基团，或氮保护基团；
R8表示氢原子，氘原子，或基团，其中R8a、R8b 和R8c相同或不同地表示氢原子或氘原子；并且
R4、R5、R6和R7相同或不同地表示氢原子，氘原子，卤素原子，羟基基团，(C1-C6)烷基羰基基团，(C1-C6)烷基基团，(C1-C6)烷氧基基团，(C1-C6)烷硫基基团，(C1-C6)烷基羰氧基基团，(C6-C14)芳氧基基团，(C6-C14)芳基基团，杂环基团，(C3-C14)环烷基基团，NO2，磺酰氨基(C1-C6)烷基基团，NH2基团，氨基(C1-C6)烷基基团，(C1-C6) 烷基羰基氨基基团，羧酸基团，羧酸酯基团，选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸的氨基酸，或式(A)的部分：
其中R’表示(C1-C6)烷基基团，(C2-C6)烯基基团，(C2-C6)炔基基团，(C3-C14)环烷基基团，(C3-C14)环烷基(C1-C6)烷基基团，(C3-C14) 环烷基(C1-C6)烯基基团，(C3-C14)环烯基基团，(C3-C14)环烯基(C1-C6) 烷基基团，(C3-C14)环烯基(C2-C6)烯基基团，(C3-C14)环烯基(C2-C6) 炔基基团；R”和R”’独立地表示氢原子，(C1-C6)烷基基团，或氮保护基团。
在一个特定实施方式中，在本发明的式(I)的化合物中：
烷基基团可以是取代或未取代的(C1-C6)烷基基团，特别是取代或未取代的(C1-C4)烷基基团；
炔基基团可以是取代或未取代的(C2-C6)炔基基团；
环烷基基团可以是取代或未取代的(C3-C14)环烷基基团
烷氧基基团可以是取代或未取代的(C1-C6)烷氧基基团，例如取代或未取代的(C1-C4)烷氧基基团；
烷硫基基团可以是取代或未取代的(C1-C6)烷硫基基团，例如取代或未取代的(C1-C4)烷硫基基团；
烷基氨基基团可以是(C1-C6)烷基氨基基团，例如(C1-C4)烷基氨基基团；
二烷基氨基基团可以是(C1-C6)二烷基氨基基团，例如(C1-C4)二烷基氨基基团；
芳基基团可以是取代或未取代的(C6-C14)芳基基团，例如取代或未取代的(C6-C14)芳基基团；
杂环基团可以是取代或未取代的杂环烷基或杂芳基基团。
氮保护基团是本领域技术人员公知的，例如在文献中、如例如在“格林氏有机合成中的保护基团(Greene's Protective Groups in Organic Synthesis)”(Wuts和Greene2007)一书中描述的那些。
在一个
具体实施方式
中，所述式(I)的化合物是式(II)的化合物：
其中R9表示氢原子，氘原子，O-R8基团(R8的定义如上)，或选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸的氨基酸，或式(A)的部分：
其中R’表示(C1-C6)烷基基团，(C2-C6)烯基基团，(C2-C6)炔基基团，(C3-C14)环烷基基团，(C3-C14)环烷基(C1-C6)烷基基团，(C3-C14) 环烷基(C1-C6)烯基基团，(C3-C14)环烯基基团，(C3-C14)环烯基(C1-C6) 烷基基团，(C3-C14)环烯基(C2-C6)烯基基团，或(C3-C14)环烯基(C2-C6) 炔基基团；其中R”和R”’独立地表示氢原子，(C1-C6)烷基基团，或氮保护基团。
在一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物选自：
-NTZ：
-替唑尼特(TZ)：
和
-葡糖苷酸替唑尼特(TZG)：
在另一个实施方式中，式(II)的化合物是这样的
R8a、R8b和R8c相同或不同地表示氢原子或氘原子；和/或
R1、R3、R4、R5和R6相同或不同地表示氢原子或氘原子，条件是R1、R2、R8a、R8b、R8c、R3、R4、R5和R6不同时是氢原子。
在一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物是[(5-硝基-1,3-噻唑-2- 基)氨基甲酰基]苯基(d3)乙酸酯，2-[(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)氨基甲酰基]苯基(d2)乙酸酯；或2-[(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)氨基甲酰基]苯基(d1) 乙酸酯。
