产生可用于治疗癌症的自体t细胞的方法及其组合物

文档序号：1894235 发布日期：2021-11-26 浏览：16次 >En<

阅读说明：本技术 产生可用于治疗癌症的自体t细胞的方法及其组合物 (Methods of generating autologous T cells useful for treating cancer and compositions thereof ) 是由 T·J·兰格 J·切卡雷利于 2020-02-18 设计创作，主要内容包括：本文提供了制造T细胞的方法。在某些实施方案中,提供了制造T细胞的方法,所述T细胞表达一组识别靶细胞表面上的肽的新型细胞表面受体。本文还提供了通过本文所述的方法产生的T细胞群体及其药物组合物。(Provided herein are methods of making T cells. In certain embodiments, methods of making T cells that express a novel set of cell surface receptors that recognize peptides on the surface of target cells are provided. Also provided herein are populations of T cells produced by the methods described herein and pharmaceutical compositions thereof.)

产生可用于治疗癌症的自体T细胞的方法及其组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年2月19日提交的标题为“METHODS FOR PRODUCINGAUTOLOGOUS T CELLS USEFUL TO TREAT CANCERS AND COMPOSITIONS THEREOF”[“产生可用于治疗癌症的自体T细胞的方法及其组合物”]的美国临时申请号62/807,644、于2019年3月29日提交的标题为“EX VIVO METHODS FOR PRODUCING AT CELL THERAP EUTIC ANDRELATED COMPOSITIONS AND METHODS”[“产生T细胞治疗剂的离体方法以及相关组合物和方法”]的美国临时申请号62/826,974、于2019年11月27日提交的标题为“METHODS FORPRODUCING AUT OLOGOUS T CELLS USEFUL TO TREAT CANCERS AND COMPOSITI ONSTHEREOF”[“产生可用于治疗癌症的自体T细胞的方法及其组合物”]的美国临时申请号62/941,614、以及于2019年11月27日提交的标题为“EX V IVO METHODS FOR PRODUCING ATCELL THERAPEUTIC AND R ELATED COMPOSITIONS AND METHODS”[“产生T细胞治疗剂的离体方法以及相关组合物和方法”]的美国临时申请号62/941,610的优先权，这些申请各自的内容通过引用以其整体并入。

技术领域

本公开文本提供了制造T细胞的方法。在某些实施方案中，提供了制造T细胞的方法，所述T细胞表达一组识别靶细胞表面上的肽的新型细胞表面受体。本公开文本还提供了通过本文所述的方法产生的T细胞群体及其药物组合物。

背景技术

产生用于在癌症中使用的自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)疗法的方法很长，涉及的反应性细胞数量很少，且不适合商业应用。因此，需要开发改进T细胞制造方法以克服这些限制。本文提供了满足这种需求的实施方案。

发明内容

根据本文描述的某些实施方案，提供了制造T细胞的方法，所述T细胞表达一组识别靶细胞表面上的肽的新型细胞表面受体。在某些实施方案中本文提供了制造T细胞的方法，所述T细胞表达一组识别靶细胞表面上的肽的新型细胞表面受体。此类方法包括但不限于以下步骤：(1)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体；(2)将所述群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生激活的T细胞的群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(3)在呈递一种或多种MHC相关非天然肽的抗原呈递细胞的存在下，共培养T细胞群体；(4)在封闭系统中将抗原呈递细胞与所述T细胞群体分离；(5)基于在使用无血清培养基的封闭系统中在呈递肽的有核细胞的存在下培养的T细胞上的上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞的新型群体；并且(6)在使用无血清培养基的封闭系统中，在细胞因子的存在下，扩增所选细胞的新型群体。本文还提供了通过本文所述的方法产生的T细胞群体及其药物组合物。

本文提供了一种制造用于在治疗性细胞组合物中使用的T细胞的方法，其中所述T细胞表达识别靶细胞表面抗原的T细胞受体(TCR)，所述方法包括：(a)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体以产生第一T淋巴细胞群体；(b)将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生第二激活T细胞群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(c)在使用无血清培养基的封闭系统中，在将一种或多种非天然肽呈递于主要组织相容性复合体(MHC)上的抗原呈递细胞的存在下，共培养所述第二T细胞群体，以产生包含含有对所述肿瘤的突变编码肽具有反应性的内源T细胞受体的T细胞(肿瘤反应性T细胞)的第三群体，所述一种或多种非天然肽是对应于受试者的肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽；(d)在封闭系统中，将抗原呈递细胞与所述第三细胞群体中的T细胞群体分离；(e)分离后，基于在封闭系统中培养的T细胞上的上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞的群体，以产生含有所选T细胞的第四群体；并且(f)在使用无血清培养基的封闭系统中，在淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂的存在下，扩增所选细胞的第四群体，以产生用于在治疗性细胞组合物中使用的扩增的T细胞的组合物。

本文提供了一种制造用于在治疗性细胞组合物中使用的T细胞的方法，其中所述T细胞表达识别靶细胞表面抗原的T细胞受体(TCR)，所述方法包括：(a)处理从患有肿瘤的供体受试者获得的T淋巴细胞群体以产生第一T淋巴细胞群体；(b)在扩增所述第一群体中的T细胞的条件下，将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种第一T细胞刺激剂刺激以产生第二激活T细胞群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(c)在使用无血清培养基的封闭系统中，在将一种或多种非天然肽呈递于主要组织相容性复合体(MHC)上的抗原呈递细胞的存在下，共培养所述第二T细胞群体，以产生包含含有对所述肿瘤的突变编码肽具有反应性的内源T细胞受体的T细胞(肿瘤反应性T细胞)的第三群体，所述一种或多种非天然肽是对应于所述受试者的肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽；(d)在封闭系统中，基于反应性或激活T细胞上表达的一种或多种上调标记物，从所述第三细胞群体中选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞的群体，以产生含有所选T细胞的第四群体；并且(e)在使用无血清培养基的封闭系统中，在扩增所述第四群体中的T细胞的条件下，在淋巴细胞的一种或多种第二T细胞刺激剂的存在下，扩增所选细胞的第四群体，以产生用作治疗性细胞组合物的扩增的T细胞的组合物。

本文提供了一种制造用于在治疗性细胞组合物中使用的T细胞的方法，其中所述T细胞表达识别靶细胞表面抗原的T细胞受体(TCR)，所述方法包括：(a)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体以产生第一T淋巴细胞群体；(b)将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生第二激活T细胞群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(c)在使用无血清培养基的封闭系统中，在将一种或多种非天然肽呈递于主要组织相容性复合体(MHC)上的抗原呈递细胞的存在下，共培养所述第二T细胞群体，以产生包含含有对所述肿瘤的突变编码肽具有反应性的内源T细胞受体的T细胞(肿瘤反应性T细胞)的第三细胞群体，所述一种或多种非天然肽是对应于受试者的肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽；(d)基于在封闭系统中培养的T细胞上的上调标记物，从所述第三细胞群体中选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞的群体，以产生含有所选T细胞的第四群体；并且(e)在使用无血清培养基的封闭系统中，在淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂的存在下，扩增所选细胞的第四群体，以产生用于在治疗性细胞组合物中使用的扩增的T细胞的组合物。

本文提供了一种制造用于在治疗性细胞组合物中使用的T细胞的方法，其中所述T细胞表达识别靶细胞表面抗原的T细胞受体(TCR)，所述方法包括：(a)处理从患有肿瘤的供体受试者获得的淋巴细胞群体以产生第一T淋巴细胞群体；(b)在扩增所述第一群体中的T细胞的条件下，将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种第一T细胞刺激剂刺激以产生第二T细胞群体，其中所述刺激是在使用无血清培养基的封闭系统中进行；(c)在使用无血清培养基的封闭系统中，在将一种或多种非天然肽呈递于主要组织相容性复合体(MHC)上的抗原呈递细胞的存在下，共培养所述第二T细胞群体，以产生包含含有对所述肿瘤的突变编码肽具有反应性的内源T细胞受体的T细胞(肿瘤反应性T细胞)的第三群体，所述一种或多种非天然肽是对应于受试者的肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽；(d)在封闭系统中，将抗原呈递细胞与所述第三细胞群体中的T细胞群体分离；(e)分离后，在封闭系统中，基于在反应性或激活T细胞上表达的一种或多种上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞的群体，以产生含有所选T细胞的第四群体；并且(f)在使用无血清培养基的封闭系统中，在扩增所述第四群体中的T细胞的条件下，在淋巴细胞的一种或多种第二T细胞刺激剂的存在下，扩增所选细胞的第四群体，以产生用作治疗性细胞组合物的扩增的T细胞的组合物。

在任何所提供的方法的一些中，所述方法还包括体外扩增T细胞。在任何实施方案的一些中，所述抗原呈递细胞是有核细胞，如树突细胞、单核吞噬细胞、B淋巴细胞、内皮细胞或胸腺上皮细胞。在任何实施方案的一些中，所述抗原呈递细胞是树突细胞。在任何实施方案的一些中，所述T细胞对于所述受试者是自体的。在任何实施方案的一些中，所述T细胞对于患有肿瘤的受试者是自体的。在任何此类实施方案的一些中，所述T细胞对于所述患者是自体的。在任何实施方案的一些中，所述T细胞获得自健康供体。在任何实施方案的一些中，所述MHC分子是I类分子。在任何实施方案的一些中，所述MHC分子是II类分子。在任何实施方案的一些中，所述MHC分子是I类和II类的。在任何实施方案的一些中，所述T细胞是CD4+细胞。在任何实施方案的一些中，所述T细胞是CD8+细胞。在任何实施方案的一些中，所述T细胞是CD4+细胞和CD8+细胞。

在任何实施方案的一些中，所述T细胞刺激剂选自以下中的一种或多种：抗CD3抗体；抗CD28抗体；或选自IL-2、IL-7、IL-15和IL-21的重组细胞因子。

在任何实施方案的一些中，所述第一T细胞刺激剂选自以下中的一种或多种：抗CD3抗体；抗CD28抗体；或选自IL-2、IL-7、IL-15和IL-21的重组细胞因子。在任何实施方案的一些中，所述第一T细胞刺激剂是或包含重组IL-2。在任何实施方案的一些中，重组IL-2的浓度是100IU/mL至6000IU/mL。在任何实施方案的一些中，重组IL-2的浓度是300IU/mL至1000IU/mL。在一些实施方案中，重组IL-2的浓度是为或约300IU/mL。

在任何实施方案的一些中，所述T细胞刺激剂还包含抗CD3抗体，如OKT3。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体的浓度是为或约50ng/mL。在任何所提供的实施方案的一些中，所述第二T细胞刺激剂选自以下中的一种或多种：抗CD3抗体；抗CD28抗体；或选自IL-2、IL-7、IL-15和IL-21的重组细胞因子。在任何实施方案的一些中，所述第二T细胞刺激剂是或包含重组IL-2。在任何所提供的实施方案的一些中，重组IL-2的浓度是100IU/mL至6000IU/mL。在任何实施方案的一些中，重组IL-2的浓度是300IU/mL至1000IU/mL。在一些实施方案中，重组IL-2的浓度是为或约300IU/mL。在任何实施方案的一些中，所述T细胞刺激剂还包含抗CD3抗体，如OKT3。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体的浓度是为或约50ng/mL。

在任何实施方案的一些中，所述一种或多种非天然肽包含单独肽或肽库。在任何实施方案的一些中，非天然肽是对应于患者肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽。在任何所提供的实施方案的一些中，所述一种或多种非天然肽通过编码非同义体细胞突变氨基酸的在体外转录合成的小基因构建体的转染而加载在抗原呈递细胞上。在一些实施方案中，突变的氨基酸以串联方式在每一侧侧接来自内源蛋白质的12个氨基酸，其中所述转录的小基因构建体产生单独肽。在任何实施方案的一些中，通过将与非同义体细胞突变相关的肽库电穿孔到抗原呈递细胞中，在有核细胞上表达非天然肽。在一些实施方案中，突变的氨基酸以串联方式在每一侧侧接来自内源蛋白质的12个氨基酸，其中所述转录的小基因构建体产生单独肽。在任何实施方案的一些中，通过以下方式在抗原呈递细胞上表达非天然肽：合成编码非同义体细胞突变氨基酸的小基因构建体，所述非同义体细胞突变氨基酸以串联方式在每一侧侧接来自内源蛋白质的12个氨基酸；然后使用体外RNA转录进行转录以产生单独肽；并且然后转染到抗原呈递细胞中。

在任何实施方案的一些中，通过将由与非同义体细胞突变相关的12种长肽组成的肽库肽脉冲(如电穿孔)到抗原呈递细胞中，在有核细胞上表达非天然肽。在任何实施方案的一些中，将一种或多种非天然肽通过肽脉冲加载在抗原呈递细胞上。在一些实施方案中，所述肽脉冲是通过电穿孔进行的。在任何实施方案的一些中，通过将与非同义体细胞突变相关的肽库肽脉冲(如电穿孔)到抗原呈递细胞中，在有核细胞上表达非天然肽。在一些情况下，肽库的每种肽的长度是9至15个氨基酸，如长度是为或约9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸或15个氨基酸。在一些情况下，肽库的每种肽是长度为12个氨基酸的肽。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种非天然肽是5-30个氨基酸。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种非天然肽是12-25个氨基酸。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种非天然肽是为或约25个氨基酸或者为或约12个氨基酸。

在任何实施方案的一些中，在肽脉冲(例如电穿孔)期间肽库与抗原呈递细胞的比率在0.001与100μg/100万个细胞之间、0.01与100μg/100万个细胞之间、0.1与100μg/100万个细胞之间、1与100μg/100万个细胞之间、10与100μg/100万个细胞之间。

在任何实施方案的一些中，用于脉冲(例如电穿孔)的肽库的浓度是在为或约0.001μg/mL与为或约40μg/mL之间、0.01μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约0.1μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约1μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约0.01μg/mL与为或约10μg/mL之间、或为或约1μg/mL与为或约10μg/mL之间。

在一些实施方案中，用于肽脉冲的单独肽的浓度是在为或约0.00001μg/mL与为或约1μg/mL之间、为或约0.00001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、为或约0.00001μg/mL与为或约0.01μg/mL之间、为或约0.0001μg/mL与为或约1μg/mL之间、为或约0.0001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、为或约0.0001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、或为或约0.0001μg/mL与为或约0.01μg/mL之间。在任何实施方案的一些中，在肽脉冲(例如电穿孔)期间单独肽与抗原呈递细胞的比率在0.001与100μg/100万个细胞之间、0.01与100μg/100万个细胞之间、0.1与100μg/100万个细胞之间、1与100μg/100万个细胞之间、10与100μg/100万个细胞之间。在一些实施方案中，用于肽脉冲的单独肽的浓度是在为或约0.0001μg/mL与为或约40μg/mL之间、或在为或约0.001μg/mL与为或约40μg/mL之间。在一些实施方案中，用于肽脉冲(例如电穿孔)的单独肽的浓度是在为或约0.01μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约0.1μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约1μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约0.01μg/mL与为或约10μg/mL之间、或为或约1μg/mL与为或约10μg/mL之间。在一些实施方案中，用于肽脉冲的单独肽的浓度是在为或约0.0001μg/mL与为或约10μg/mL之间、为或约0.0001μg/mL与为或约1μg/mL之间、为或约0.0001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、为或约0.0001μg/mL与为或约0.01μg/mL之间、或为或约0.0001μg/mL与为或约0.001μg/mL之间。

在任何实施方案的一些中，非天然肽源自内体或溶酶体蛋白。在任何实施方案的一些中，非天然肽源自胞质蛋白。

在任何实施方案的一些中，抗原呈递细胞与T细胞的共培养比率在20:1与1:1之间、在15:1与1:1之间、在10:1与1:1之间、在5:1与1:1之间、在2.5:1与1:1之间。

在任何实施方案的一些中，抗原呈递细胞与T细胞的共培养比率在20:1与1:1之间、在15:1与1:1之间、在10:1与1:1之间、在5:1与1:1之间、或2.5:1与1:1之间。在任何实施方案的一些中，抗原呈递细胞与T细胞的共培养比率是或是约1:1。

在任何实施方案的一些中，抗原呈递细胞的分离使用磁分离、重力分离、选择性结合、或使用流式细胞术的细胞分选。

本文提供了一种制造用于在治疗性细胞组合物中使用的T细胞的方法，其中所述T细胞表达识别靶细胞表面抗原的T细胞受体(TCR)：(a)处理从患有肿瘤的供体受试者获得的T淋巴细胞群体以产生第一T淋巴细胞群体；(b)在扩增所述第一群体中的T细胞的条件下，将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种第一T细胞刺激剂刺激，以产生第二激活T细胞群体，其中所述一种或多种T细胞刺激剂是或包括浓度为300IU/mL至1000IU/mL的重组IL-2，并且其中使用无血清培养基在封闭系统中进行所述刺激；(c)在加载有一种或多种非天然肽的用于将所述一种或多种非天然肽呈递于主要组织相容性复合体(MHC)上的自体树突细胞的存在下，共培养所述第二T细胞群体，以产生包含含有对所述肿瘤的突变编码肽具有反应性的内源T细胞受体的T细胞的第三细胞群体，其中所述共培养是在使用无血清培养基的封闭系统中进行，并且其中所述一种或多种非天然肽是对应于所述受试者的肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽并且以每种单独肽小于0.02μg/mL的浓度由所述树突细胞加载；(d)在封闭系统中，基于反应性或激活T细胞上表达的一种或多种上调标记物，从所述第三细胞群体中选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞的群体，以产生含有所选T细胞的第四群体；并且(e)在扩增所述第四群体中的T细胞的条件下，在淋巴细胞的一种或多种第二T细胞刺激剂的存在下，扩增所选细胞的第四群体，以产生用作治疗性细胞组合物的扩增的T细胞的组合物，其中所述一种或多种第二T细胞刺激剂是或包括浓度为300IU/mL至1000IU/mL的重组IL-2，并且其中所述扩增是在使用无血清培养基的封闭系统中进行。