在另一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物是2-氨基-3,3-二甲基丁酸2-(5-硝基噻唑-2-基氨基甲酰基)苯酯，特别是(S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酸2-(5-硝基噻唑-2-基氨基甲酰基)苯酯，或其可药用盐，例如下式的盐酸盐(RM5061)：
在另一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物是2-氨基-3-甲基戊酸2-(5-硝基噻唑-2-基氨基甲酰基)苯酯，特别是(2S,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸2-(5-硝基噻唑-2-基氨基甲酰基)苯酯，或其可药用盐，例如下式的盐酸盐(RM5066)：
在另一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物是2-氨基-3,3-二甲基丁酸2-(5-氯噻唑-2-基氨基甲酰基)苯酯，特别是(S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酸2-(5-氯噻唑-2-基氨基甲酰基)苯酯，或其可药用盐，例如下式的盐酸盐(RM5064)：
在另一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物是2-氨基-3-甲基戊酸2-(5-氯噻唑-2-基氨基甲酰基)苯酯，特别是(2S,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸2-(5-氯噻唑-2-基氨基甲酰基)苯酯，或其可药用盐，例如下式的盐酸盐(RM5065)：
在一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物是NTZ、TZ、TZG或其可药用盐。在另一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物是NTZ或 TZ或其可药用盐。在一个优选的实施方式中，所述式(I)的化合物是 NTZ或其可药用盐。
在一个特定实施方式中，本发明涉及一种治疗肝病相关的氧化应激的方法，其中所述方法包括向需要治疗肝病的对象施用治疗有效量的NTZ和/或TZ或其可药用盐。在一个特定实施方式中，所述对象被施用NTZ或其可药用盐。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种治疗肝纤维化相关的氧化应激的方法，其中所述方法包括向需要治疗肝纤维化的对象施用治疗有效量的NTZ和/或TZ或其可药用盐。在一个特定实施方式中，所述对象被施用NTZ或其可药用盐。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种治疗肝硬化相关的氧化应激的方法，其中所述方法包括向需要治疗肝硬化的对象施用治疗有效量的NTZ和/或TZ或其可药用盐。在一个特定实施方式中，所述对象被施用NTZ或其可药用盐。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种治疗NAFLD相关的氧化应激的方法，其中所述方法包括向需要治疗NAFLD的对象施用治疗有效量的NTZ和/或TZ或其可药用盐。在一个特定实施方式中，所述对象被施用NTZ或其可药用盐。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种治疗NAFLD伴肝纤维化相关的氧化应激的方法，其中所述方法包括向需要治疗NAFLD伴肝纤维化的对象施用治疗有效量的NTZ和/或TZ或其可药用盐。在一个特定实施方式中，所述对象被施用NTZ或其可药用盐。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种治疗NASH相关的氧化应激的方法，其中所述方法包括向需要治疗NASH的对象施用治疗有效量的NTZ和/或TZ或其可药用盐。在一个特定实施方式中，所述对象被施用NTZ或其可药用盐。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种治疗NASH伴肝纤维化相关的氧化应激的方法，其中所述方法包括向需要治疗NASH伴肝纤维化的对象施用治疗有效量的NTZ和/或TZ或其可药用盐。在一个特定实施方式中，所述对象被施用NTZ或其可药用盐。