在任何实施方案的一些中，所述一种或多种非天然肽中的每种单独肽的浓度是0.00001μg/mL，以及为或约0.01μg/mL。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种非天然肽中的每种单独肽的浓度是0.0001μg/mL和0.001μg/mL。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种非天然肽包含单独肽或单独肽的库。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种非天然肽中的每种的长度是12至25个氨基酸。在一些实施方案中，所述一种或多种非天然肽的长度是为或约25个氨基酸。在任何所提供的实施方案的一些中，树突细胞与T细胞的共培养比率在5:1与1:5之间或在3:1与1:3之间。在一些实施方案中，共培养比率是或是约1:1。在任何所提供的实施方案的一些中，树突细胞与T细胞的共培养比率是或是约1:1。在任何所提供的实施方案的一些中，共培养持续2小时至24小时。在任何所提供的实施方案的一些中，共培养持续为或约6小时。

在任何实施方案的一些中，使用基于荧光的细胞分选仪进行所述选择。在任何实施方案的一些中，在使用无血清培养基的封闭系统中，使用基于荧光的细胞分选仪进行选择。在任何实施方案的一些中，所述选择是通过基于荧光的细胞分选仪进行1次、2次、3次或4次运行。在任何实施方案的一些中，使用基于荧光的一次性流体细胞分选仪以10,000与100,000个细胞/秒之间的速率进行选择。在任何实施方案的一些中，所述封闭系统是袋系统。

在任何实施方案的一些中，上调标记物是所述T细胞的表面表达的蛋白质，其仅当T细胞内源TCR识别由所述APC表达的肽时才表达。

在任何实施方案的一些中，所述一种或多种上调标记物选自CD107、CD107a、CD39、CD103、CD137(4-1BB)、CD59、CD69、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134(OX40)、CD258、CD256、PD-1、TIM-3和LAG-3。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种上调标记物选自CD38、CD39、CD6、CD90、CD134和CD137。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种上调标记是CD134和/或CD137。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种上调标记物选自CD107、CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134、CD258和CD256。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种T上调标记物选自CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90和CD38。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种T上调标记物包括选自以下的至少两种标记物：CD107a和CD39、CD107a和CD103、CD107a和CD59、CD107a和CD90、CD107a和CD38、CD39和CD103、CD39和CD59、CD39和CD90、CD39和CD38、CD103和CD59、CD103和CD90、CD103和CD38、CD59和CD90、CD59和CD38、以及CD90和CD38。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种T细胞上调标记物还包括CD137。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种T细胞上调标记物包括选自以下的至少两种标记物：CD107a和CD137、CD38和CD137、CD103和CD137、CD59和CD137、CD90和CD137、以及CD38和CD137。在任何所提供的实施方案的一些中，所述一种或多种上调标记物还包括选自以下的至少一种标记物：PD-1、TIM-3和LAG-3。

在任何实施方案的一些中，刺激所述第一群体持续7至21天。在一些实施方案中，刺激所述第一群体持续7至14天。在任何所提供的实施方案的一些中，扩增所述第四群体持续7至21天。在一些实施方案中，扩增所述第四群体持续7至14天。

在任何实施方案的一些中，从处理淋巴细胞群体到产生扩增的T细胞的时间少于30天。在任何实施方案的一些中，从富集淋巴细胞群体到产生扩增的T细胞的时间少于30天。在任何实施方案的一些中，所述淋巴细胞群体来自肿瘤浸润性淋巴细胞、淋巴的淋巴细胞或外周血单核细胞。在任何实施方案的一些中，所述淋巴细胞群体源自肿瘤浸润性淋巴细胞、淋巴的淋巴细胞或外周血单核细胞。

在任何实施方案的一些中，所述肿瘤是上皮癌的肿瘤。在任何实施方案的一些中，所述肿瘤是以下的肿瘤：黑色素瘤、肺鳞癌、肺腺癌、膀胱癌、肺小细胞癌、食道癌、结直肠癌(CRC)、宫颈癌、头颈癌、胃癌或子宫癌。在任何所提供的实施方案的一些中，所述肿瘤是以下的肿瘤：非小细胞肺癌(NSCLC)、CRC、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌、子宫内膜癌，任选地其中所述乳腺癌是HR+/Her2-乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)或HER2+乳腺癌。

在任何实施方案的一些中，所述淋巴细胞群体是从切除的肿瘤，如来自切除的肿瘤的肿瘤碎片处理而来。在任何实施方案的一些中，所述肿瘤是黑色素瘤。

在任何所提供的实施方案的一些中，将所述淋巴细胞群体处理为通过对来自切除肿瘤的一个或多个肿瘤碎片进行匀浆化和/或酶消化获得的单细胞悬浮液。在任何所提供的实施方案的一些中，将所述淋巴细胞群体处理为通过对来自切除肿瘤的一个或多个肿瘤碎片进行匀浆化和酶消化获得的单细胞悬浮液。在任何实施方案的一些中，所述酶消化是通过胶原酶来进行。在一些实施方案中，所述胶原酶是IV型胶原酶。在一些实施方案中，所述胶原酶是I/II型胶原酶。在任何实施方案的一些中，所述肿瘤是结直肠癌(CRC)。

在任何实施方案的一些中，扩增的细胞的组合物用于治疗癌症患者。

在任何实施方案的一些中，所述方法还包括收获通过所述方法产生的细胞。在任何实施方案的一些中，所述方法还包括用低温保护剂配制收获的细胞。

在任何实施方案的一些中，通过所述方法产生的治疗性组合物的T细胞群体表达大于或等于1种T细胞表面受体，所述大于或等于1种T细胞表面受体识别表达非同义突变的靶细胞上的大于或等于1种特异性抗原。

在任何实施方案的一些中，与所述第一T细胞群体相比，通过所述方法产生的治疗性组合物的T细胞群体富集肿瘤反应性T细胞或富集在反应性或激活T细胞上表达的一种或多种T细胞上调标记物呈表面阳性的T细胞，如富集了10倍至1000倍。在任何实施方案的一些中，与所述第二T细胞群体相比，通过所述方法产生的治疗性组合物的T细胞群体富集肿瘤反应性T细胞或富集在反应性或激活T细胞上表达的一种或多种T细胞上调标记物呈表面阳性的T细胞，如富集了10倍至1000倍。在任何实施方案的一些中，与所述第三T细胞群体相比，通过所述方法产生的治疗性组合物的T细胞群体富集肿瘤反应性T细胞或富集在反应性或激活T细胞上表达的一种或多种T细胞上调标记物呈表面阳性的T细胞，如富集了1.5倍至50倍。

在任何实施方案的一些中，通过所述方法产生的治疗性组合物的T细胞群体能够在抗原特异性刺激后产生浓度为大于或大于约30pg/mL的IFNγ。在一些实施方案中，在抗原特异性刺激后产生的IFNγ是大于或大于约40pg/mL、大于或大于约50pg/mL、大于或大于约60pg/mL、大于或大于约70pg/mL、大于或大于约80pg/mL、或大于或大于约90pg/mL。

本文提供了通过任何所提供的方法产生的T细胞群体，其中所述T细胞群体表达大于或等于1种T细胞表面受体，所述大于或等于1种T细胞表面受体识别表达非同义突变的靶细胞上的大于或等于1种特异性抗原。

在任何实施方案的一些中，与所述第一T细胞群体相比，通过提供的方法产生的T细胞群体富集肿瘤反应性T细胞或富集在反应性或激活T细胞上表达的一种或多种T细胞上调标记物呈表面阳性的T细胞，如富集了10倍至1000倍。在任何实施方案的一些中，与所述第二T细胞群体相比，通过提供的方法产生的T细胞群体富集肿瘤反应性T细胞或富集在反应性或激活T细胞上表达的一种或多种T细胞上调标记物呈表面阳性的T细胞，如富集了10倍至1000倍。在任何实施方案的一些中，与所述第三T细胞群体相比，通过提供的方法产生的T细胞群体富集肿瘤反应性T细胞或富集在反应性或激活T细胞上表达的一种或多种T细胞上调标记物呈表面阳性的T细胞，如富集了1.5倍至50倍。

在任何所提供的实施方案的一些中，通过提供的方法产生的T细胞群体能够在抗原特异性刺激后产生浓度为大于或大于约30pg/mL，如大于或大于约60pg/mL的IFNγ。在任何实施方案的一些中，通过所述方法产生的T细胞群体能够在抗原特异性刺激后产生浓度为大于或大于约30pg/mL的IFNγ。在一些实施方案中，在抗原特异性刺激后产生的IFNγ是大于或大于约40pg/mL、大于或大于约50pg/mL、大于或大于约60pg/mL、大于或大于约70pg/mL、大于或大于约80pg/mL、或大于或大于约90pg/mL。

本文提供了表达大于或等于1种T细胞表面受体的T细胞的群体，所述大于或等于1种T细胞表面受体识别表达非同义突变的靶细胞上的大于或等于1种特异性抗原；(a)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体以产生第一T淋巴细胞群体；(b)将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生第二激活T细胞群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(c)在使用无血清培养基的封闭系统中，在将一种或多种非天然肽呈递于主要组织相容性复合体(MHC)上的抗原呈递细胞的存在下，共培养所述第二T细胞群体，以产生包含含有对所述肿瘤的突变编码肽具有反应性的内源T细胞受体的T细胞(肿瘤反应性T细胞)的第三细胞群体，所述一种或多种非天然肽是对应于受试者的肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽；(d)在封闭系统中，将抗原呈递细胞与所述第三细胞群体中的T细胞分离；(e)分离后，基于在封闭系统中培养的T细胞上的上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞，以产生含有所选细胞的第四群体；并且(f)在使用无血清培养基的封闭系统中，在淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂的存在下，扩增所选细胞的第四群体。

在任何所提供的实施方案的一些中，所述细胞表面标记物是TCR。在任何所提供的实施方案的一些中，所述靶细胞是癌细胞。在任何所提供的实施方案的一些中，所述癌细胞是上皮恶性肿瘤。在任何所提供的实施方案的一些中，所述抗原是新抗原。

在任何所提供的实施方案的一些中，从富集淋巴细胞群体到产生扩增的T细胞的时间少于30天。在任何所提供的实施方案的一些中，所述T细胞用于治疗癌症患者。

本文提供了药物组合物，其包含通过本文提供的任何方法产生的T细胞的治疗性组合物。在任何实施方案的一些中，所述药物组合物包含治疗剂量的T细胞。

本文提供了一种包含肿瘤反应性T细胞的组合物，其中在所述组合物中至少为或约40％、至少为或约50％、至少为或约60％、至少为或约70％、至少为或约80％、或至少为或约90％的总细胞或总T细胞是肿瘤反应性T细胞，或者对在反应性或激活T细胞上表达的一种或多种T细胞上调标记物呈表面阳性。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种T细胞上调标记物选自CD107、CD107a、CD39、CD103、CD137(4-1BB)、CD59、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134、CD258、CD256、PD-1、TIM-3和LAG-3。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种T细胞上调标记物是CD137和/或CD134。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种T细胞上调标记物选自CD107、CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134、CD258和CD256。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种T细胞上调标记物选自CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90和CD38。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种T细胞上调标记物包括选自以下的至少两种标记物：CD107a和CD39、CD107a和CD103、CD107a和CD59、CD107a和CD90、CD107a和CD38、CD39和CD103、CD39和CD59、CD39和CD90、CD39和CD38、CD103和CD59、CD103和CD90、CD103和CD38、CD59和CD90、CD59和CD38、以及CD90和CD38。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种T细胞上调标记物还包括CD137。在任何实施方案的一些中，所述一种或多种反应性T细胞上调标记物包括选自以下的至少两种标记物：CD107a和CD137、CD38和CD137、CD103和CD137、CD59和CD137、CD90和CD137、以及CD38和CD137。在任何所提供的实施方案的一些中，所述一种或多种T细胞上调标记物还包括选自以下的至少一种标记物：PD-1、TIM-3和LAG-3。

在任何实施方案的一些中，所述T细胞是CD3+T细胞或包括CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。在任何实施方案的一些中，所述T细胞包括CD4+T细胞和CD8+T细胞，其中CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率在为或约1:100与为或约100:1之间、在为或约1:50与为或约50:1之间、在为或约1:25与为或约25:1之间、在为或约1:10与为或约10:1之间、在为或约1:5与为或约5:1之间、或在为或约1:2.5与为或约2.5:1之间。在任何实施方案的一些中，肿瘤反应性T细胞或所述T细胞激活标记物呈表面阳性的总T细胞或其活细胞的数量在为或约0.5x10⁸与为或约50x10⁹之间、在为或约0.5x10⁸与为或约30x10⁹、在0.5x10⁸与为或约12x10⁹之间、在为或约0.5x10⁸与为或约60x10⁸之间、在为或约0.5x10⁸与为或约15x10⁸之间、在为或约0.5x10⁸与为或约8x10⁸之间、在为或约0.5x10⁸与为或约3.5x10⁸之间、在为或约0.5x10⁸与为或约1x10⁸、在1x10⁸与为或约50x10⁹之间、在为或约1x10⁸与为或约30x10⁹、在1x10⁸与为或约12x10⁹之间、在为或约1x10⁸与为或约60x10⁸之间、在为或约1x10⁸与为或约15x10⁸之间、在为或约1x10⁸与为或约8x10⁸之间、在为或约1x10⁸与为或约3.5x10⁸之间、在为或约3.5x10⁸与为或约50x10⁹之间、在为或约3.5x10⁸与为或约30x10⁹之间、在为或约3.5x10⁸与为或约12x10⁹之间、在为或约3.5x10⁸与为或约60x10⁸之间、在为或约3.5x10⁸与为或约15x10⁸之间、在为或约3.5x10⁸与为或约8x10⁸之间、在为或约8x10⁸与为或约50x10⁹之间、在为或约8x10⁸与为或约30x10⁹之间、在为或约8x10⁸与为或约12x10⁹之间、在为或约8x10⁸与为或约60x10⁸之间、在为或约8x10⁸与为或约15x10⁸之间、在为或约15x10⁸与为或约50x10⁹之间、在为或约15x10⁸与为或约30x10⁹之间、在为或约15x10⁸与为或约12x10⁹之间、在为或约15x10⁸与为或约60x10⁸之间、在为或约60x10⁸与为或约50x10⁹之间、在为或约60x10⁸与为或约30x10⁹之间、在为或约60x10⁸与为或约12x10⁹之间、在为或约12x10⁹与为或约50x10⁹之间、在为或约12x10⁹与为或约30x10⁹之间、或在为或约30x10⁹与为或约60x10⁹之间，每个都包含端值。在任何所提供的实施方案的一些中，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。在任何实施方案的一些中，所述组合物包含低温保护剂。在任何实施方案的一些中，所述组合物是无菌的。

本文提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗剂量的本文提供的任何药物组合物。在任何实施方案的一些中，治疗有效剂量在1x10⁹与10x10⁹个T细胞之间。在任何实施方案的一些中，治疗有效剂量是每公斤体重大于100万至小于1亿个T细胞。在任何实施方案的一些中，治疗有效剂量是从每公斤体重为或约1000万至为或约5000万个T细胞。在任何实施方案的一些中，治疗有效剂量是每公斤体重大于100万至小于1千万个T细胞。在任何实施方案的一些中，治疗有效剂量是每公斤体重约500万个T细胞。在任何实施方案的一些中，治疗有效剂量是每公斤体重约1000万个T细胞。

本文提供了一种制造T细胞的方法，所述方法包括：(a)获得淋巴细胞；(b)在使用无血清培养基的封闭系统中，刺激淋巴细胞群体以产生激活T细胞群体；(c)在呈递一种或多种MHC相关的所呈递非天然肽的抗原呈递细胞的存在下，共培养T细胞；(d)在封闭系统中，将抗原呈递细胞与T细胞分离；(e)基于在使用无血清培养基的封闭系统中在呈递肽的有核细胞的存在下培养的T细胞上的上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的细胞表面受体的T细胞；并且(f)在使用无血清培养基的封闭系统中，在细胞因子的存在下，扩增所选细胞。

在任何这种实施方案的一些中，所述细胞表面受体是TCR。在任何所提供的实施方案的一些中，所述细胞表面受体是对突变编码肽具有反应性的一组新型内源T细胞受体。在任何所提供的实施方案的一些中，所述细胞表面受体是对与患者肿瘤相关的独特体细胞突变组具有反应性的一组新型内源T细胞受体。

附图说明

图1A和1B描绘了反映本文描述的方法的工艺流程图.图1A代表实施例6中描述的共培养实验的逐步施用，而图1B描绘了用于产生患者特异性肿瘤来源的浸润性T细胞群体的完整工艺流程图。

图2A描绘了典型的TIL扩增过程中的示例性动力学和T细胞新抗原反应性，所述扩增过程涉及具有第一次初始扩增和第二次快速扩增的T细胞的大量扩增，其中反应性在整个过程中保持低，包括在最终产物内如此。图2B进一步描绘了TIL扩增过程的示例性动力学，所述扩增过程涉及第一次初始扩增，随后通过与呈递新抗原肽的抗原呈递细胞共培养来富集肿瘤反应性T细胞，针对T细胞激活(上调)标记物选择肿瘤反应性细胞，以及对富集的反应性细胞的第二次扩增。

图3A描绘了使用碎片培养、用酶匀浆化和不用酶匀浆化从患者来源的CRC肿瘤组织产生的总活群体1细胞。用酶消化和不用酶消化产生的总细胞均多于来自碎片的培养物的总细胞。这些细胞的活力百分比示于图3B中。由碎片产生的并用酶消化的培养物的活力高于使用无酶匀浆化得到的培养物的活力。

图4A描绘了使用碎片培养或者用酶或不用酶的匀浆化从患者来源的黑色素瘤肿瘤组织产生的群体1细胞。碎片培养产生的总细胞多于从单细胞悬浮液起始的培养产生的总细胞。这些细胞的活力百分比示于图4B中。由碎片产生的群体比来自单细胞悬浮液的细胞示出更高的活力。

图5描绘了在常规6孔培养板或24孔透气性培养板中源自原发性CRC肿瘤的群体2细胞的生长曲线(图5A)以及扩增倍数(图5B)。图5还描绘了源自原发性CRC肿瘤的群体2细胞的总细胞数(图5C)以及扩增倍数(图5D)，按细胞提取方法(碎片或单细胞悬浮培养)进行对比。

图6描绘了在6孔培养板或24孔透气性培养板中源自原发性黑色素瘤的群体2细胞的生长曲线(图6A)以及扩增倍数(图6B)。

图7描绘了使用无血清OpTmizer或补充有5％人血清的RPMI培养基，源自原发性CRC肿瘤的群体2细胞的总细胞数(图7A)以及扩增倍数(图7B)。类似地，图8描绘了使用无血清OpTmizer或补充有5％人血清的RPMI培养基，源自原发性黑色素瘤肿瘤的群体2细胞的总细胞数(图8A)以及扩增倍数(图8B)。

图9描绘了源自CRC肿瘤的并在补充有低浓度(300IU/mL)或高浓度(600IU/mL)重组人IL-2的培养基中培养的群体2细胞的总细胞数(图9A)以及扩增倍数(图9B)。对于黑色素瘤肿瘤来源的细胞，这些数据类似地描绘于图10A和10B中。没有观察到高浓度的IL-2是细胞扩增所必需的。

图11A描绘了群体2总细胞数，并且图11B描绘了来自未刺激或用一种抗CD3单克隆抗体OKT3刺激的黑色素瘤来源的细胞培养物的扩增倍数，观察到在很大程度上相似。

图12A-C描绘了在用OKT3激活后0与48小时之间，CD8+T细胞上的激活标记物CD38和CD39(图12A)、CD134和CD137(图12B)、以及CD69和CD90(图12C)的上调百分比。

图13A-C描绘了在用OKT3激活后0与48小时之间，CD4+T细胞上的激活标记物CD38和CD39(图13A)、CD134和CD137(图13B)、以及CD69和CD90(图13C)的上调百分比。

图14描绘了在第0天从CRC肿瘤产生的单细胞悬浮培养物中的所选示例性标记物的表达。

图15A-E描绘了作为占群体1细胞百分比的CD3+细胞纯度。图15A描绘了在不用酶、用1mg/ml(低)酶和5mg/ml(高)酶匀浆化后，来自CRC肿瘤的第0天SCS的细胞的纯度。对于黑色素瘤来源的培养物，这些数据类似地示于图15B中。图15C描绘了来自在存在或不存在OKT3刺激的情况下培养的碎片的第0天(基线SCS)和第6天的CD3+群体1细胞的纯度。图15D示出了使用在补充有6000IU/mL(高)或300IU/mL(低)重组IL-2的培养基中培养的碎片在第11天来自CRC供体的CD3+细胞的相对纯度。图15E描绘了来自在无血清OpTmizer培养基或RPMI中在OKT3刺激的情况下和/或用高或低浓度IL-2的情况下培养的碎片的群体1细胞(第9天)。这些观察结果支持来自CRC患者肿瘤活检的SCS可能比从肿瘤碎片培养中获得的细胞更能够提供更多数量的T细胞用于扩增。

图16描绘了源自黑色素瘤患者的作为在高和低IL-2浓度下以及用含有血清的RPMI培养基或无血清OpTmizer的情况下第9天的碎片培养物的CD3+群体1细胞的纯度。

图17A描绘了在与加载有浓度为0.1ng/mL至20ng/mL的肽的树突细胞共培养后产生的群体3细胞。图17B描绘了在相同实验中，相对于与未加载的树突细胞共培养的T细胞的增加倍数(图17B)。

图18A比较了用一种肽或两种肽的刺激，报告为41BB/OX40表达％。图18B描绘了用一种肽或两种肽的刺激，报告为相对于未激活的T细胞的增加倍数。

图19A比较了T细胞与树突细胞的两种比率1:1和1:2，报告为41BB/OX40表达％。图19B比较了T细胞与树突细胞的两种比率1:1和1:2，报告为相对于未激活的T细胞的增加倍数。

图20A描绘了在将来源自三名健康供体的外周血的T细胞与自体新抗原肽共培养及分选之前和之后的新抗原反应性TCR百分比。图20B描绘了共培养及CD8+细胞分选之前和之后的平均I类反应性。

图21A和图21B描绘了来自使用Sony FX500的细胞分选的回收：两个独立运行的总细胞输入和输出(图21A)和回收百分比(图21B)。图22描绘了来自使用Sony FX500的细胞分选的CD4+群体的纯度和门控。结果证明，在选择和分选上调标记物呈阳性的细胞后，细胞的回收率较高。

图23A-图23C描绘了分选后肿瘤浸润性T淋巴细胞的扩增。图23A描绘了总细胞数，并且图23B描绘了在与或不与加载有野生型肽、肿瘤相关肽或没有加载肽的树突细胞共培养后源自群体4细胞的群体5细胞的扩增倍数。群体4细胞扩增为群体5细胞后，分选后在不同的细胞回收数情况下的预计细胞数示于图23C中。

图24A描绘了在用来自卵巢癌患者的突变(mut)肽或正常野生型(WT)肽刺激后，在大量共培养物、来自大量共培养细胞(富集)的按照CD137和/或CD134表达的阳性分选(选择)群体、或来自大量共培养细胞的阴性分选(未选择)群体内，测量的IFN-γ分泌。图24B描绘了与大量未分选的T细胞相比，阳性分选和阴性分选中肿瘤反应性特异性细胞的新抗原特异性群体的富集。图24C描绘了在未选择和选择的群体中存在的TCR克隆型的数量，并证明未分选的T细胞群体中引进的TCR的多样性是高的，并且在选择的群体中存在独特TCR克隆的富集。图24D描绘了来自样品A的分选之前和之后的细胞群体，观察到它们含有CD4+和CD8+细胞，表明富集群体中存在I类和II类反应性细胞。

图25A描绘了在用来自结直肠癌患者的抗CD3(OKT3)刺激后，在大量共培养物、来自大量共培养细胞(富集)的按照CD137和/或CD134表达的阳性分选(选择)群体或来自大量共培养细胞的阴性分选(未选择)群体内，测量的IFN-γ分泌。图25B描绘了与大量未分选的T细胞相比，阳性分选和阴性分选中肿瘤反应性特异性细胞的新抗原特异性群体的富集。图25C描绘了在未选择和选择的群体中存在的TCR克隆性谱。图25D描绘了分选之前和之后的细胞群体，观察到它们含有CD4+和CD8+细胞，表明富集群体中存在I类和II类反应性细胞。

图26A描绘了在大量共培养物、来自大量共培养细胞(富集)的按照CD137和/或CD134表达的阳性分选(选择)群体、或来自大量共培养细胞的阴性分选(未选择)群体中，肿瘤反应性特异性细胞的新抗原特异性群体的富集。图26B描绘了在未选择和选择的群体中存在的TCR克隆性谱。图26C描绘了分选之前(大量)和之后的细胞群体，观察到它们含有CD4+I类反应性细胞和CD8+II类反应性细胞二者。

具体实施方式

本文提供了制造T细胞的方法。此类方法包括但不限于以下步骤：(1)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体；(2)将所述群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生激活的T细胞的群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(3)在呈递一种或多种MHC相关非天然肽的抗原呈递细胞的存在下，共培养T细胞群体；(4)在封闭系统中将抗原呈递细胞与所述T细胞群体分离；(5)基于在使用无血清培养基的封闭系统中在呈递肽的有核细胞的存在下培养的T细胞上的上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞的新型群体；(6)在使用无血清培养基的封闭系统中，在细胞因子的存在下，扩增所选细胞的新型群体。

根据本文的实施方案，提供了用于制造可用于治疗患有病理性疾病或病症的患者的T细胞制剂的方法或工艺。与已知的生产方法相比，本文所述的方法和工艺可以在显著更短的时间内完成并回收更多数量的内源TCR表达T细胞，从而为使细胞以治疗剂量进入临床提供显著优势。本文还提供了通过本文所述的方法产生的T细胞群体及其药物组合物。

所提供的方法涉及产生对肿瘤相关抗原如新抗原具有反应性的T细胞疗法。作为致瘤过程的一部分，癌细胞积累了许多不同的DNA突变。这些突变会导致蛋白质编码区的氨基酸改变。对于要被免疫系统识别的突变，蛋白质需要在细胞内被加工并由主要组织相容性复合体(MHC)呈递在表面上。肽新抗原(在本文中也称为新表位或肽新表位)是由MHC复合体呈递的突变肽，其可以经由TCR结合而被T细胞识别。为了让免疫系统识别突变，它必须经由MHC复合体在癌细胞表面上表达，并且T细胞必须具有识别突变肽的TCR。这些新抗原可由MHC I类和MHC II类呈递，并分别由CD8+和CD4+T细胞识别。

在一些实施方案中，所述的方法可用于制造表达细胞表面受体的T细胞。细胞表面受体可以是T细胞受体(TCR)或一组新型TCR。在提供方法的特定实施方案中，T细胞群体是或包括表达细胞表面受体如T细胞受体(TCR)的反应性T细胞，所述细胞表面受体能够识别靶细胞表面上的肽抗原。具体来说，对于要被免疫系统识别的抗原，蛋白质需要在细胞内被加工成肽片段，然后肽片段由主要组织相容性复合体(MHC)呈递在表面上。TCR具有两条蛋白链，它们被设计为与某些细胞表面上的主要组织相容性复合体(MHC)蛋白呈递的特异性肽结合。由于TCR识别在靶细胞表面表达的MHC分子的背景中的肽，因此TCR有可能不仅识别直接呈递在靶细胞例如癌细胞表面上的抗原，而且识别由抗原呈递细胞呈递的例如存在于肿瘤、炎症和感染微环境以及次级淋巴器官中的抗原。表达此类细胞表面受体的反应性T细胞可用于靶向并杀伤任何靶细胞，包括但不限于受感染细胞、受损细胞或功能障碍细胞。因此，根据本文所述的实施方案，制造的表达细胞表面受体的T细胞可用于靶向和杀伤任何靶细胞，包括但不限于受感染细胞、受损细胞或功能障碍细胞。此类靶细胞的例子可包括癌细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、功能障碍性激活的炎症细胞(例如，炎症内皮细胞)、以及参与功能障碍性免疫反应的细胞(例如，参与自身免疫疾病的细胞)。

在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是如下分子，所述分子含有可变α和β链(还分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(还分别称为TCRγ和TCRδ)或其抗原结合部分，并且能够特异性结合与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，所述TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR在结构上大体相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能。可以在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现TCR，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。

在一些方面，反应性T细胞是识别癌症新抗原的肿瘤反应性T细胞。大多数新抗原来自乘客突变，这意味着它们不会为癌细胞提供任何生长优势。少数突变积极促进肿瘤生长，这些称为驱动突变。乘客突变可能会产生每个患者独特的新抗原，并且可存在于所有癌细胞的一个子集中。驱动突变产生可能存在于个体的所有肿瘤细胞中的新抗原，并且可能被共享。在所提供方法的一些实施方案中，T细胞群体含有肿瘤反应性T细胞，所述肿瘤反应性T细胞可以识别含有乘客突变和/或驱动突变的新抗原。

在特定方面，所提供的方法可用于离体产生T细胞疗法，包括用于离体扩增自体肿瘤反应性T细胞。在一些方面，新抗原是免疫疗法的理想靶标，因为它们代表疾病特异性靶标。例如，此类抗原在癌症发生之前通常不存在于体内，并且是真正的癌症特异性的，不在正常细胞上表达并且不受脱靶免疫毒性的影响。因此，患者特异性的独特新抗原库可以引发针对癌细胞的强烈免疫应答，从而避开正常细胞。与其他可能不是疾病特异性靶标的细胞疗法靶标相比，这是一个优势，因为在靶向常见抗原的工程化疗法的背景下，即使正常细胞上的靶抗原水平低，也会导致严重的致命性自身免疫毒性。例如，一项针对黑色素瘤患者的抗MAGE-A3-TCR计划因与类似靶标MAGE-A12(其在脑中以低水平表达)的交叉反应性导致的研究相关死亡而中止。癌症免疫疗法中的一个重大挑战是鉴定癌症靶标。

最近的临床研究已证明，从手术切除的肿瘤中分离出的T细胞具有识别新抗原的TCR，并且扩增这些具有新抗原反应性的TIL群体并将它们重新输注入患者体内，在一些情况下可以产生显著的临床益处。这种个性化疗法在某些患有常见上皮肿瘤的患者中已产生了明显的临床反应。

获得和产生肿瘤反应性T细胞的现有方法并不完全令人满意。例如，从受试者中直接分离肿瘤反应性T细胞而不进行扩增是不可行的，因为无法获得治疗有效量的此类细胞。作为替代方案，已尝试鉴定对所需新抗原具有特异性的TCR，以将所述TCR重组工程化到T细胞中，用于过继细胞治疗方法。然而，此类方法仅产生针对特异性新抗原的单一TCR，因此缺乏多样性来识别更广泛的多种肿瘤特异性突变。其他方法涉及大量扩增来自肿瘤来源的T细胞，这有扩增对肿瘤抗原无反应性的T细胞和/或扩增可能包括许多可展现抑制活性的旁邻细胞在内的T细胞的风险。例如，肿瘤调节性T细胞(Treg)是CD4⁺T细胞的亚群，专门抑制免疫应答并且可限制T细胞产物的反应性。这些试图离体扩增肿瘤反应性T细胞的另外的方法不是选择性的，使得培养物中的非反应性T细胞可相对于反应性T细胞优先扩增，导致最终产物缺乏令人满意的反应性和/或其中肿瘤反应性T细胞的数量仍然不足。需要产生用于治疗的肿瘤反应性T细胞的方法。

所提供的实施方案涉及用于鉴定和离体扩增T细胞(包括肿瘤反应性T细胞)以用于T细胞疗法的改进方法。在一些实施方案中，所提供的方法改进或增加体外T细胞如肿瘤反应性T细胞的生长和存活。在特定实施方案中，与非反应性T细胞相比，所述方法富集以扩增反应性T细胞并促进它们在离体培养物中的存活和生长。在一些实施方案中，所得方法可在封闭系统中进行。一些实施方案中的方法以自动化或部分自动化方式进行。

所提供的方法，如基于呈递突变抗原后对上调标记物的选择和/或基于与呈递肽新表位的抗原呈递细胞共培养后富集了肿瘤反应性T细胞的T细胞的扩增，导致富集的对患者特异性突变具有反应性的T细胞群体。例如，培养细胞的方法包括使细胞增殖和扩增的方法，特别涉及如通过选择肿瘤反应性T细胞，或基于在激活T细胞上的与肿瘤反应性T细胞相关或指示肿瘤反应性T细胞的细胞表面分子(T细胞激活标记物)的上调，富集以增殖和扩增肿瘤反应性T细胞的步骤。所提供的方法产生含有肿瘤反应性T细胞的产物，其可以靶向许多突变和/或含有数百种对不同肿瘤抗原具有反应性的TCR。因此，与其中细胞被转导以表达单一新表位反应性TCR的现有方法相比，此类肿瘤反应性T细胞具有优势。

在所提供方法的一些实施方案中，潜在肿瘤肽的来源用于在包括扩增对肿瘤新抗原肽具有反应性的T细胞的过程中鉴定对新抗原具有反应性的TCR。提供的方法包括离体共培养方法，其中将已从生物样品(例如肿瘤碎片或外周血或T细胞的其他来源)中存在的T细胞扩增的T细胞群体在已接触过或呈递新抗原肽的抗原呈递细胞的存在下进行孵育。在特定方面，T细胞和抗原呈递细胞对于从中鉴定出肽的荷瘤受试者是自体的。所提供的方法还包括在进一步离体扩增之前或与其结合的从共培养物中分离、富集和/或选择肿瘤反应性T细胞的步骤。

图1A描绘了根据所提供的方法制造T细胞治疗性组合物的示例性过程的示意图。在示例性过程中，从患者获得肿瘤样品，以用于鉴定和产生如下肽，所述肽用于采用呈递所述肽的抗原呈递细胞(APC)和从同一受试者获得的自体抗原T细胞共培养的方法中。在一些情况下，将来自患者的例如含有肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或外周血淋巴细胞(PBL)的T细胞群体在扩增所述细胞的条件下进行刺激，之后与已接触过或暴露于肽新表位以呈递在主要组织相容性复合体上的抗原呈递细胞共培养。在抗原呈递细胞呈递主要组织相容性复合体背景中的肽的条件下共培养后，可以在根据所提供的方法进行扩增的条件下(如与一种或多种T细胞刺激剂(例如重组IL-2、抗CD3和/或抗CD28)孵育)选择和培养肿瘤反应性T细胞或者与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种T细胞激活标记物(也称为上调标记物或反应性T细胞标记物，例如CD70a)呈表面阳性的T细胞。培养可以在一种或多种重组细胞因子(例如IL-2)的存在下进行，以支持细胞的增殖和扩增。所述过程可以在含有营养物的无血清培养基的存在下进行。一个或多个或所有的所述步骤可以在封闭系统中进行，如不将细胞暴露于环境中。在达到细胞的治疗剂量或阈值数量后，可以收获和配制细胞，在一些情况下浓缩或低温保存，并用于例如通过输注施用于受试者。图1B描绘了示例性过程，其中可以在这些步骤中的一个或多个之后进行低温保存步骤。

所提供的方法与用于产生和扩增TIL的现有方法相比具有优势，因为所提供的方法涉及富集肿瘤反应性细胞的步骤，如通过以下进行：与呈递肽的APC共培养的步骤，随后选择具有上调的一种或多种T细胞激活标记物的反应性T细胞克隆。通过该过程，从生物样品(例如肿瘤)扩增的最初小的肿瘤反应性T细胞群体在随后的第二次扩增步骤之前富集了是或可能是肿瘤反应性细胞的细胞，从而促进了目的细胞的保存和扩增并限制了对肿瘤抗原无反应性和/或可能包含展现抑制活性的细胞的旁邻T细胞的扩增(图2A)。这与现有方法形成对比，现有方法涉及大量T细胞的被动扩增，其中来自肿瘤的所有T细胞进行第一次初始扩增(例如采用高IL-2浓度)，随后是初始扩增后存在的T细胞的第二次快速扩增。在此类其他方法中，虽然总活细胞(TVC)可以通过这些替代过程大力扩增，但没有积极确保肿瘤反应性T细胞占优势地增殖的步骤(图2B)。此外，进行所提供的方法可使得可收集的肿瘤反应性细胞数最大化，例如通过将第一次扩增后增殖的所有细胞与呈递肽的APC共培养，然后在共培养后从所有大量细胞中选择一种或多种激活标记物呈阳性的细胞，之后进行随后的第二次扩增。在所提供方法的方面，所述方法的所有步骤都在封闭系统中进行。