NTZ或类似物的合成可以例如如(Rossignol和Cavier 1975)中所述进行，或通过本领域技术人员已知的任何其它合成方式进行。
所述式(I)的化合物可以与可药用的载体一起包含在药物组合物中。这些药物组合物还可以包含一种或多种赋形剂或介质，所述赋形剂或介质是在药物环境(例如与药物用途相容并且是本领域普通技术人员公知的盐溶液、生理溶液、等渗溶液等)中可接受的。这些组合物还可包含一种或若干种选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等中的试剂或介质。可用于这些制剂(液体和/或注射剂和/或固体)的试剂或介质特别是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨醇酯80、甘露醇、明胶、乳糖、植物油、阿拉伯胶、脂质体等。所述组合物可以用于肠内或胃肠外施用。例如，可以配制所述式(I)的化合物用于口服、血管内(例如静脉内或动脉内)、肌内、腹腔内、皮下、经皮或鼻内施用。所述组合物可以是固体或液体剂型。说明性的制剂包括但不限于可注射悬浮液、口服混悬液、凝胶、油、软膏、丸剂、片剂、栓剂、粉剂、凝胶帽、胶囊、气雾剂、软膏、乳膏、贴剂、或盖仑形式或装置的工具以确保延长和/或缓慢释放。对于这种制剂，可以有利地使用诸如纤维素、碳酸盐或淀粉的试剂。
所述式(I)的化合物可以配制为可药用的盐，特别是与药学用途相容的酸或碱盐。式(I)化合物的盐包括可药用的酸加成盐、可药用的碱加成盐、可药用的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。这些盐可以在化合物的最终纯化步骤期间获得，或者通过将所述盐纳入先前纯化的化合物中获得。
根据一个具体实施方式，本发明的组合物包含至少一种式(I)的化合物作为活性成分、以及可接受的赋形剂。例如，本发明的组合物包含两种式(I)的化合物NTZ和TZ的组合作为活性成分。
有关施用的频率和/或剂量可以由本领域普通技术人员针对待治疗的对象、病理、施用形式等进行调整。通常，所述式(I)的化合物，特别是NTZ或可药用盐，可以按0.01mg/天至4000mg/天之间的剂量施用，所述剂量例如50mg/天至2000mg/天，特别是100mg/天至1000mg/天，更特别是500mg/天至1000mg/天。
在另一个优选的实施方式中，所述式(I)的化合物，优选NTZ或其可药用盐，以旨在用于口服摄取的丸剂或片剂形式施用。在另一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物，优选NTZ或其可药用盐，以旨在用于口服摄取的悬浮液形式施用。
在另一个方面，本发明涉及一种治疗疾病的方法，所述方法包括施用NTZ或其药用盐，其中NTZ以500mg/天至1000mg/天之间的剂量施用，其中所述疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、迟发性运动障碍、癫痫、中枢神经系统的急性疾病如脊髓损伤和/或脑外伤、肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常、糖耐量受损、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病如1型或2型糖尿病、代谢综合征、人类免疫缺陷病毒诱导的氧化应激、流感病毒诱导的氧化应激、HBV诱导的氧化应激、丙型肝炎病毒诱导的氧化应激、脑心肌炎病毒诱导的氧化应激、呼吸道合胞病毒诱导的氧化应激、登革热病毒诱导的氧化应激、肝硬化相关的氧化应激、NAFLD相关的氧化应激、NAFLD相关的氧化应激伴肝纤维化、NASH相关的氧化应激、NASH相关的氧化应激伴肝纤维化、心肌缺血、缺血性脑损伤、肺缺血-再灌注损伤、硬皮病、中风、炎性肠病和类风湿性关节炎。
在另一个方面，本发明涉及一种治疗疾病的方法，所述方法包括施用NTZ或其药用盐，其中NTZ以500mg/天至1000mg/天之间的剂量施用，其中所述疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、迟发性运动障碍、癫痫、中枢神经系统的急性疾病如脊髓损伤和/或脑外伤、肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常、糖耐量受损、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病如1型或2型糖尿病、代谢综合征、人类免疫缺陷病毒诱导的氧化应激、流感病毒诱导的氧化应激、HBV诱导的氧化应激、丙型肝炎病毒诱导的氧化应激、脑心肌炎病毒诱导的氧化应激、呼吸道合胞病毒诱导的氧化应激、登革热病毒诱导的氧化应激、NAFLD相关的氧化应激、NAFLD相关的氧化应激伴肝纤维化、NASH相关的氧化应激、NASH相关的氧化应激伴肝纤维化、心肌缺血、缺血性脑损伤、肺缺血-再灌注损伤、硬皮病、中风、炎性肠病和类风湿性关节炎。
如有必要，可以每天一次或甚至每天数次施用。治疗的持续时间将取决于待治疗的具体疾病。例如，所述施用可以在一天或几天期间进行，例如至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天或至少七天期间进行。或者，所述施用可以进行至少一周、至少两周、至少四周。对于慢性疾病，可以考虑施用多于4周，例如至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或多于六个月，例如至少一年或几年。在一些情况下，本发明的组合产品可以在对象的一生中施用。
参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
附图说明
图1：长期口服施用NTZ有助于抗氧化防御机制。
给6周龄的C57BL/6小鼠喂食对照(CSAA)饲料、CDAA+1％胆固醇(CDAA/c)饲料或补充有NTZ 100mg/kg/天的CDAA/c饲料，为期12周。处死后，通过免疫化学确定4-HNE水平并定量(图A)。各组的4-HNE染色的代表性图像显示在图B上(放大倍数x300)。
图2：长期口服施用NTZ在mRNA水平上诱导GSTA1(A)和 GSTA2(B)的肝表达。
给6周龄的C57BL/6小鼠喂食对照(CSAA)饲料、CDAA+1％胆固醇(CDAA/c)饲料或补充有NTZ 100mg/kg/天的CDAA/c饲料，为期12周。处死后，通过RNAseq分析肝GSTa mRNA的肝水平并确定计数水平。
图3：长期口服施用NTZ在mRNA水平上诱导GSTA4的肝表达。
给6周龄的C57BL/6小鼠喂食对照(CSAA)饲料、CDAA+1％胆固醇(CDAA/c)饲料或补充有NTZ 100mg/kg/天的CDAA/c饲料，为期12周。处死后，通过RNAseq分析GSTA4 mRNA的肝水平并确定归一化计数水平。
图4：由NTZ差异诱导的基因显著富集在Nrf2靶基因中。给6周龄的C57BL/6小鼠喂食对照(CSAA)饲料、CDAA+1％胆固醇(CDAA/c)饲料或补充有NTZ 100mg/kg/天的CDAA/c饲料，为期12 周。处死后，通过RNAseq分析转录组。计算Nrf2靶基因在RNA-seq 鉴定的全转录组(27636个基因)中的比例，并与在NTZ+CDAA/c相对于CDAA/c条件下差异表达的基因子集中Nrf2靶基因的比例进行比较。
图5：TZ在人肝细胞中诱导Nrf2-ARE(抗氧化应答元件)信号传导。在用TZ处理的HepG2细胞中测量抗氧化应答元件(Antioxidant response element，ARE)介导的荧光素酶活性。DL-萝卜硫素 (DL-Sulforaphane，DLS)用作参比化合物。
图6：在暴露于氧化应激诱导剂甲萘醌的人肝细胞中，TZ防止谷胱甘肽(GSH)耗尽。
在存在或不存在TZ的情况下，在甲萘醌应激的肝细胞中通过硫醇追踪剂(ThiolTracker Violet染料)监测细胞内GSH水平。N-乙酰半胱氨酸(NAC)用作阳性对照。
具体实施方式
实施例
在纤维化NASH的长期CDAA+1％胆固醇模型(12周)中评价硝唑尼特
实验设计
鉴于氧化应激在NASH发病机理中的突出作用，我们在CDAA/c 饲料诱导的NASH模型中评价了NTZ防止氧化还原稳态失调的能力。
胆碱缺乏和L-氨基酸限定的(CDAA)饲料缺乏胆碱，胆碱对肝β-氧化和极低密度脂蛋白产生必不可少的，并且被认为诱导肝细胞脂肪变性。随后，脂质过氧化和氧化应激引起小叶炎症，广泛导致纤维化。