所提供的方法包括一个或多个特征，所述特征提供或涉及用于离体产生肿瘤反应性T细胞治疗性组合物的改进的、更有效的和/或更稳健的方法。特别地，本公开文本涉及提供优于用于产生TIL治疗性细胞组合物的现有方法的优势的方法。此类优势包括：例如，降低成本，精简，改进治疗性组合物中肿瘤反应性T细胞的富集，以及提高治疗性组合物的功效，包括在不同受试者和肿瘤病症中如此。

在本文的发现中，观察到可以在一个或两个成功的扩增步骤期间使用更低浓度的重组IL-2。许多现有方法使用6000IU/mL的高浓度IL-2用于TIL的T细胞扩增。然而，高IL-2浓度会增加该过程的成本并且可能有限制性。在一些情况下，高IL-2浓度可导致通过驱动效应T细胞分化超过早期记忆T细胞(这在治疗性T细胞组合物中可能是更需要的)，从而对T细胞分化产生负面影响。所提供的方法可以在低于6000IU/mL几倍的浓度下进行，如低于或低于约1000IU/mL的浓度，例如从为或为约300IU/mL至为或约1000IU/mL的浓度。在特定实施方案中，IL-2的浓度是为或约300IU/mL。

在所提供方法的实施方案中，T细胞群体获得自已知含有T细胞的生物样品。在一些实施方案中，T细胞群体富集自来自受试者，特别是人受试者的生物样品。生物样品可以是含有大量T细胞群体的任何样品。在一些实施方案中，生物样品是或包括外周血单核细胞。在一些实施方案中，生物样品是外周血或血清样品。在一些实施方案中，生物样品是淋巴结样品。在一些实施方案中，生物样品是肿瘤样品。在一些方面，大量T细胞可以包括肿瘤浸润性T细胞(TIL)。在一些实施方案中，受试者是人受试者。在一些实施方案中，受试者是患有癌症、病毒感染、细菌感染的受试者，或者是患有炎症病症的受试者。在特定实施方案中，受试者患有癌症。

在所提供方法的方面，所述方法中细胞的起始来源可以是肿瘤碎片(例如1-8mm直径的碎片)，或可以是来自肿瘤碎片的酶消化的单细胞悬浮液制剂。在本文中发现，虽然某些来源可能对一些肿瘤类型更有利，但碎片和单细胞悬浮液二者均可以支持T细胞扩增和肿瘤反应性T细胞的富集。在一些情况下，可以根据肿瘤类型或癌症来选择肿瘤细胞来源，从而如优化或增加来自肿瘤的肿瘤反应性T细胞的扩增和富集。在一个例子中，癌症是黑色素瘤，并且淋巴细胞的起始群体是如来自切除的肿瘤的肿瘤碎片。在另一个例子中，癌症是结直肠癌，并且淋巴细胞的起始群体是通过酶(例如胶原酶)消化肿瘤碎片获得的单细胞悬浮液。

在一些实施方案中，所述方法包括将初始扩增的T细胞与已加载肽的自体抗原呈递细胞共培养的步骤。本文的发现证明，相对低浓度的肽或肽库(含有多种肽，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多种，或任何前述值之间的任何值)，如每种单独肽低于20ng/mL，并且甚至低至0.1ng/mL时，可导致培养期间T细胞激活的增加。在一些实施方案中，这可导致在选择一种或多种T细胞激活标记物(即上调标记物或反应性T细胞标记物)呈阳性的细胞之前，在共培养物中改进的肿瘤反应性T细胞富集。在一些实施方案中，所提供方法中的共培养步骤包括如下比率的含有T细胞的肿瘤来源细胞与自体APC(例如树突细胞)：为或约1:5至为或约5:1，如1:3至为或约3:1，例如为或约1:1，并且涉及用单独肽或肽库加载APC。在一些实施方案中，APC加载有一定浓度的肽或肽库，其中单独肽或肽库中的单独肽平均为低于或低于约20ng/mL，如为或约0.1ng/mL至为或约1ng/mL，例如为或约0.1ng/mL。

在一些实施方案中，所提供的方法包括进一步基于反应性或激活T细胞(例如与静息或非激活T细胞相比)上的表达上调或者为反应性或激活T细胞所特有的一种或多种标记物(下文为“反应性T细胞标记物”或T细胞激活标记物)，富集T细胞，如CD3+T细胞或其CD4和/或CD8子集。反应性T细胞在它们的内源TCR识别靶细胞或组织上的抗原时，如在TCR识别肿瘤上的新抗原时，将表达某些反应性标记物。示例性的反应性T细胞标记物包括以下中的一种或多种，如两种、三种、四种或更多种：CD107、CD107a、CD39、CD103、CD137(4-1BB)、CD59、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134(OX40)、CD258、CD256、PD-1、TIM-3或LAG-3。可在扩增方法的一个或多个步骤之前或期间进行反应性或激活T细胞上的一种或多种此类上调标记物呈阳性的细胞的富集或选择。在特定实施方案中，所提供的方法包括在通过与呈递肽的APC(例如DC)共培养孵育来激活T细胞群体之后，富集或选择在反应性或激活T细胞上的一种或多种上调标记物呈阳性的细胞。在一些实施方案中，从共培养物中选择在反应性或激活T细胞上的一种或多种上调标记物呈阳性的细胞的步骤可导致抗原特异性肿瘤反应性T细胞的2倍或更多富集，和/或TCR克隆性的大幅降低(证明TCR克隆型的富集与肿瘤反应性T细胞的富集一致)。另外，与来自共培养物的未选择的T细胞或大量T细胞相比，此类富集的T细胞在抗原特异性刺激后可以展现出改进的产生IFN-γ的能力。

在一些实施方案中，所述方法产生或扩增T细胞以用于治疗疾病或病症的过继细胞疗法，其中与疾病或病症相关的细胞或组织已知或怀疑表达由T细胞识别的抗原靶标。在一些实施方案中，T细胞疗法对于受试者是自体的。在一些实施方案中，T细胞疗法对于受试者是同种异体的。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。

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I.肿瘤反应性T细胞的离体扩增

所提供的方法涉及特别是用于与治疗癌症结合的T细胞治疗性组合物的离体扩增和产生。在一些实施方案中，制造方法涉及在体外患者细胞的生长和操纵。在特定实施方案中，所述方法涉及扩增含有对肿瘤相关抗原具有特异性的内源TCR的T细胞(下文称为“肿瘤反应性T细胞”)的方法。出于本公开文本的目的，肿瘤反应性T细胞的提及包括展现出对肿瘤抗原的反应性的T细胞，或由于在T细胞上表达的蛋白质(仅当T细胞内源TCR识别由APC表达的肽时才会表达，例如T细胞激活标记物)的上调或阳性表面表达而可能或怀疑是肿瘤反应性T细胞的T细胞。在一些方面，这些细胞的频率可能较低，并且为了将这些细胞扩增至治疗剂量，必须采用离体富集和扩增方法。

在所提供方法的实施方案中，含有T细胞的群体(下文也称为第一T细胞群体)是从来自受试者如人受试者的生物样品中获得、选择或分离的T细胞群体，其中所述生物样品含有T细胞。在一些实施方案中，含有T细胞的群体可以来自已知或怀疑含有T细胞的任何来源样品，所述T细胞是或可能包括或潜在地可能包括肿瘤反应性T细胞。样品可以包括含有肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的肿瘤样品、含有外周血单核细胞(PBMC)的血液样品(例如单采术或白细胞单采术样品)或淋巴结样品。在一些实施方案中，样品是含有肿瘤浸润性淋巴细胞或TIL的肿瘤样品或肿瘤碎片。可以直接从受试者(例如健康或癌症受试者)获得含有T细胞的群体，如通过从受试者的生物样品中选择T细胞或其子集。在特定实施方案中，生物样品来自患有肿瘤并且含有肿瘤反应性T细胞或有潜力含有或可能含有可通过所提供的方法富集的肿瘤反应性T细胞的受试者。

在一些实施方案中，所提供的方法包括(1)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体以产生第一T细胞群体；(2)将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生第二激活T细胞群体；(3)在将一种或多种肽(例如肽新表位)(MHC相关非天然肽)呈递于MHC上的抗原呈递细胞的存在下，共培养来自所述第二T细胞群体的细胞，其中所述共培养产生含有或富集对APC的MHC上呈递的肽具有反应性的T细胞(例如肿瘤反应性T细胞)的第三细胞群体；(4)将所述APC与所述第三群体分离以产生含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞的第四群体；并且(5)通过在T细胞刺激剂的存在下孵育，扩增含有肿瘤反应性T细胞的所述第四T细胞群体。在一些实施方案中，(4)中的T细胞的分离可涉及耗尽或去除APC和/或可包括基于反应性或激活T细胞上的上调标记物选择T细胞。在一些实施方案中，这些步骤中的一个或多个可以在使用无血清培养基的封闭系统中进行。

在一些实施方案中，所提供的方法包括(1)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体以产生第一T细胞群体；(2)将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生激活的T细胞的群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(3)在将一种或多种肽(例如肽新表位)(MHC相关非天然肽)呈递于MHC上的抗原呈递细胞的存在下，共培养来自所述第二T细胞群体的细胞，其中所述共培养产生含有或富集对APC的MHC上呈递的肽具有反应性的T细胞(例如肿瘤反应性T细胞)的第三细胞群体；(4)在封闭系统中，从所述第三群体中，将抗原呈递细胞与所述T细胞群体分离；(5)在分离抗原呈递细胞后，基于反应性或激活T细胞上的上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞，以产生第四T细胞群体，其中所述选择是在使用无血清培养基的封闭系统中进行；并且(6)在使用无血清培养基的封闭系统中，在细胞因子的存在下，扩增所选细胞的第四群体。

在一些实施方案中，所提供的方法包括(1)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体以产生第一T细胞群体；(2)将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生激活的T细胞的群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(3)在将一种或多种肽(例如肽新表位)(MHC相关非天然肽)呈递于MHC上的抗原呈递细胞的存在下，共培养来自所述第二T细胞群体的细胞，其中所述共培养产生含有或富集对APC的MHC上呈递的肽具有反应性的T细胞(例如肿瘤反应性T细胞)的第三细胞群体；(4)从所述第三群体中，基于反应性或激活T细胞上的上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞，以产生第四T细胞群体，其中所述选择是在使用无血清培养基的封闭系统中进行；并且(5)在使用无血清培养基的封闭系统中，在细胞因子的存在下，扩增所选细胞的第四群体。

在一些实施方案中，所述T细胞刺激剂包括抗CD3(例如抗CD3抗体，如OKT3)、抗CD28试剂(例如抗CD28抗体)(如抗CD3抗体(例如OKT3)和抗CD28抗体)，和/或一种或多种重组细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-21和/或IL-15)。在特定实施方案中，T细胞的孵育或培养也可用含有营养物的培养基进行，使得细胞可以在体外存活。

在一些情况下，所述方法包括与单独的重组IL-2或者与重组IL-2和一种或多种其他重组细胞因子(例如IL-7、IL-21和/或IL-15)的组合以及在一些情况下一种或多种其他T细胞刺激剂一起孵育，从而为细胞提供初级和次级(共刺激)信号。培养T细胞以向细胞提供初级和次级(共刺激)信号的标准方法涉及与由抗CD3(例如OKT3)和抗CD28试剂提供的T细胞刺激剂一起孵育。在一些实施方案中，所述T细胞刺激剂包括抗CD3抗体(例如OKT3)和抗CD28抗体。通常，此类刺激还包括一种或多种另外的重组细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-21和/或IL-15)和含有营养物的培养基(以使得细胞可以在体外存活)。

所提供的用于扩增肿瘤反应性T细胞的方法涉及第一次扩增，所述第一次扩增涉及用来自(例如IL-2、IL-7、IL-21和/或IL-15)中的一种或多种的重组细胞因子(典型地，通常包括重组IL-2)培养所选择或分离的含有T细胞的群体(即第一T细胞群体)。在一些情况下，一种或多种T细胞刺激剂进一步向细胞提供初级和次级(共刺激)信号，如由抗CD3(例如OKT3)和抗CD28试剂(如抗CD3抗体提供(例如OKT3)和抗CD28抗体)提供的。由于存在于第一群体中的T细胞的扩增或增殖，初始或第一次扩增产生富集了T细胞的第二T细胞群体。

在所提供的方法中，通过一个或多个另外的步骤从在第一步骤中扩增的经刺激的T细胞鉴定或富集肿瘤反应性T细胞，所述一个或多个另外的步骤包括将经刺激的T细胞(第二T细胞群体)与抗原呈递细胞(APC)和包括肿瘤抗原新表位在内的一种或多种肽(APC/肽新表位)离体共培养。在一些实施方案中，所提供的方法包括离体共培养，其中在APC已经被诱导为呈递来自肿瘤相关抗原的一种或多种肽的条件下，将第二T细胞群体与APC(如已暴露于或接触过一种或多种肽例如合成肽的自体APC或人工抗原呈递细胞(aAPC))孵育。在一些实施方案中，T细胞群体是来自患有肿瘤的受试者的自体T细胞，并且合成肽的来源是来自同一受试者的肿瘤抗原的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，来自离体共培养物的细胞是包括肿瘤反应性T细胞的细胞群体(第三群体)，所述肿瘤反应性T细胞识别培养物中呈递于APC的MHC上的肽或被该肽激活。在一些实施方案中，来自离体共培养物的细胞代表富集了肿瘤反应性T细胞的细胞来源。

在一些情况下，可以通过分离或选择表达与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种上调标记物如激活标记物的细胞来进一步富集肿瘤反应性T细胞(进一步分离或选择产生经富集的肿瘤反应性T细胞的第四T细胞群体)。T细胞激活标记物可以包括其表达被上调或为已暴露于抗原并被激活的T细胞所特有的细胞表面标记物。下文描述了此类标记物的示例。

在特定实施方案中，所提供的方法包括如通过选择一种或多种T细胞激活标记物(例如CD107、CD107a、CD039、CD134、CD137、CD59、CD69、CD90、CD38或CD103)呈表面阳性的T细胞，从生物样品(直接来源自体内样品，或来源自与抗原呈递细胞(APC)的离体共培养物)中富集具有识别肿瘤相关抗原例如新抗原的内源TCR的T细胞。

在特定实施方案中，如在分离或选择肿瘤反应性T细胞或者与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞后，对从共培养物富集或分离的T细胞进行第二次扩增。第二次扩增涉及孵育以进一步用一种或多种T细胞刺激剂如抗CD3抗体(例如OKT3)、抗CD28抗体和重组细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-21和/或IL-15)刺激T细胞。T细胞，如肿瘤反应性T细胞或者与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞，被允许根据需要扩增持续某个天数和/或直至满足治疗剂量或收获剂量。然后可以将扩增的T细胞的组合物收获，并配制用于施用于受试者以治疗受试者的癌症。

在特定实施方案中，所提供的方法包括但不限于以下步骤：(1)鉴定、获得或产生含有为受试者肿瘤所特有的新表位的多种肽；(2)获得从供体受试者(如从切除的肿瘤或通过直接从生物样品(例如肿瘤、血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或流体)中选择T细胞)获得的T细胞的群体(第一T细胞群体)；(3)通过用一种或多种T细胞刺激剂(如选自IL-2、IL-7、IL-21和/或IL-15的一种或多种重组细胞因子(例如至少包括重组IL-2))刺激或激活所述第一T细胞群体来进行第一次扩增，以产生含有经扩增或刺激的T细胞的第二T细胞群体，(3)在已经接触过或暴露于多种肽中的一种或多种的抗原呈递细胞(APC)的存在下，在其中所述APC呈递一种或多种MHC相关非天然肽的条件下，共培养含有经刺激的T细胞的所述第二群体，以产生第三T细胞群体；并且(5)从所述第三T细胞群体中富集含有对抗原呈递细胞(APC)上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞，以产生第四T细胞群体。在一些方面，含有内源TCR的T细胞是通过将抗原呈递细胞与T细胞群体分离来富集的。可替代地或另外地，此类细胞是通过选择与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种激活标记物呈表面阳性的T细胞来富集的。在特定实施方案中，如在分离或选择肿瘤反应性T细胞或者与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞后，对从共培养物富集或分离的T细胞进行第二次扩增。第二次扩增涉及孵育以进一步用一种或多种T细胞刺激剂如抗CD3抗体(例如OKT3)、抗CD28抗体、和重组细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-21和/或IL-15)刺激T细胞。

在所提供方法的实施方案中，这些步骤中的一个或多个可以在无血清培养基中进行。在一个实施方案中，无血清培养基是OpTmizer CTS(LifeTech)、Immunocult XF(Stemcell technologies)、CellGro(CellGenix)、TexMacs(Miltenyi)、Stemline(Sigma)、Xvivo15(Lonza)、PrimeXV(Irvine Scientific)、或Stem XVivo(RandD systems)。无血清培养基可以补充有血清替代品，如来自LifeTech的ICSR(免疫细胞血清替代物)。血清替代品(例如，ICSR)的水平可以是例如多至5％，例如约1％、2％、3％、4％或5％。在一些实施方案中，无血清培养基含有0.5mM至5mM的L-谷氨酰胺的二肽形式，如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Glutamax^TM)。在一些实施方案中，L-谷氨酰胺的二肽形式如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，L-谷氨酰胺的二肽形式如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度是或是约2mM。

结合所提供的方法，所述方法导致含有对肿瘤相关抗原具有特异性的内源TCR的T细胞富集，以使得所需治疗细胞的扩增最大化。T细胞，如肿瘤反应性T细胞或者与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种T细胞上调标记物或激活标记物呈表面阳性的T细胞，被允许根据需要扩增持续某个天数和/或直至满足治疗剂量或收获剂量。然后可以将扩增的T细胞的组合物收获，并配制用于施用于受试者以治疗受试者的癌症。