在目前的研究中，在鼠模型中评估NTZ 100mg/kg/天的预防效果。给6周龄的C57Bl/6J雄性小鼠喂食对照(CSAA)饲料(n＝8)、CDAA +1％胆固醇饲料(n＝12)或补充有NTZ 100mg/kg/天的CDAA/c+1％胆固醇饲料(n＝8)，为期12周。所述食料购自公司(Soest，德国)。硝唑尼特(Interchim，Ref#RQ550)通过将以粉末形式加入CDAA+1％胆固醇饲料中至所需剂量来并入。
每周两次监测体重和食物摄入。在处理的最后一天，在6小时禁食期后处死小鼠。迅速切除肝脏用于转录组学和组织学研究。
所有动物程序均按照标准规程并按照正确护理和使用实验室动物的标准建议进行。
转录组学研究
RNA提取
使用96试剂盒(Macherey Nagel)，按照制造商的说明，分离肝总RNA。在RT缓冲液1x(Invitrogen，目录号P/NY02321)、 1mM DTT(Invitrogen，目录号P/NY00147)、0.5mM dNTP(Promega)、 200ng pdN6(Roche，目录号11034731001)和40U核糖核酸酶抑制剂 (Promega，目录号N2515)的存在下，使用M-MLV-RT(莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶)(Invitrogen，目录号28025)，将150ng总RNA 逆转录为cDNA。
RNA测序：
通过nanodrop测量RNA样品浓度后，使用生物分析仪评估其量。使用IlluminaTruSeq stranded mRNA LT试剂盒制备文库，并使用具有高通量流动槽的NextSeq 500设备(末端配对序列，2x75 bp)测序 mRNA。
RNA-seq数据分析：
使用Trimmomatic v.0.36用以下参数清理读数： SLIDINGWINDOW:5:20LEADING:30TRAILING:30MINLEN:60。然后用rnacocktail，使用hisat2 v.2.1.0作为比对器，以默认参数在参比基因组(小家鼠(Mus musculus)GRCm38.90)上比对读数。
使用featureCounts v1.5.3，以默认参数生成计数表。
为了鉴定差异表达的基因(DE基因)，我们使用了R(3.4.3版) 和DESEq2文库(1.18.1版)。使用AnnotationDbi文库(1.40.0版) 检索基因注释。简而言之，将FeatureCounts生成的计数矩阵(count matrix)通过来自DESeq2文库的DESeqDataSetFromMatrix()函数继之以DEseq()函数进行分析。对于每个条件(即比较NTZ+CDAA/c与 CDAA/c)，使用DESeq2中的results()函数检索倍数变化和p值。不同的表使用Ensembl ID作为键(key)进行合并。
为了评估Nrf2对NTZ诱导的转录组重塑的作用，通过合并来自 Hayes和McMahon以及Jung和Kwak的信息(Hayes和McMahon 2009； Jung和Kwak 2010)生成了一个列出Nrf2靶基因的表，小鼠Nfe2l2靶基因来自TRRUST数据库(https://www.grnpedia.org/trrust/)，NRF2途径来自Wikipathway (https://www.wikipathways.org/index.php/Pathway:WP2884)，ChIP-seq 数据来自Chorley等人(Chorley，Campbell等人2012)。该Nrf2靶基因列表用于在RNA-seq鉴定的全转录组(27636个基因)或在 NTZ+CDAA/c对比CDAA/c条件下差异表达的基因集(被认为差异表达的基因符合以下标准：至少|对比CDAA/c的倍数变化|>1.4倍并且经调节的p-值<0.01)中鉴定Nrf2靶基因。计算全基因库和Nrf2靶基因之间的比率并表示为百分比。为了确定在NTZ+CDAA/c对比 CDAA/c条件下观察到的Nrf2靶基因的比例是否与在鉴定的全转录组中观察到的比例不同，进行了卡方检验。
组织学
处死后，如下处理肝脏样品以用于组织学分析并检查。
组织包埋和切片
将肝脏切片首先在4％福尔马林溶液中固定40小时，然后在乙醇中进行几个脱水步骤(在70、80、95和100％乙醇的连续浴)。随后将肝片在三个二甲苯浴中、然后在两个液体石蜡浴(58℃)中温育。然后将肝片放入小架子中，用轻柔填充以完全覆盖组织。然后，使组织样品成为厚度3μm的切片。制备切片以用于免疫组织化学(IHC)。
免疫组织化学测定：4-HNE(4-羟基壬烯醛)
使用免疫过氧化物酶方案进行免疫组织化学测定。将切片在58℃和二甲苯浴(2×3分钟)中脱蜡。将样本用乙醇水合(100％、100％、 95％和70％的连续浴)(每次3分钟)并浸没在1xPBS中(2×5分钟)。随后，用H2O2溶液(0.3％H2O2的蒸馏水溶液)阻断内源性过氧化物酶30分钟，然后在1x PBS中进行三次的5分钟洗涤。此外，在95℃下，用pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液进行热介导的抗原修复40分钟。为了阻断非特异性结合，添加含有3％正常山羊血清和0.1％Triton的1x PBS溶液60分钟。随后，将组织与4-HNE一抗一起在4℃下温育过夜，并用1x PBS清洗(3 × 5分钟)。将所述组织在室温下与HRP二抗一起温育1小时，然后用1xPBS清洗(3 × 5分钟)。然后将载玻片用过氧化物酶底物3,3'-二氨基联苯胺(DAB)显露15分钟，并用自来水清洗。最后，将染色样品用Mayer苏木精复染3分钟，用自来水清洗(2分钟)，并将组织在乙醇和二甲苯中脱水。
4-HNE IHC分析：
组织学检查和评分是盲法进行的。使用Pannoramic 250Flash II 数字载玻片扫描器(3DHistech)获取图像。评分：在QuantCenter软件中检查和分析每个切片的七个随机选择视野。4-HNE蓄积计算为4-HNE阳性面积/总选择视野面积。
·细胞内GSH检测：
将替唑尼特(Interchim；目录号RP253)溶解在DMF(Sigma；目录号227056)中。将甲萘醌(Sigma；目录号M2518)和N-乙酰半胱氨酸(Sigma；目录号A9165)溶解在水中。
将Hep G2细胞(ECACC)以20 000个细胞/孔的密度铺在96孔微孔板中的100μlDMEM(Gibco；目录号41965-039)中，所述DMEM 补充有1％P/S(Gibco；目录号15140-122)、1％谷氨酰胺(Gibco；目录号25030-024)。该完全培养基含有10％SVF(Gibco；目录号10270-106)。第二天，除去培养基并替换为100μL DMEM(Gibco；目录号31053-028)，没有酚红和SVF但补充有1％P/S(Gibco；目录号15140-122)、1％谷氨酰胺(Gibco；目录号25030-024)。将血清剥夺的HepG2与TZ或N-乙酰半胱胺酸(NAC)预温育1小时，然后暴露于甲萘醌(MND)2小时。将化合物溶解在它们各自的上述介质中并在所述剥夺型培养基中稀释。将20X稀释液的5μl稀释液添加到细胞上以达到终浓度分别为TZ 1μM、NAC 10mM和MND 100μM。随后使用ThiolTracker Violet染料(Invitrogen，目录号T10096)监测还原型谷胱甘肽的细胞水平。简而言之，将细胞用DPBS(Invitrogen，目录号14287-080)洗涤两次，然后在37°下与根据供应商的说明在DPBS 中制备的100μl预温热的ThiolTracker Violet染料溶液一起温育30分钟，并测量荧光(Ex：404nm，Em：526nm)。
ARE报告系统–HepG2细胞系
将ARE报告系统–HepG2细胞(BPS Bioscience，Inc.，San Diego，目录号60513)按照制造商的说明进行培养。解冻后(BPS解冻培养基 1，目录号60187)，将细胞在生长培养基(BPS生长培养基1K，目录号79533)中培养，随后以40 000个细胞/孔的密度铺在96孔微孔板中的45μl测定培养基(BPS解冻培养基)中。将TZ(Interchim；目录号RP253)&DL-萝卜硫素(Sigma；目录号S4441)溶解在DMSO 中并稀释到测定培养基中。将5μl的10X稀释液添加到细胞上，达到 TZ和DL-萝卜硫素(DL-Sulfo)的终浓度分别为1μM和3μM。暴露 18小时后，确定荧光素酶活性。每孔添加50μl的One-Step荧光素酶测定体系(BPS目录号60690)，在室温下摇动～15分钟后，使用光度计测量发光。
统计分析
实验结果表示为平均值±SEM，并绘制为柱状图。使用第7版Prism 如下进行统计分析：
体内数据
CSAA对比CDAA+1％胆固醇组通过学生t检验(#：p<0.05； ##：p<0.01；###：p<0.001)或通过Mann-Whitney检验($：p<0.05； $$：p<0.01；$$$：p<0.001)进行比较。