A.新表位鉴定和肽生成

所提供的方法包括计算机生成或鉴定含有至少一种癌症特异性癌症新表位的多种肽(也称为“P”或“n-mer”)的步骤，以及计算机过滤这些肽从而获得新表位序列子集的另外的步骤。在一些实施方案中，使用来自新表位序列子集的序列信息制备至少一种合成肽，然后在根据所提供的方法富集肿瘤反应性T细胞的方法中使用所述合成肽。

在一些实施方案中，通过从受试者的癌细胞鉴定或分离肿瘤相关抗原或其肽序列来确定癌症特异性癌症新表位。癌细胞可以从源自含有或预期含有肿瘤或癌细胞的患者的任何身体样品中获得。身体样品可以是任何组织样品，如血液、从原发性肿瘤或肿瘤转移物获得的组织样品、淋巴结样品、或含有肿瘤或癌细胞的任何其他样品。

在一些实施方案中，肿瘤是血液肿瘤。血液肿瘤的非限制性例子包括：白血病，其包括急性白血病(如l lq23阳性急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性髓细胞性白血病以及成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红细胞白血病)、慢性白血病(如慢性粒细胞(myelocytic/granulocytic)白血病、慢性髓细胞性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高分级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。

在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。实体瘤的非限制性例子，如肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴样恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌(包括基底细胞型乳腺癌、导管癌和小叶乳腺癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。在若干例子中，肿瘤是黑色素瘤、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌或结肠癌。

在一些实施方案中，癌症是涉及胃肠道(GI道)癌症的胃肠癌，所述胃肠癌包括上消化道或下消化道的癌症，或消化的辅助器官如食道、胃、胆道系统、胰腺、小肠、大肠、直肠或肛门的癌症。在一些实施方案中，癌症是食道癌、胃(stomach/gastric)癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、胆囊癌、粘膜相关淋巴组织癌(MALT淋巴瘤)、胆道系统癌症、结直肠癌(包括结肠癌、直肠癌或两者)、肛门癌或胃肠道类癌肿瘤。在特定实施方案中，癌症是结直肠癌。

在一些实施方案中，肿瘤来自乳腺癌，如导管癌或小叶癌。在一些实施方案中，肿瘤来自前列腺癌。在一些实施方案中，肿瘤来自皮肤癌，如基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，肿瘤来自肺癌，如腺癌、支气管肺泡癌、大细胞癌或小细胞癌。在一些实施方案中，肿瘤来自脑癌，如胶质母细胞瘤或脑膜瘤。在一些实施方案中，肿瘤来自胃肠癌，如上文所述的任一种。在一些实施方案中，肿瘤来自结肠癌。在一些实施方案中，肿瘤来自肝癌，如肝细胞癌。在一些实施方案中，肿瘤来自胰腺癌。在一些实施方案中，肿瘤来自肾癌，如肾细胞癌。在一些实施方案中，肿瘤来自睾丸癌。

在一些实施方案中，癌症不是黑色素瘤。黑色素瘤是一种通常具有高突变率的癌症。高肿瘤突变负荷被认为是与靶向肿瘤新抗原的免疫疗法治疗相关的成功的特别理想的预后标记物(Simpson等人,Journal of Clinical Oncology 2017,35:15_suppl,9567-9567；McGranahan等人Science2016,351:1463-1469)。在一些实施方案中，所提供的方法可用于具有较低肿瘤突变负荷的癌症，因为进行这些方法可主动(与被动相反)富集肿瘤反应性T细胞。

在一些实施方案中，受试者是具有小于8个突变的肿瘤突变负荷(TMB)的受试者。TMB包括每种肿瘤的非同义突变数。在一些实施方案中，TMB可以通过计入跨0.8-至1.2-兆碱基(Mb)区域的同义和非同义突变的数量，并将结果报告为突变/Mb来计算。在一些实施方案中，可以通过对肿瘤组织样品进行下一代测序(NGS)来确定TMB。在一些情况下，可以使用全外显子组测序或可以使用计算种系状态过滤(Chalmers等人Genome Med 2017 9:34)。在一些实施方案中，受试者的TMB小于或小于约60个突变/Mb，如小于或小于约55个突变/Mb、小于或小于约50个突变/Mb、小于或小于约45个突变/Mb、小于或小于约40个突变/Mb、小于或小于约30个突变/Mb、小于或小于约25个突变/Mb、或小于或小于约20个突变/Mb，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，受试者的TMB小于或小于约41个突变/Mb、小于或小于约40个突变/Mb、小于或小于约39个突变/Mb、小于或小于约38个突变/Mb、小于或小于约37个突变/Mb或更少。

在一些实施方案中，肽(P)是源自癌前病症的肿瘤相关抗原，所述癌前病症如原位癌变体、或外阴上皮内瘤变、宫颈上皮内瘤变或阴道上皮内瘤变。

在一些方面，获得来自肿瘤或癌症的此类细胞的核酸并测序。在实施方案中，获得基因组中基因的蛋白质编码区，如通过组学分析，如通过全基因组测序数据、外显子组测序数据和/或转录组数据的分析。为了鉴定肿瘤特异性序列，可以将测序数据与参考测序数据(如从同一受试者的正常细胞或非癌细胞获得的数据)进行比较。在一些实施方案中，使用下一代测序(NGS)方法。

在一些实施方案中，所述方法包括使用肿瘤的匹配的正常组学数据的步骤。在此类方法中，计算机分析涉及组学分析，以鉴定肿瘤中相对于同一患者的正常组织(如同一患者的非患病组织)而言的突变。通常预期匹配的正常组学数据是全基因组测序数据、外显子组测序数据和/或转录组数据，并且匹配的正常组学数据与患者治疗前的正常情况匹配。在一个特定实施方案中，对健康和患病组织进行全外显子组测序以鉴定与肿瘤相关的体细胞突变。

在一些实施方案中，组学数据是按照标准组织处理方案和测序方案从一个或多个患者活检样品获得的。在特定实施方案中，数据是患者匹配的肿瘤数据(例如，肿瘤相比于同一患者正常情况)。在一些情况下，不匹配或匹配的相比于其他参考(例如，先前同一患者正常情况或先前同一患者肿瘤，或同质统计)也被视为适用于本文。组学数据可以是新的组学数据或从先前程序(或甚至不同的患者)获得的组学数据。例如，可以在第一步中通过对肿瘤活检(或淋巴活检或转移部位的活检)和匹配的正常组织(即来自同一患者的非患病组织，如外周血)的全基因组和/或外显子组分析从患者肿瘤中鉴定新表位。在一些实施方案中，基因组分析可以通过如此获得的组学信息的位置引导同步比较来处理。

基因组分析可以通过许多分析方法进行。在特定实施方案中，所述方法包括使用下一代测序如大规模平行测序方法、离子激流测序、焦磷酸测序，对肿瘤和匹配的正常样品两者的WGS(全基因组测序)和外显子组测序。序列数据的计算分析可以以多种方式进行。在一些实施方案中，数据格式为SAM、BAM、GAR或VCF格式。作为例子，可以在计算机中通过对肿瘤和正常样品的位置引导同步比对进行分析，如例如在使用BAM文件和BAM服务器的US2012/0059670 A1和US 2012/0066001 A1中披露的。还考虑了用于序列分析的替代文件格式(例如SAM、GAR、FASTA等)。

在一些实施方案中，包含由错义突变产生的新抗原的肽(P)涵盖由1个或多个核苷酸多态性编码的氨基酸改变。包含由移码突变、剪接位点变异、插入、倒位和缺失产生的新抗原的肽(P)应涵盖新型肽序列和新型肽序列的连接处。包含具有新型翻译后修饰的新抗原的肽(P)应涵盖带有一种或多种翻译后修饰(如磷酸酯或聚糖)的氨基酸。

一旦鉴定到这些突变，则就鉴定到新表位。新表位是被患者T细胞识别的突变肽。这些新表位必须由肿瘤或抗原呈递细胞通过MHC复合体呈递，然后被T细胞上的TCR识别。在一些实施方案中，所提供的方法包括计算一种或多种新表位以限定为肿瘤和患者所特有的新表位的步骤。因此，应认识到，患者和癌症特异性新表位可以在最终预测为患者和肿瘤类型所独特的潜在表位的完全计算机环境中从组学信息中鉴定出来。在特定方面，如此鉴定的癌症新表位对于患者和患者中的特定癌症是独特的(例如，频率低于所有新表位的0.1％，并且更典型地在诊断患有相同癌症的癌症患者群体中低于0.01％)，但如此鉴定的癌症新表位很有可能呈现于肿瘤中。

在任何实施方案的一些中，肽(P)的长度取决于具体应用并且通常在约5至约50个氨基酸之间。在优选的实施方案中，肽(P)在约7至35个氨基酸之间，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸。在一些方面，所述方法可以用在氨基酸序列中包括一个或多个改变(例如突变)的单独肽来进行。在一些方面，所述方法可以用肽库进行，其中所述库的肽在氨基酸序列中包含一个或多个改变(例如突变)。肽库可以包括数十至数百种单独肽。在一些情况下，肽库包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多种单独肽，或任何前述值之间的任何值。肽库可以代表一种新抗原或可以代表若干种新抗原。在一些情况下，肽库可以包括相同新抗原的多个重叠肽。因此，对于肿瘤相关抗原，抗原可分为7至35个氨基酸例如25个氨基酸的肽(P)，其中每种肽(P)含有独特的氨基酸组成；或者，肽(P)可以是重叠肽库，其中抗原被分成一定数量的7至35个氨基酸例如25个氨基酸的具有重叠序列的肽(P)。在一些情况下，重叠抗原库的肽各自可偏移一定数量的氨基酸残基，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、15或15个氨基酸。在一些实施方案中，重叠抗原库的肽各自偏移10个氨基酸。在一些实施方案中，重叠抗原库的肽各自偏移12个氨基酸。例如，包含100个氨基酸的抗原的重叠肽库可分为八个25个氨基酸的肽(P)，这些肽各自偏移12个氨基酸(即，包含100个氨基酸的肽序列的每个后续25个氨基酸的肽在前一个肽的第13个氨基酸位置处开始)。本领域技术人员理解，存在许多用于从抗原生成肽库的排列。

如本文所考虑的新表位序列可以定义为具有相对较短长度(例如5-30mer，更通常为7-11mer，或12-25mer)的序列段，其中此类段在氨基酸序列中包括一个或多个改变(例如突变)。最通常地，所述一个或多个改变位于中心或靠近中心(例如，距中心位置少于4个、或少于5个、或少于6个氨基酸)。在特定方面，本文考虑的新表位序列将尤其包括其中单一氨基酸相对于匹配的正常序列发生交换、并且其中改变的氨基酸的位置位于新表位序列的中心或靠近中心(例如，在9-mer中，改变的氨基酸位于位置2、3、4或5，并且更通常位于位置3、4或5，并且最通常位于位置4或5)的那些序列。应理解，取决于改变的氨基酸的位置，单一氨基酸改变可以呈现于包括改变的氨基酸的许多新表位序列中。

在特定实施方案中，新表位将被计算为具有2-50个氨基酸之间、更通常5-30个氨基酸之间、以及最通常9-15个氨基酸之间的长度。例如，当表位有待由MHC-I复合体呈递时，典型表位长度为约8-11个氨基酸，而经由MHC-II复合体呈递的典型表位长度为约13-17个氨基酸。很容易理解，由于新表位中改变的氨基酸的位置可能不是在中心，因此新表位的实际肽序列连同实际拓扑结构可能会有很大变化。此外，当新表位作为合成肽被呈递给免疫感受态(或其他)细胞时，应理解合成肽可能比最终由MHC-I或MHC-II系统结合的肽部分显著更长，从而允许在细胞中进行蛋白水解加工。例如，考虑的合成肽因此可以具有在改变的氨基酸的上游和下游8与15个之间的氨基酸。

已经开发了各种算法，并且可用于为各种来源的蛋白质分子内的T细胞表位作图(MHC I类和II类二者限制性的)。在一些实施方案中，许多程序利用来自实验测量的大规模肽-MHC结合亲和力矩阵的可用性来训练基于机器学习(ML)的分类器以区分MHC-结合物与非结合物(参见例如Zhao等人(2018)PLoS Comput Biol 14(11):e1006457)。MHC I类(例如9-mer)的示例性预测方法包括smm、smmpmbec、ann(NetMHC3.4)、NetMHC4、PickPocket、consensus、NetMHCpan2.8、NetMHCpan3、NetMHCpan4、NetMHCcons、mhcflurry、mhcflurry_pan或MixMHCpred。MHC II类(例如15-mer)的示例性预测方法包括NetMHCIIpan、NetMHCII2.3、nn_align、smm_align、consensus、comblib、tepitope或mhcflurry。可以使用任何此类方法。

在合成肽用于直接MHC-I结合的实施方案中，总长度将在8与10个氨基酸之间。在合成肽用于直接MHC-II结合的实施方案中，总长度将在12与25个氨基酸之间，如在14与20个氨基酸之间。在合成肽在MHC呈递之前在细胞中被加工(通常经由蛋白酶体加工)的一些情况下，总长度通常在10与40个氨基酸之间，其中改变的氨基酸位于或靠近合成肽中心位置。在一些实施方案中，用于MHC-I结合的肽是9-mer。在一些实施方案中，用于MHC-II结合的肽是23-mer。在一些实施方案中，用于MHC-II结合的肽是25-mer。

例如，肽(P)可以在侧接由于突变产生的一个氨基酸改变或新型连接处的任一侧包括0-25个氨基酸。在一个实施方案中，肽(P)是如下新抗原序列，其在侧接由于单核苷酸多态性产生的一个氨基酸改变的任一侧包含12个氨基酸，例如25个氨基酸的肽，其中第13个氨基酸是由单核苷酸多态性产生的氨基酸残基。在一些实施方案中，肽(P)是如下新抗原序列，其在侧接具有新型翻译后修饰的一个氨基酸的任一侧包含12个氨基酸，例如25个氨基酸的肽，其中第13个氨基酸是由新型翻译后修饰位点产生的氨基酸残基。在其他实施方案中，肽(P)是如下新抗原序列，其在侧接由插入、缺失或倒位产生的一个新型连接处的任一侧包含0-12个氨基酸。在一些情况下，包含由新型序列产生的新抗原的肽(P)可以涵盖整个新型序列，其在也可能出现的多个新型连接处的任一侧包括0-25个氨基酸。

在一些实施方案中，可以对如此鉴定的序列差异进行进一步的下游分析，以鉴定基于癌症和患者特异性突变产生新肽序列的那些序列差异。因此可以通过考虑突变的类型(例如缺失、插入、颠换、转换、易位)和影响(例如无义、错义、移码等)来鉴定新表位，并且可以这样作为内容过滤器，通过所述内容过滤器消除沉默和其他不相关的(例如未表达的)突变。

在一些实施方案中，可以针对经鉴定的患者HLA型在计算机中进一步过滤经鉴定的新表位。这种HLA匹配被认为可确保新表位与有核细胞的MHC-I复合体和特定抗原呈递细胞的MHC-II复合体的强结合。特别地，认为靶向两种抗原呈递系统会产生治疗有效且持久的涉及免疫系统的细胞和体液分支二者的免疫应答。还应理解，由此鉴定的HLA匹配的新表位可以在体外进行生物化学验证。

MHC-I和MHC-II二者的HLA测定可以使用多种方法进行。在一些实施方案中，可以在计算机中使用包含大部分或所有已知和/或常见HLA型的参考序列从组学数据预测HLA型。例如，确定患者的HLA型(使用湿化学或计算机确定)，并根据数据库计算或获得HLA型的结构解，然后将其用作计算机中的对接模型以确定新表位与HLA结构溶液的结合亲和力。用于确定结合亲和力的合适系统包括NetMHC平台(参见例如Nucleic Acids Res.2008年7月1日；36(Web Server issue):W509-W512.)、HLAMatchmaker(http://www.epitopes.net/downloads.html)和IEDB Analysis Resource(http://tools.immuneepitope.org/mhcii/)。然后选择对先前测定的HLA型具有高亲和力(例如，对于MHC-I小于100nM、小于75nM、小于50nM；对于MHC-II小于500nM、小于300nM、小于100nM)的新表位。在计算最高亲和力时，对新表位的修饰可以通过向表位添加N端和/或C端修饰来实现，以进一步增加合成新表位与患者HLA型的结合。因此，新表位可以是如鉴定为天然的，或被进一步修饰以更好地匹配特定的HLA型。在一些实施方案中，可以基于等位基因频率乘以每百万数量的转录物来对新表位进行评分/排序以获得可能性得分。然后可以使用HLA信息和计算的或实际的对患者HLA型的结合亲和力进一步增加该得分。

所提供的实施方案包括这样的实施方案，其中将新表位与含有已知人类序列的数据库进行比较以避免使用人类相同的序列。

在计算机鉴定合适的新表位序列之后，然后在体外制备相应的合成肽(例如，使用固相合成)。在特定实施方案中，制备代表来自受试者的多个不同新表位的合成肽文库。所述文库可以包括100、1000、10000或更多种不同的肽。为了获得针对所鉴定的一种或多种新表位的合成抗体，预期在体外制备所鉴定的表位以产生合成肽。

可以使用多种方法来制备合成肽。例如，可以在固相上(例如，使用Merrified合成)、通过液相合成或从较小的肽片段制备具有癌症新表位序列的肽。可以使用可商购的自动肽合成仪通过化学合成获得肽表位。在一些实施方案中，可以例如通过使用由Lu等人(1981).J.Org.Chem.46,3433以及其中的参考文献披露的固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式来合成肽。在一些方面，可以通过在合适的宿主中和用合适的表达系统表达重组核酸来产生肽。在一些方面，可以使用如下重组方法，其中多个新表位位于单一肽链上，如在新表位或切割位点之间具有间隔子。

可以通过任何一种技术或技术的组合纯化肽，所述技术如重结晶、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、和使用例如乙腈/水梯度分离的反相高效液相色谱。在一些实施方案中，可以将肽沉淀，并例如通过高效液相色谱(HPLC)进一步纯化。肽的分析可以使用以下进行：薄层色谱、电泳(特别是毛细管电泳)、固相萃取(CSPE)、反相高效液相色谱、酸水解后的氨基酸分析和快速原子轰击(FAB)质谱分析、以及MALDI和ESI-Q-TOF质谱分析。

B.T细胞群体的选择和刺激

所提供的方法包括从生物样品中获得和富集或选择T细胞群体以用作第一T细胞群体或输入T细胞群体。在一些情况下，如在与自体肿瘤抗原来源进行离体共培养后，第一T细胞群体已知或可能含有对肿瘤抗原具有反应性或能够对肿瘤抗原发生反应的T细胞。例如，通常第一T细胞群体来自生物样品，所述生物样品来自肿瘤或来自已知或可能患有肿瘤的受试者。在特定实施方案中，将第一T细胞群体进一步用一种或多种T细胞刺激剂(例如一种或多种重组细胞因子，如IL-2)刺激以产生含有已经在刺激后扩增的T细胞的第二T细胞群体或经刺激的T细胞群体。

在一些实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂的孵育直接对从受试者的生物样品选择的输入T细胞群体或第一T细胞群体进行，其中将从生物样品选择的T细胞(例如来自受试者的自体T细胞)群体与一种或多种T细胞刺激剂一起孵育。在其他实施方案中，所述输入T细胞群体包括可能是或怀疑是肿瘤反应性T细胞的T细胞，其中将此类细胞首先通过选择在激活T细胞上上调的表面标记物(例如4-1BB或OX40)呈阳性的细胞来从选择自受试者生物样品的T细胞群体选择。在此类实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂的孵育是在富集包含肿瘤反应性T细胞的T细胞群体之后进行的。在所提供的实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂的孵育是在将此类T细胞(经刺激的T细胞)与APC/肽新表位共培养之前进行的。

在一些情况下，通过用一种或多种T细胞刺激剂培养来刺激T细胞的条件导致细胞的激活以及存在于第一T细胞群体或输入T细胞群体中的T细胞的扩增或生长。在一些实施方案中，用一种或多种T细胞刺激剂刺激T细胞的条件可以包括在导致T细胞大量扩增的条件下培养T细胞。

在所提供的方法中，然后在随后的下游步骤中使用经刺激的T细胞组合物以用于肿瘤反应性T细胞的富集和扩增，包括如下步骤，所述步骤包括在T细胞新表位(突变)肽抗原的存在下将经刺激的T细胞与抗原呈递细胞(APC)共培养，以产生、生成或选出作为肿瘤反应性T细胞的T细胞。在特定实施方案中，所提供的方法还可包括在将T细胞与APC/肽新表位共培养之后选择或富集对肿瘤抗原具有反应性的T细胞(肿瘤反应性T细胞)的步骤。可以将肿瘤反应性T细胞群体在扩增条件下培养，如以产生治疗性T细胞组合物。

在任何所提供的方法的方面，将输入T细胞群体或第一T细胞群体在一种或多种T细胞刺激剂的存在下孵育。在特定实施方案中，孵育是在其中一种或多种T细胞刺激剂激活或刺激细胞或促进存在于输入T细胞群体或第一T细胞群体中的T细胞扩增的条件下进行。

在一些实施方案中，一种或多种T细胞刺激剂包括T细胞刺激性重组细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子包括单独的或与IL-7、IL-15和/或IL-21中的另一种细胞因子组合的IL-2。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子是IL-7和IL-15。

在一些实施方案中，一种或多种T细胞刺激剂可以包括与CD3和/或共刺激分子(如CD28)接合的一种或多种药剂。一种或多种T细胞刺激剂可包括抗CD3抗体(如OKT3)和/或抗CD28药剂(由APC呈递或作为可溶性抗体)。在实施方案中，在T细胞与APC共培养的至少一部分之前和/或期间，将从生物样品选择的T细胞(即输入群体或第一群体)在一种或多种T细胞刺激剂(如抗CD3(例如OKT3)/抗CD28抗体)的存在下孵育。因此，无论是在APC存在下共培养之前还是在选择反应性细胞之后，将T细胞与淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂(如但不限于抗CD3抗体(例如OKT3)和抗CD28(由APC呈递或作为可溶性抗体))一起孵育，以产生包括经激活或刺激的T细胞的第二T细胞群体。在特定实施方案中，在孵育期间，一种或多种重组细胞因子也作为另外的T细胞刺激剂存在。

在一些实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂如抗CD3/抗CD28抗体的孵育可以持续足以激活或刺激细胞的时间段。在一些实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂(如抗CD3/抗CD28抗体)的孵育进行为或约1天，如通常为或约2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天或前述任何时间之间的任何时间范围。在一些实施方案中，孵育进行7-10天。在一些实施方案中，孵育持续为或约7天。在一些实施方案中，孵育持续为或约8天。在一些实施方案中，孵育持续为或约9天。在一些实施方案中，孵育持续为或约10天。在一些实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂(如抗CD3/抗CD28抗体)和在一些情况下一种或多种重组细胞因子的孵育持续12小时至96小时，如24小时至48小时，并且通常为或约48小时。

在一些实施方案中，在培养期间，将细胞洗涤一次或多次，以去除在孵育或培养期间存在的药剂和/或用一种或多种另外的药剂补充培养基。在一些实施方案中，在孵育或培养期间洗涤细胞，以在培养完成之前减少或去除所述一种或多种T细胞刺激剂。

在一些实施方案中，本文提供的刺激T细胞的方法包括在适合人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30度，并且通常为或约37摄氏度下，与一种或多种T细胞刺激剂一起孵育。在一些实施方案中，培养或孵育方法在无血清培养基中进行。

1.选择T细胞群体

所提供的方法包括从可用作T细胞来源或输入的生物样品中选择或获得T细胞群体，以用于用一种或多种T细胞刺激剂(例如重组IL-2或其他T细胞刺激性细胞因子和/或抗CD3/抗CD28)进行刺激。在一些实施方案中，T细胞来自已知或可能含有肿瘤反应性T细胞的受试者的生物样品。收集的生物样品含有或怀疑含有具有对肿瘤上存在的突变具有反应性的内源TCR的淋巴细胞。

在任何所提供的实施方案的方面，获得来自受试者(如来自感兴趣的患者，即怀疑患有或已知患有癌症的患者)的合适的生物样品。在一些实施方案中，样品是已知或怀疑含有T细胞的样品，所述T细胞如可以或可能表达对肿瘤相关抗原具有特异性的、结合或识别肿瘤相关抗原的内源T细胞受体(TCR)的T细胞。样品可以源自任何可能含有或怀疑含有此类T细胞的初始来源。在一些方面，感兴趣的生物样品来源包括但不限于许多不同的生理来源，例如组织来源的样品(例如匀浆)和血液或其衍生物。

各种样品中的任何一种都可以用作潜在反应性T细胞的来源。尽管肿瘤和下游淋巴结可具有最高频率的反应性T细胞(Powell等人,Clin.Cancer.Res.,2014)，但也可以使用其他样品来源。在一些情况下，样品是肿瘤样品、三级淋巴部位、引流淋巴结、外周血或骨髓。在一些实施方案中，样品是肿瘤样品。在一些实施方案中，样品是淋巴样品。在一些实施方案中，样品是外周血样品。

样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个处理步骤(如分离(例如选择或富集)、离心、洗涤和/或孵育)的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自它们的经处理的样品。

在一些方面，样品是血液或血液来源的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳房、骨、前列腺、宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自它们的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。

在许多实施方案中，样品可以源自至少怀疑存在目的T细胞的流体。在许多实施方案中，样品的合适初始来源是血液。在一些实施方案中，生物样品是血液来源的样品。血液来源的样品可以源自全血或其部分，例如血清、血浆等，其中在许多实施方案中，样品源自从全血中收获的血细胞。在一些方面，样品来源含有单核细胞。例如，生物样品是或含有外周血单核细胞(PBMC)或源自PBMC。

在样品是PBMC来源的样品的一些实施方案中，样品通常是流体PBMC来源的样品。可以使用任何便利的方法来产生流体PBMC样品。在许多实施方案中，流体PBMC来源的样品是通过以下方式制备的：从全血分离PBMC，即收集PBMC，例如通过离心(如通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心，其中此类分离程序的代表性方案披露于WO 98/15646和美国专利号5,985,565)。

在一些实施方案中，样品是肿瘤样品，从而提供肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的来源。在一些方面，TIL是离开受试者血流并迁移到或渗入肿瘤中的T细胞。在特定方面，TIL对肿瘤抗原具有反应性。

患者肿瘤样品可以通过多种方法中的任一种获得，其中所述方法获得含有肿瘤和TIL细胞混合物的样品。在一些实施方案中，肿瘤样品通过手术切除获得。在一些实施方案中，肿瘤样品通过针吸活检获得。通常，肿瘤样品可以来自任何实体瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样品也可以是液体瘤，如从血液恶性肿瘤获得的肿瘤。实体瘤可以是任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌(胃肠道癌)和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在特定实施方案中，肿瘤是如第III节中所述的任何肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤样品的肿瘤来源与用于鉴定用于制备肽新表位的新抗原的肿瘤来源相同。

在所提供的实施方案中，将获得的肿瘤样品破碎成大小在为或约1mm³与为或约8mm³之间，如在为或约1mm³与为或约6mm³之间，在为或约1mm³与为或约4mm³之间，在为或约1mm³与为或约2mm³之间的小块。在一些实施方案中，肿瘤碎片是约2-3mm³。在一些实施方案中，肿瘤碎片是约1-2mm³。在一些实施方案中，肿瘤碎片是通过物理破碎获得的，如是通过解剖获得的。在一些实施方案中，肿瘤碎片是通过锐剥离获得的。

在任何所提供的实施方案的一些中，将获得的肿瘤样品破碎成直径在为或约1mm与为或约8mm之间，如直径在为或约1mm与为或约6mm之间，直径在为或约1mm与为或约4mm之间，直径在为或约1mm与为或约2mm之间的小块。在一些实施方案中，肿瘤碎片的直径是约2-3mm。在一些实施方案中，肿瘤碎片的直径是约1-2mm。在一些实施方案中，肿瘤碎片是通过物理破碎获得的，如是通过解剖获得的。在一些实施方案中，肿瘤碎片是通过锐剥离获得的。

在一些实施方案中，肿瘤样品在碎裂之前被低温保存。在一些实施方案中，肿瘤碎片被低温保存。

在一些实施方案中，将获得的肿瘤碎片置于在介导T细胞激活和/或维持T细胞扩增的条件下的且具有适当营养物的培养基中，所述条件如下文I.B.2小节中描述的刺激T细胞的任何条件。在一些实施方案中，将1至500个肿瘤碎片(例如每个的大小为1-8mm)在扩增条件下置于适当的培养器皿中。在一些实施方案中，在扩增条件下培养10、20、30、40、50或更多个碎片。培养器皿可以是微孔、烧瓶、管、袋或其他封闭系统装置。在一些实施方案中，培养器皿是提供透气表面区域的封闭容器，如透气烧瓶。提供透气表面区域的示例性培养器皿包括G-Rex板或烧瓶。在一些实施方案中，对于培养器皿的每个约2cm²区域放置1个肿瘤碎片(直径约1-8mm)。可以基于可用肿瘤碎片的数量和/或所需的细胞产量来选择特定的培养器皿。可以通过线性缩放接种到培养器皿表面区域的碎片数量来选择培养器皿(例如G-Rex)选项。在一些实施方案中，培养器皿的表面积为约2cm²(例如G-Rex 24孔板)，并且将约1个肿瘤碎片(直径约1-8mm)置于培养器皿中。在一些实施方案中，培养器皿的表面积为约10cm²(例如G-Rex 10或G-Rex 10M)，并且将约5个肿瘤碎片(每个的直径约1-8mm)置于培养器皿中。在一些实施方案中，培养器皿的表面积为约100cm²(例如G-Rex 100M/100M-CS)，并且将约50个肿瘤碎片(每个的直径约1-8mm)置于培养器皿中。在一些实施方案中，培养器皿的表面积为约500cm²(例如G-Rex 500M/500M-CS)，并且将约250个肿瘤碎片(每个的直径约1-8mm)置于培养器皿中。在所提供的方法的方面，与涉及较小培养器皿和/或每个容器较少碎片的方法相比，增加培养器皿的大小并因此增加每个容器的肿瘤碎片数量可以降低可变性，如通过汇集更多数量的碎片以最小化碎片之间的肿瘤间可变性。

在一些实施方案中，将肿瘤碎片置于培养基中以使用下文小节I.B.2中描述的任何条件刺激细胞。在一些实施方案中，培养基是无血清培养基，其含有来自IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的重组细胞因子，如重组IL-12或重组IL-7和IL-15。重组细胞因子的浓度可包括如所述的任何浓度。在特定实施方案中，培养基是含有重组IL-2(如从为或约300IU/mL至为或约1000IU/mL，例如为或约300IU/mL)的无血清培养基。在一些实施方案中，培养基是含有抗CD3抗体和/或CD28靶向剂(例如抗CD28抗体)和一种或多种重组细胞因子(例如IL-2)的无血清培养基。

在一些实施方案中，所提供的方法涉及从肿瘤碎片获得细胞，如通过对肿瘤碎片进行酶消化以获得TIL。酶消化可以使用胶原酶如IV型胶原酶或I/II型胶原酶进行。酶，如胶原酶，可以以如下浓度存在于培养基中用于酶消化：从为或约1mg/mL至为或约5mg/mL，如为或约1mg/mL、为或约2mg/mL、为或约3mg/mL、为或约4mg/mL、或者为或约5mg/mL，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，酶消化是用包含IV型胶原酶(如从为或约1mg/mL至为或约5mg/mL)的培养基进行。在一些实施方案中，酶消化是用包含I/II型胶原酶(如从为或约1mg/mL至为或约5mg/mL)的培养基进行。在其他实施方案中，可以使用来自Miltenyi人肿瘤解离试剂盒(例如Cat.O.130-095-929；Miltenyi Biotec)的酶。含有酶的酶培养基可以是无血清培养基，如所述的任何培养基。在特定实施方案中，酶培养基包括胶原酶，例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸盐(例如GlutaMAX)、10mg/mL庆大霉素、30单位/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)。在一些实施方案中，酶培养基包括含有以下的无血清培养基(例如OpTmizer)：2mM谷氨酸盐(例如GlutaMAX)、10μg/mL庆大霉素、免疫细胞血清替代品(例如CTS免疫细胞血清替代品)和1.0mg/mL至5.0mg/mL胶原酶)。在一些实施方案中，胶原酶是IV型胶原酶。在一些实施方案中，胶原酶是I/II型胶原酶。

然后例如使用组织解离器来机械解剖肿瘤碎片以解离TIL。组织解离器的例子是GentleMACs^TM(Miltenyi Biotec)，用于匀浆化组织。可通过以下方式产生肿瘤消化物：将肿瘤置于酶培养基中并机械解离肿瘤大约1分钟，然后在37℃下在5％CO₂中孵育30分钟，随后在前述条件下重复机械解离和孵育循环直到只有小组织块存在。在此过程结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可以使用FICOLL进行密度梯度分离以去除这些细胞。在一些情况下，可以通过离心来实现分离，在这种情况下，可以将细胞沉淀重新悬浮并通过例如70μm过滤器过滤以去除碎屑。可以使用本领域已知的替代方法，如美国专利申请公开号2012/0244133A1中描述的那些，其披露内容通过引用并入本文。任何前述方法可用于本文描述的用于获得在所提供的方法中使用的TIL的方法的任何实施方案中。

在一些实施方案中，将来自肿瘤碎片的消化细胞置于在介导T细胞激活和/或维持T细胞扩增的条件下的且具有适当营养物的培养基中，所述条件如下文I.B.2小节中描述的刺激T细胞的任何条件。将细胞以适合于特定培养器皿的特定密度接种。培养器皿可以是微孔、烧瓶、管、袋或其他封闭系统装置。在一些实施方案中，培养器皿是提供透气表面区域的封闭容器，如透气烧瓶。提供透气表面区域的示例性培养器皿包括G-Rex板或烧瓶。在一些实施方案中，对于培养器皿的每个约2cm²区域，接种酶消化单细胞悬浮液的大约5x10⁵至2x10⁶个细胞。可以基于可用细胞的数量和/或所需的细胞产量来选择特定的培养器皿。可以通过线性缩放接种到培养器皿表面区域的细胞数来选择培养器皿(例如G-Rex)选项。在一些实施方案中，培养器皿的表面积为约2cm²(例如G-Rex 24孔板)，并且将酶消化的单细胞悬浮液的约5x10⁵至2x10⁶个细胞置于培养器皿中。在一些实施方案中，培养器皿的表面积为约10cm²(例如G-Rex 10或G-Rex 10M)，并且将酶消化的单细胞悬浮液的约2.5x10⁶至1x10⁷个细胞置于培养器皿中。在一些实施方案中，培养器皿的表面积为约100cm²(例如G-Rex 100 M/100M-CS)，并且将酶消化的单细胞悬浮液的约2.5x10⁷至1x10⁸个细胞置于培养器皿中。在一些实施方案中，培养器皿的表面积为约500cm²(例如G-Rex 500 M/500M-CS)，并且将酶消化的单细胞悬浮液的约1.25x10⁸至5x10⁸个细胞置于培养器皿中。

在一些实施方案中，培养基是含有重组IL-2的无血清培养基。在一些实施方案中，还可以包括一种或多种另外的T细胞刺激剂。在一些实施方案中，培养基是含有抗CD3抗体和/或CD28靶向剂(例如抗CD28抗体)和一种或多种重组细胞因子(例如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21)的无血清培养基。

样品可以从各种不同的受试者/患者/宿主获得。通常，此类宿主是“哺乳动物”(“mammal”或“mammalian”)，其中这些术语被广泛用于描述哺乳纲中的生物，包括食肉目(例如，狗和猫)、啮齿目(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如，人、黑猩猩和猴子)。在许多实施方案中，宿主将是人。

在一些方面，受试者是人。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。在一些实施方案中，样品对于待治疗的受试者是自体的，如作为需要特定治疗干预(如根据提供的方法分离、处理和/或扩增细胞所用于的过继细胞疗法)的患者的受试者。在一些实施方案中，样品对待治疗的受试者是同种异体的。

在一些实施方案中，可通过多种方式(包括但不限于磁珠分离、荧光细胞分选和基于一次性封闭盒的细胞分选仪)富集或分选用于结合所提供的方法使用的T细胞。在特定方面，可以使用对T细胞或其子集具有特异性的一种或多种试剂，如对用于选择反应性细胞的T细胞激活标记物具有特异性的试剂，包括但不限于细胞选择设备(但不限于CliniMACS、Sony FX500或Tyto细胞分选系统(Miltenyi))上的荧光抗体、纳米颗粒或珠。