NTZ处理组与CDAA+1％胆固醇饲料组通过学生t检验(#： p<0.05；##：p<0.01；###：p<0.001)或通过Mann-Whitney检验($： p<0.05；$$：p<0.01；$$$：p<0.001)进行比较。
体外数据
对于ARE荧光素酶报告系统测定，各处理效果通过学生t检验与介质效果进行比较(#：p<0.05；##：p<0.01；###：p<0.001)。
对于细胞内GSH检测，通过Mann-Whitney检验将甲萘醌条件与未刺激条件进行比较($：p<0.05；$$：p<0.01；$$$：p<0.001)。各处理效果通过学生t检验(#：p<0.05；##：p<0.01；###：p<0.001)或通过Mann-Whitney检验($：p<0.05；$$：p<0.01；$$$：p<0.001)与介质效果进行比较。
结果
氧化应激是NASH重要的病理生理机制(Koruk，Taysi等人 2004；Masarone，Rosato等人2018)，并且广泛认识到，4-HNE是一种不饱和脂肪酸的过氧化醛产物，是氧化应激的指示物 (Takeuchi-Yorimoto，Noto等人2013)。
因此，如图1所示，观察到与CSAA饲料相比，CDAA/c组的肝内4-HNE水平显著增加，而与CDAA/c方案平行暴露于NTZ的组中的 4-HNE水平显著较低，表明了NTZ对氧化应激诱导的脂质过氧化的保护效应。
为了进一步研究NTZ的抗氧化应激效应，对肝脏样品进行了转录组学分析。如图2所示，与CSAA组相比，CDAA/c组中肝GSTA1转录物的水平(图A)和GSTA2(图B)转录物的水平被显著诱导，反映了抗氧化防御机制的实施。有趣的是，比较接受NTZ+CDAA/c的组与单独的CDAA/c方案，对这两种酶都观察到了显著的表达诱导，提示对抗氧化应激的防御的改善。事实上，GSTA作为解毒酶是公知的，允许通过与谷胱甘肽结合来消除HNE。还分析了肝GSTA4mRNA的水平(图3)，因为该酶被认为是HNE解毒的关键参与者，与其它同工酶相比，它具有更高的将HNE与GSH结合的活性(Awasthi，Ramana 等人2017)。至于其它GST，在将CDAA/c组与CSAA组的比较中，观察到GSTA4转录物水平的显著诱导，并且喂食NTZ+CDAA/c方案的小鼠展现了与CDAA/c组相比显著更高的GSTA4水平，支持了NTZ 促进对抗氧化应激的防御机制的发现。
在小鼠和人类中，GSTA1、GSTA2和GSTA4被描述为受Nrf2正调节的基因，Nrf2是细胞氧化还原状态的关键调节因子(Hayes and Dinkova-Kostova 2014)。因此，我们比较了在测序的全转录组中观察到的Nrf2靶基因的比例与通过NTZ处理诱导的基因(通过NTZ+CDAA/c 特征与CDAA/c条件的比较获得)中Nrf2基因的比例。出乎意料的是，通过NTZ处理，诱导了Nrf2特征的显著富集(图4)。尽管Nrf2靶基因在RNA-seq数据中占鉴定的全转录组的1.3％，但发现Nrf2调节的基因占NTZ处理的小鼠中所有差异表达基因的大于8％。
为了确认NTZ在功能水平上激活Nrf2抗氧化途径的效力，在用 TZ(NTZ的活性代谢物)处理的HepG2细胞中测量了抗氧化应答元件 (ARE)介导的荧光素酶活性。在基础条件下，Nrf2通过与细胞骨架蛋白Keap1结合而保留在细胞质中，而当暴露于氧化应激或其它ARE 激活剂时，Nrf2从Keap1中释放并易位到细胞核，在那里它可以与ARE 结合，导致保护细胞免受氧化损伤的抗氧化酶和II相酶的表达。如图5 所示，TZ暴露导致ARE介导的转录显著增加，这反映了它在人肝细胞中诱导Nrf2易位至细胞核和相关的ARE信号传导的能力。总而言之，这些数据表明NTZ可以诱导对抗氧化应激的防御机制，并且该潜在机制的一部分依赖于Nrf2。
在对这些分析的补充中，我们评价了在暴露于氧化应激诱导剂甲萘醌(MND)的肝细胞中，TZ对GSH(还原型谷胱甘肽)含量的影响，GSH是肝脏中最强大的抗氧化剂(Al-Busafi，Bhat等人2012)。如图6所示，MND暴露正如所料，引起细胞GSH的显著减少。TZ处理完全防止了这种MND诱导的减少。该结果确认了NTZ的活性代谢物TZ的抗氧化性质。
总之，所有这些结果证明了NTZ和/或其代谢物TZ可以在氧化应激相关的疾病中提供治疗益处。
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