在一些方面，T细胞可以从生物样品选择，如基于T细胞标记物CD3、CD4或CD8。在一些实施方案中，选择一种或多种细胞表面标记物呈表面阳性的T细胞包括任何基于此类标记物的分离方法。

在一些实施方案中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于一种或多种标记物(通常是细胞表面标记物)在细胞中的表达或表达水平来分离细胞和细胞群体，例如通过与特异性结合至此类标记物的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并将已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞分离。在一些实施方案中，基于免疫亲和力的选择包括使包含细胞的样品，如包含含有CD3+T细胞或CD4+和CD8+细胞的大量T细胞(例如原代人T细胞)群体的样品与特异性结合一种或多种细胞表面标记物的抗体或结合配偶体接触。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如球体或珠，例如纳米颗粒、微珠、纳米珠(包括琼脂糖)、磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。在一些实施方案中，所述球体或珠可以被填充到柱中以实现免疫亲和色谱，其中使含有细胞(如含有CD3+T细胞或CD4+和CD8+细胞的原代人T细胞)的样品与所述柱的基质接触并随后从中洗脱或释放。在其他实施方案中，抗体或结合配偶体被可检测地标记。

在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如纳米颗粒或顺磁珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群体上存在的分子(例如，表面标记物)特异性结合。此类珠是已知的并且可商购于多种来源，在一些方面包括(Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、珠(Miltenyi Biotec，圣地亚哥，加利福尼亚州)或珠试剂(IBA，德国)。在一些方面，将样品置于磁场中，并且附着有磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。

在某些实施方案中，使样品与特异性结合细胞表面标记物的结合剂(例如可检测地标记的结合剂)接触。在某些实施方案中，一种或多种可检测地标记的结合剂是荧光标记的。在某些实施方案中，通过流式细胞术鉴定用对细胞表面标记物具有特异性的结合剂标记的T细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括将用一种或多种结合剂标记的任何所得T细胞与样品的其他组分分离，以产生富集一种或多种细胞表面标记物呈表面阳性的T细胞的组合物。可以使用具有足够高通量来处理大体积和大细胞数的细胞选择分选设备。非限制性细胞分选设备包括例如Sony FX500或Tyto细胞分选系统(Miltenyi)。

孵育通常在如下条件下进行：由此附着至磁性颗粒或磁珠和/或被可检测地标记的抗体或结合配偶体或者与此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果在样品内的细胞上存在)特异性结合。在一些方面，可以将结合抗体的细胞从样品中的未结合细胞中回收或分离。

在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或使其经历进一步的分离步骤。此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已结合试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合至所述抗体或结合配偶体的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得特异性鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除了所需群体以外的细胞表达的标记物来进行分离的情况下，阴性选择可以特别有用。

分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群体或表达特定标记物的细胞。例如，对特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要使不表达所述标记物的细胞完全不存在。同样地，特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要使所有此类细胞完全去除。例如在一些方面，CD4+或CD8+群体之一的选择富集了所述群体，即CD4+或CD8+群体，但也可以含有一些残留或小百分比的其他未选择的细胞，其在一些情况下包括仍存在于所述富集的群体中的另一种CD4或CD8群体。

在一些实施方案中，通过以下方式进行分离：通过阳性选择富集特定细胞群体，或通过阴性选择耗尽特定细胞群体。在一些实施方案中，通过以下方式完成阳性或阴性选择：将细胞与特异性结合一种或多种表面标记物的一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育，所述一种或多种表面标记物分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记物⁺)或以相对较高的水平表达(标记物^高)。

在特定实施方案中，T细胞群体是包括CD4+和CD8+T细胞二者的群体。许多癌症(包括实体瘤，如许多常见的上皮适应症(例如GI))表达I类和II类限制性突变。为了使T细胞产物靶向此类适应症(例如常见的上皮适应症)，预期识别I类MHC限制性分子的CD8+T细胞和识别II类MHC限制性分子的CD4+T细胞都是必要的。

在一些实施方案中，所述方法包括CD3+细胞的分离、选择和/或富集。在一些实施方案中，所述方法包括CD4+和CD8+细胞的分离、选择和/或富集。在一些方面，CD4⁺或CD8⁺选择步骤，如CD4的阳性选择和CD8的阳性选择，用于分离CD4⁺辅助T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞。在一些方面，此类选择是同时进行的，并且在其他方面，是以任何顺序依序进行的。在一些实施方案中，所述方法包括通过选择CD3呈阳性的T细胞或通过依序或同时选择CD4呈表面阳性的T细胞和CD8呈表面阳性的T细胞，来富集CD4+和CD8+T细胞。可以通过以下方式将此类CD3+T细胞或CD4⁺和/或CD8⁺群体进一步分选为亚群：针对在肿瘤反应性T细胞或者表达与肿瘤反应性T细胞相关的T细胞激活标记物的T细胞上表达或相对高程度表达的标记物进行阳性或阴性选择，例如如第I.D.节所述。

在一些实施方案中，基于与激活的T细胞相关的标记物的表达，可以进一步富集所选T细胞中的肿瘤反应性T细胞。用于选择或富集此类肿瘤反应性T细胞的特定标记物描述于下文第I.D.节。在其他情况下，肿瘤反应性T细胞的选择或富集是在该方法的一个或多个后续步骤中进行，如在与一种或多种突变肽(肽新表位)共培养之后进行。

在一些实施方案中，从生物样品中选择T细胞还包括富集或选择肿瘤反应性T细胞或表达与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种激活标记物的T细胞。T细胞激活标记物包括其表达被上调或为已暴露于抗原并被激活的T细胞所特有的细胞表面标记物。示例性标记物描述于下文第I.D.节。

在任何所提供的实施方案的一些中，生物样品是淋巴来源的样品或肿瘤来源的样品，并且其中：培养开始时的细胞数是在为或约10x10⁶与100x10⁶个总活细胞之间、20x10⁶与100x10⁶个总活细胞之间、或12x10⁶与43x10⁶个总活细胞之间；或者是为或约10x10⁶个总活细胞、为或约12x10⁶个总活细胞、20x10⁶个总活细胞、40x10⁶个总活细胞、60x10⁶个总活细胞、或100x10⁶个总活细胞，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，在培养开始时肿瘤反应性T细胞的百分比是在为或约1％与为或约90％之间、为或约1％与为或约75％之间、为或约1％与为或约50％之间、为或约1％与为或约25％之间、或者为或约1％与为或约14％之间。

在任何所提供的实施方案的一些中，生物样品是淋巴来源的样品或肿瘤来源的样品，并且其中在培养开始时T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞的数量是在为或约0.7x10⁶与为或约15x10⁶个T细胞之间、1x10⁶与为或约15x10⁶个T细胞之间、或者为或约0.7x10⁶与为或约5.4x10⁶个T细胞之间；或者是为或约0.7x10⁶个T细胞、1x10⁶个T细胞、5.4x10⁶个T细胞、或15x10⁶个T细胞，或任何前述值之间的任何值。

2.刺激T细胞进行初始扩增

在所提供方法的方面，在刺激T细胞(以例如扩增T细胞)的条件下，在一种或多种T细胞刺激剂的存在下，孵育或培养来自生物样品的T细胞(如存在于切除的肿瘤碎片中的输入T细胞群体或第一T细胞群体)。在一些实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂一起孵育或培养导致所选T细胞或其所需子集或亚型或其活细胞扩增或生长，以用于所提供方法的后续步骤。用于孵育或培养的一种或多种T细胞刺激剂和条件的非限制性例子描述于本文中。

在一些实施方案中，一种或多种T细胞刺激剂包括T细胞刺激性重组细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子包括单独的或与IL-7、IL-15和/或IL-21中的另一种细胞因子组合的IL-2。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子包括IL-7和IL-15。

在任何所提供的实施方案的一些中，一种或多种T细胞刺激剂选自启动TCR/CD3细胞内信号传导的药剂和启动经由共刺激受体的信号传导的药剂。在任何所提供的实施方案的一些中，启动TCR/CD3细胞内信号传导的药剂是抗CD3抗体，如OKT3。在任何所提供的实施方案的一些中，启动经由共刺激受体的信号传导的药剂包括外周血单核细胞(PBMC)，任选地非分裂或辐照的PBMC。在任何所提供的实施方案的一些中，启动经由共刺激受体的信号传导的药剂是抗CD28抗体。在任何所提供的实施方案的一些中，一种或多种T细胞刺激剂是各自可溶的抗CD3抗体和抗CD28抗体。

因此，所提供的方法包括培养用于制造肿瘤反应性T细胞的T细胞的方法，其中在扩增如存在于共培养物中的T细胞的条件下，在T细胞刺激剂的存在下，培养或孵育T细胞。在一些实施方案中，T细胞刺激剂是或包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。

在所提供方法的实施方案中，刺激条件包括一种或多种药剂，例如配体，其开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联和/或T细胞中的共刺激信号。此类药剂可包括抗体，如对TCR组分具有特异性(例如抗CD3)和/或对共刺激受体具有特异性(例如抗CD28或抗4-1BB)的那些。在一些实施方案中，将此类药剂作为可溶性抗体添加至培养基中。在其他实施方案中，此类药剂结合至固体支持物如珠。在一些实施方案中，一种或多种T细胞刺激剂包括抗CD3/CD28缀合的磁珠(例如M-450CD3/CD28 T CellExpander)。

抗CD3抗体可以包括任何针对或可以特异性结合T细胞表面上的CD3受体(通常是人T细胞上的人CD3)的抗体。抗CD3抗体包括OKT3(也称为莫罗单抗)。抗CD3抗体还包括UHCTI克隆(也称为T3和CD3E)。其他抗CD3抗体包括例如奥特昔珠单抗、特普利珠单抗和威司利珠单抗。可以将抗CD3抗体作为可溶性试剂添加或结合至珠。在特定实施方案中，抗CD3抗体是可溶的。

在特定实施方案中，一种或多种T细胞刺激剂包括抗CD3抗体，其在孵育期间被添加至细胞培养基中。在一些实施方案中，以如下范围内的浓度添加抗CD3抗体：在为或约0.1ng/mL与50ng/mL之间，如在为或约0.5ng/mL与为或约50ng/mL之间、在为或约0.5ng/mL与为或约30ng/mL之间、在为或约0.5ng/mL与为或约15ng/mL之间、在为或约0.5ng/mL与为或约5ng/mL之间、在为或约0.5ng/mL与为或约1ng/mL之间、在为或约1ng/mL与为或约50ng/mL之间、在为或约1ng/mL与为或约30ng/mL之间、在为或约1ng/mL与为或约15ng/mL之间、在为或约1ng/mL与为或约5ng/mL之间、在为或约5ng/mL与为或约50ng/mL之间、在为或约5ng/mL与为或约30ng/mL之间、在为或约5ng/mL与为或约15ng/mL之间、在为或约15ng/mL与为或50ng/mL之间、在为或约15ng/mL与为或约30ng/mL之间、或者在为或约30ng/mL与为或约50ng/mL之间，每个都包含端值。

在特定实施方案中，抗CD3抗体是OKT3。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL、以及约1μg/mL的OKT3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含在0.1ng/mL与1ng/mL之间、在1ng/mL与5ng/mL之间、在5ng/mL与10ng/mL之间、在10ng/mL与20ng/mL之间、在20ng/mL与30ng/mL之间、在30ng/mL与40ng/mL之间、在40ng/mL与50ng/mL、以及在50ng/mL与100ng/mL之间的OKT3抗体。

在一些实施方案中，一种或多种T细胞刺激剂包括与抗CD3抗体孵育以及与特异性结合CD28或者刺激或诱导细胞中CD28介导的信号的另外的药剂孵育。在一些实施方案中，CD28介导的信号可以由抗CD28抗体或其抗原结合片段启动或提供。在一些实施方案中，CD28介导的信号可由抗原呈递饲养细胞(APC)如外周血单核细胞(PBMC)提供。

在一些实施方案中，一种或多种T细胞刺激剂可包括添加至T细胞饲养细胞群体，如非分裂外周血单核细胞(PBMC)。在一些方面，非分裂饲养细胞可包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群体之前将饲养细胞添加至培养基中。在一些实施方案中，所得细胞群体含有用于待扩增初始群体中的每个T淋巴细胞的至少约5、10、20、或40或更多个PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，T细胞与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率是约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400、或约1比500。

在一些实施方案中，一种或多种T细胞刺激剂可包括向细胞群体添加抗CD28抗体或其抗原结合片段。抗CD28抗体可包括任何针对或可特异性结合T细胞表面上的CD28受体的抗体。抗CD28抗体的非限制性例子包括NA/LE(例如BD Pharmingen)、IM1376(例如Beckman Coulter)或15E8(例如Miltenyi Biotec)。可以将抗CD28抗体作为可溶性试剂添加或结合至珠。在特定实施方案中，抗CD3抗体是可溶的。在一些实施方案中，将抗CD28抗体以如下范围的浓度添加：在为或约1ng/mL与1000ng/mL之间、在为或约1ng/mL与500ng/mL之间、在为或约1ng/mL与为或约100ng/mL之间、在为或约1ng/mL与为或约10ng/mL之间、在为或约10ng/mL与为或约1000ng/mL之间、在为或约10ng/mL与为或约500ng/mL之间、在为或约10ng/mL与为或约100ng/mL之间、在为或约100ng/mL与为或约1000ng/mL之间、在为或约100ng/mL与为或约500ng/mL之间、或在为或约500ng/mL与为或约1000ng/mL之间。

在一些实施方案中，一种或多种T细胞刺激剂包括一种或多种重组细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子被添加至培养基中或者对于培养基是外源的。因此，在一些实施方案中，在培养期间还包括一种或多种另外的重组细胞因子。在一些实施方案中，重组细胞因子可包括IL-2、IL-7、IL-15或IL-21中的一种或多种。在一些实施方案中，培养和孵育是在重组IL-2、IL-15和IL-7的存在下进行。在一些实施方案中，培养是在IL-2的存在下进行。在一些实施方案中，培养是在IL-15和IL-17的存在下进行，在一些方面，不另外包括IL-2。在特定实施方案中，一种或多种重组细胞因子是人的。

重组细胞因子通常是重组人蛋白质。在特定实施方案中，在孵育期间重组细胞因子以如下浓度存在于细胞培养基中：至少或至少约0.5IU/mL、至少或至少约1.0IU/mL、至少或至少约5IU/mL、至少或至少约或者为或约10IU/mL、至少或至少约或者为或约100IU/mL、至少或至少约或者为或约1000IU/mL、至少或至少约或者为或约1500IU/mL、至少或至少约或者为或约2000IU/mL、至少或至少约或者为或约2500IU/mL、至少或至少约或者为或约3000IU/mL、至少或至少约或者为或约3500IU/mL、至少或至少约或者为或约4000IU/mL、至少或至少约或者为或约4500IU/mL、至少或至少约或者为或约5000IU/mL、至少或至少约或者为或约5500IU/mL、至少或至少约或者为或约6000IU/mL、至少或至少约或者为或约6500IU/mL、至少或至少约或者为或约7000IU/mL、至少或至少约或者为或约7500IU/mL、或者至少或至少约或者为或约8000IU/mL。在一个实施方案中，细胞培养基包含在为或约10IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约1000与为或约2000IU/mL之间、在为或约2000与为或约3000IU/mL之间、在为或约3000与为或约4000IU/mL之间、在为或约4000与为或约5000IU/mL之间、在为或约5000与为或约6000IU/mL之间、在为或约6000与为或约7000IU/mL之间、在为或约7000与为或约8000IU/mL之间，每个都包含端值。

在一些实施方案中，重组IL-2存在于细胞培养基中。IL-2是支持T细胞回收和增殖的细胞因子。IL-2还支持T细胞的稳态，从而支持它们的表型、分化状态和免疫记忆。在一些情况下，肿瘤微环境中调节性T细胞的诱导可导致IL-2的生物利用度低。在各种情境下，重组IL-2已经常用于T细胞的广泛扩增。重组IL-2是可商购的。在特定实施方案中，重组IL-2是GMP级的(例如MACS GMP重组人IL-2，Miltenyi Biotec)。

重组IL-2可以在所提供方法的各个阶段包含在细胞培养基中。在一些情况下，重组IL-2可以包含在初始T细胞扩增(第一次扩增)中，例如以促进TIL生长并允许它们从实体瘤增殖。IL-2也可以包含在抗原呈递细胞共培养物中，如第I.C节所述，例如以允许在分离或选择新抗原反应性T之前达到峰值激活。在一些情况下，重组IL-2也可以包含在培养物中，以在第二个扩增阶段期间扩增肿瘤反应性T细胞，如第I.D.节所述。

在一些实施方案中，将重组IL-2以如下浓度添加至培养基中：在为或约10IU/mL与为或约1000IU/mL之间，如在为或约10IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约50IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约600IU/mL之间、或者在为或约600IU/mL与为或约1000IU/mL之间。在一些实施方案中，重组IL-2以在50与400IU/mL之间的量存在。

在一些实施方案中，孵育是用更高剂量的IL-2进行。在一些方面，IL-2是添加至培养物中的唯一重组细胞因子。在一些实施方案中，将重组IL-2以如下浓度添加至培养基中：在为或约1000IU/mL与为或约8000IU/mL之间，如在为或约1000IU/mL与为或约7000IU/mL之间、在为或约1000IU/mL与为或约6000IU/mL之间、在为或约1000IU/mL与为或约5000IU/mL之间、在为或约1000IU/mL与为或约4000IU/mL之间、在为或约1000IU/mL与为或约2000IU/mL、2000IU/mL为或约8000IU/mL、在为或约2000IU/mL与为或约7000IU/mL之间、在为或约2000IU/mL与为或约6000IU/mL之间、在为或约2000IU/mL与为或约5000IU/mL之间、在为或约2000IU/mL与为或约4000IU/mL之间、4000IU/mL为或约8000IU/mL、在为或约4000IU/mL与为或约7000IU/mL之间、在为或约4000IU/mL与为或约6000IU/mL之间、在为或约4000IU/mL与为或约5000IU/mL之间、在为或约5000IU/mL与为或约8000IU/mL之间、在为或约5000IU/mL与为或约7000IU/mL之间、在为或约5000IU/mL与为或约6000IU/mL之间、在为或约6000IU/mL与为或约8000IU/mL之间、在为或约6000IU/mL与为或约7000IU/mL之间、或者在为或约7000IU/mL与为或约8000IU/mL之间。在一些实施方案中，重组IL-2以为或为约6000IU/mL的量存在。

在一些实施方案中，重组IL-15存在于细胞培养基中。IL-15是参与记忆T细胞稳态和激活的细胞因子。在一些情况下，IL-15可以在不存在抗原的情况下促进抗原处理过的T细胞的效应子功能，并防止所述T细胞分化为耗竭表型。IL-15也在T细胞增殖中起作用。重组IL-15是可商购的。在特定实施方案中，重组IL-15是GMP级的(例如MACS GMP重组人IL-15，Miltenyi Biotec)。

重组IL-15可以在所提供方法的各个阶段包含在细胞培养基中。在一些情况下，重组IL-15可以包含在初始T细胞扩增(第一次扩增)中，例如以促进TIL扩增从而促进其生长并允许它们从实体瘤增殖和/或稳定表型。重组IL-15也可以包含在抗原呈递细胞共培养物中，如第I.C节所述，例如以允许在分离或选择新抗原反应性T之前达到峰值激活。在一些情况下，重组IL-15也可以包含在培养物中，以在第二个扩增阶段期间扩增肿瘤反应性T细胞，如第I.D.节所述。在一些情况下，重组IL-15可以与重组IL-7组合以在所提供的方法中提供肿瘤反应性T细胞的激活、存活和/或扩增。在一些此类实施方案中，重组IL-7和IL-15的组合是在培养物中使用重组IL-2的替代方案，并且培养基不另外含有重组IL-2。

在一些实施方案中，将重组IL-15以如下浓度添加至培养基中：在为或约10IU/mL与500IU/mL之间，如在为或约10IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约70IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约50IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约30IU/mL之间、在为或约30IU/mL与500IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约70IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约50IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约70IU/mL之间、在为或约70IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约70IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约70IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约70IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约70IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约300IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约400IU/mL之间、或者在为或约400IU/mL与为或约500IU/mL之间。在一些实施方案中，将IL-15以在为或约100IU/mL与在为或约200IU/mL之间的量添加至培养基中。在一些实施方案中，将IL-15以为或约180IU/mL添加至培养基中。

在一些实施方案中，将重组IL-7添加至培养基中。IL-7是参与促进T细胞维持和稳态的细胞因子。在一些情况下，IL-7可以加强记忆T细胞存活和增殖，特别是中央记忆区室。重组IL-7是可商购的。在特定实施方案中，重组IL-7是GMP级的(例如MACS GMP重组人IL-7，Miltenyi Biotec)。

重组IL-7可以在所提供方法的各个阶段包含在细胞培养基中。在一些情况下，重组IL-7可以包含在初始T细胞扩增(第一次扩增)中，例如以促进TIL扩增从而促进其生长并允许它们从实体瘤增殖和/或稳定表型。IL-7也可以包含在抗原呈递细胞共培养物中，如第I.C节所述，例如以允许在分离或选择新抗原反应性T之前达到峰值激活。在一些情况下，重组IL-7也可以包含在培养物中，以在第二个扩增阶段期间扩增肿瘤反应性T细胞，如第I.D.节所述。在所述方法中包含重组IL-7可以维持或支持所述方法中记忆T细胞子集的扩增。在一些情况下，重组IL-7可以与重组IL-15组合以在所提供的方法中提供肿瘤反应性T细胞的激活、存活和/或扩增。在一些此类实施方案中，重组IL-7和IL-15的组合是在培养物中使用重组IL-2的替代方案，并且培养基不另外含有重组IL-2。

在一些实施方案中，将重组IL-7以如下浓度添加至培养基中：在为或约100IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约800IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约800IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约800IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约600IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约600IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约600IU/mL与为或约1000IU/mL、在为或约600IU/mL与为或约800IU/mL之间、在为或约800IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约800IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约800IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约1000IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约1000IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约1500IU/mL与为或约2000IU/mL之间。在一些实施方案中，将IL-7以在为或约1000IU/mL与在为或约2000IU/mL之间的量添加至培养基中。在一些实施方案中，将IL-7以为或约600IU/mL添加至培养基中。

在一些实施方案中，将重组IL-21添加至培养基中。IL-21是在不增加调节性T细胞信号传导的情况下支持广泛T细胞激活的细胞因子。在一些情况下，IL-21可以支持记忆细胞稳定、效应子功能和抗原处理过的T细胞的增殖。IL-21可以诱导CD4和CD8 T细胞二者中效应分子的上调。重组IL-21是可商购的。在特定实施方案中，重组IL-21是GMP级的(例如MACS GMP重组人IL-21，Miltenyi Biotec)。

重组IL-21可以在所提供方法的各个阶段包含在细胞培养基中。在一些情况下，重组IL-21可以包含在初始T细胞扩增(第一次扩增)中，例如以包括通过稳定记忆T细胞激活、功能和/或增殖来促进TIL从实体瘤的生长。在一些方面，IL-21的存在允许改进的TIL的回收。重组IL-21也可以如由于刺激T细胞激活标记物表达(包括激活标记物在新抗原反应性TIL上的表达)的能力，包含在如第I.C节所述的抗原呈递细胞共培养物中。在一些情况下，重组IL-21也可以包含在培养物中，以在第二个扩增阶段期间扩增肿瘤反应性T细胞，如第I.D节所述，例如以支持记忆表型的增殖和稳定。

在一些实施方案中，将重组IL-21以如下浓度添加至培养基中：在为或约0.5IU/mL与为或约20IU/mL之间、在为或约0.5IU/mL与为或约15IU/mL之间、在为或约0.5IU/mL与为或约10IU/mL之间、在为或约0.5IU/mL与为或约5IU/mL之间、在为或约0.5IU/mL与为或约2.5IU/mL之间、在为或约0.5IU/mL与为或约1IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约20IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约15IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约10IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约5IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约2.5IU/mL之间、在为或约2.5IU/mL与为或约20IU/mL之间、在为或约2.5IU/mL与为或约15IU/mL之间、在为或约2.5IU/mL与为或约10IU/mL之间、在为或约2.5IU/mL与为或约5IU/mL之间、在为或约5IU/mL与为或约20IU/mL之间、在为或约5IU/mL与为或约15IU/mL之间、在为或约5IU/mL与为或约10IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约20IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约15IU/mL之间、或者在为或约15IU/mL与为或约20IU/mL之间。在一些实施方案中，将IL-21以在为或约0.5IU/mL与在为或约2.5IU/mL之间的量添加至培养基中。在一些实施方案中，将IL-21以为或约1IU/mL添加至培养基中。

在特定实施方案中，在孵育期间存在的一种或多种T细胞刺激剂(如用于扩增细胞)含有重组IL-2。在一些实施方案中，可以包括一种或多种其他刺激剂，如来自IL-7、IL-15、IL-21的一种或多种其他重组细胞因子，或抗CD3抗体(例如OKT-3)。在抗CD3抗体(例如OKT-3)的一些情况下，一种或多种T细胞刺激剂还可以包括共刺激剂，如由抗原呈递饲养细胞(如PBMC)或可溶性抗CD28抗体提供的共刺激剂。

在特定实施方案中，在孵育期间存在的如用于扩增细胞的一种或多种T细胞刺激剂含有重组IL-2、抗CD3抗体(例如OKT-3)和抗原呈递饲养细胞(如PBMC)。

在特定实施方案中，在孵育期间存在的如用于扩增细胞的一种或多种T细胞刺激剂含有重组IL-2、抗CD3抗体(例如OKT-3)和抗CD28抗体。在一些实施方案中，抗CD3抗体和/或抗CD28抗体是可溶的。在一些实施方案中，抗CD3抗体和抗CD28抗体中的一者或两者结合至固体表面，如珠(例如M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)。

在特定实施方案中，在孵育期间存在的如用于扩增细胞的一种或多种T细胞刺激剂含有重组IL-2、重组IL-15、重组IL-7、抗CD3抗体(例如OKT-3)和抗原呈递饲养细胞(如PBMC)。

在特定实施方案中，在孵育期间存在的如用于扩增细胞的一种或多种T细胞刺激剂含有重组IL-2、重组IL-15、重组IL-7、抗CD3抗体(例如OKT-3)和抗CD28抗体。在一些实施方案中，抗CD3抗体和/或抗CD28抗体是可溶的。在一些实施方案中，抗CD3抗体和抗CD28抗体中的一者或两者结合至固体表面，如珠(例如M-450 CD3/CD28 TCell Expander)。

在特定实施方案中，在孵育期间存在的如用于扩增细胞的一种或多种T细胞刺激剂含有重组IL-15和重组IL-7、抗CD3抗体(例如OKT-3)和抗原呈递饲养细胞(如PBMC)。

在特定实施方案中，在孵育期间存在的如用于扩增细胞的一种或多种T细胞刺激剂含有重组IL-15和重组IL-7、抗CD3抗体(例如OKT-3)和抗CD28抗体。在一些实施方案中，抗CD3抗体和/或抗CD28抗体是可溶的。在一些实施方案中，抗CD3抗体和抗CD28抗体中的一者或两者结合至固体表面，如珠(例如M-450 CD3/CD28T CellExpander)。

在一些实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂的孵育是在用于从生物样品中初始扩增T细胞的条件下进行。在一些实施方案中，将细胞在约37℃下用约5％CO₂培养。

在一些实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂的孵育进行为或约1天，如通常为或约2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天，或前述任何时间之间的任何时间范围。在一些实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂的孵育进行7至21天，如7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天，或前述任何时间之间的任何值。在一些实施方案中，孵育进行7-14天。在一些实施方案中，孵育进行7-10天。在一些实施方案中，孵育持续为或约7天。在一些实施方案中，孵育持续为或约8天。在一些实施方案中，孵育持续为或约9天。在一些实施方案中，孵育持续为或约10天。

可以在GMP条件下进行孵育，如用于生物样品中T细胞的初始扩增。在一些实施方案中，在封闭系统中进行孵育，在一些方面，所述封闭系统可以是封闭的自动化系统。在一些实施方案中，含有一种或多种T细胞刺激剂的培养基可以是无血清培养基。在一些实施方案中，在封闭的自动化系统中用无血清培养基进行孵育。

在一些实施方案中，在一种或多种刺激条件下细胞的初始扩增是在适合于细胞扩增的培养器皿中进行。在一些实施方案中，培养器皿是透气性培养器皿，如G-Rex系统(例如G-Rex 10、G-Rex 10M、G-Rex 100M/100M-CS或G-Rex 500M/500M-CS)。在一些实施方案中，培养器皿是微孔板、烧瓶、棒或其他适合于在封闭系统中扩增细胞的培养器皿。在一些实施方案中，可以在生物反应器中进行扩增。在一些实施方案中，可以通过将细胞转移到如与生物反应器(例如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare))相连的透气袋，使用细胞扩增系统来进行初始扩增。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括培养器皿，如袋，例如透气细胞袋，体积为约50mL、约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、和约10L，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，所述方法是自动化的或半自动化的。适合的用于自动灌注扩增的生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM20|50、Finesse SmartRocker生物反应器系统、和Pall XRS生物反应器系统或MiltenyiProdigy。在一些方面，扩增培养是在静态条件下进行。在一些实施方案中，扩增培养在摇动条件下进行。培养基可以大剂量添加或可以按灌注时间表添加。在一些实施方案中，生物反应器将温度维持在或接近37℃，且CO2水平维持在或接近5％，同时具有为、为约、或至少0.01L/min、0.05L/min、0.1L/min、0.2L/min、0.3L/min、0.4L/min、0.5L/min、1.0L/min、1.5L/min或2.0L/min或大于2.0L/min的稳定空气流。在某些实施方案中，至少一部分培养通过灌注如以290ml/天、580ml/天、和/或1160ml/天的速率进行。

在一些实施方案中，将细胞以0.5x10⁶个细胞/mL至1.5x10⁶个细胞/mL的密度接种在适当的培养器皿(例如透气袋)中。在一些实施方案中，密度是为或约0.5x10⁶个细胞/mL、0.75x10⁶个细胞/mL、1x10⁶个细胞/mL、1.25x10⁶个细胞/mL或1.5x10⁶个细胞/mL，或任何前述值之间的任何值。

在一些方面，细胞在灌注启用的自动封闭扩增系统中扩增。灌注可以连续地向细胞添加培养基，以确保达到最佳生长速度。

扩增方法可以在GMP条件下进行，包括在封闭的自动化系统中和使用无血清培养基。在一些实施方案中，所述方法的步骤中的任何一个或多个可以在封闭系统中或在GMP条件下进行。在某些实施方案中，所有过程操作都在GMP设施中进行。在一些实施方案中，将封闭系统用于执行用于制造、生成或产生细胞疗法的方法的一个或多个其他处理步骤。在一些实施方案中，一个或多个或所有处理步骤(例如分离、选择和/或富集、处理、包括与扩增细胞结合的孵育在内的培养步骤、和配制步骤)是使用集成或自含式系统中的系统、装置或设备进行和/或以自动化或可编程方式进行。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或装置通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。

在一些实施方案中，在孵育后立即收集经刺激的细胞，以用于随后如根据下文第I.C节中描述的方法与APC共培养。

在一些实施方案中，收集经刺激的细胞并低温冷冻。在初始扩增阶段后通过低温保存提供中间保持步骤可用于协调新表位鉴定和肽生成(如第I.A节所述)和/或APC生成(如第I.C节所述)的时间安排。在一些实施方案中，对于低温保存，将经刺激的细胞用低温保护剂配制为组合物。在一些实施方案中，所述低温保护剂是或包含DMSO和/或甘油。在一些实施方案中，配制用于低温保存的组合物可在低温(如超低温)下储存，例如，以范围从-40℃至-150℃，如或约80℃±6.0℃的温度储存。

在一些实施方案中，将低温保存的细胞通过解冻准备用于后续步骤。在一些情况下，可以将细胞在一个或多个洗涤步骤后解冻后立即准备好用于后续与APC和肽一起进行培养。

C.T细胞与APC的共培养

在所提供方法的实施方案中，一旦合成了编码蛋白质的新表位，多种合成肽与抗原呈递细胞在呈递MHC分子背景中的肽的条件下接触，并与识别APC上呈递的肽的来自T细胞群体的T细胞一起孵育。在一些实施方案中，将合成肽脉冲到自体或同种异体APC中，然后与患者T细胞共培养。抗原呈递细胞用于呈递这些肽。然后可以如通过下文描述的方法分离识别这些在APC表面上的肽的T细胞。可以将孵育的细胞在富集和扩增在培养物中的肿瘤反应性T细胞(即含有对APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞)的条件下培养。在一些实施方案中，所述方法包括在扩增条件下培养T细胞直至获得阈值量的T细胞和/或直至孵育开始后多至20天。在一些实施方案中，在所提供的方法中，所述方法可以包括经若干小时至若干天的历程将T细胞与APC共培养，然后从T细胞群体中分离抗原呈递细胞，以在富集或扩增肿瘤反应性T细胞的条件下扩增T细胞。在一些实施方案中，在所提供的方法中，所述方法可以包括经1-7天的历程将T细胞与APC共培养，然后从T细胞群体中分离抗原呈递细胞，以在富集或扩增肿瘤反应性T细胞的条件下扩增T细胞。在一些实施方案中，分离可以包括基于T细胞上的一种或多种T细胞激活标记物从培养物中分离或选择反应性T细胞。

多种方法可用于培养具有抗原特异性的细胞，参见例如美国公布的申请号US2017/0224800。

在一些实施方案中，将肿瘤反应性T细胞与已接触过肽(例如含有突变氨基酸序列的肽，如上文描述的新表位肽)或暴露以呈递所述肽的APC共培养。所述方法可以包括诱导患者的自体抗原呈递细胞(APC)呈递突变的氨基酸序列。APC可以包括在其细胞表面呈递与主要组织相容性复合体(MHC)分子相关的蛋白质肽片段的任何细胞。MHC分子可以是患者表达的任何MHC分子，包括但不限于MHC I类、MHC II类、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR分子。APC可以包括例如巨噬细胞、DC、朗格汉斯细胞、B淋巴细胞和T细胞中的任何一种或多种。在特定实施方案中，APC是DC。在一些特定实施方案中，APC是B细胞。在一些实施方案中，APC是人工APC。

在特定实施方案中，APC包括能够呈递I类和II类限制性分子的细胞。例如，B细胞和DC均具有呈递MHC I类和MHC II类限制性分子的能力。在一些实施方案中，APC细胞样品包括B细胞和DC。在一些实施方案中，如通过从原代细胞样品中选择或分离来富集APC细胞样品中的B细胞。在一些实施方案中，如通过从原代细胞样品中选择或分离来富集APC细胞样品中的DC。

在一些实施方案中，APC表达具有匹配的HLA的MHC I类和/或MHC II类分子，T细胞来源从所述HLA获得。在特定实施方案中，APC和T细胞均从同一受试者中分离，即对于癌症患者是自体的。在一些实施方案中，所述方法可以包括诱导患者的自体抗原呈递细胞(APC)呈递突变的氨基酸序列。通过使用来自患者的自体APC，所述方法可以鉴定对突变的氨基酸序列具有抗原特异性的T细胞，所述突变的氨基酸序列由呈递于患者表达的MHC分子背景中的癌症特异性突变编码。

在一些实施方案中，APC是来自受试者如患者的血液或单采术样品的细胞。在一些实施方案中，APC包括存在于外周血单核细胞(PBMC)样品中的细胞。通常，在PBMC培养物中的APC功能主要涉及单核细胞和B细胞。在一些实施方案中，在所提供的方法中，分离的PBMC的群体可以用作APC。PBMC可以使用标准方法(如Ficoll-Paque梯度分离)获得。在一些情况下，APC是或包括从血液或单采术样品或从PBMC样品中分离的B细胞。在其他情况下，APC是或包括从血液或单采术样品或从PBMC样品中分离的单核细胞。在一些方面，单核细胞可以用作制备单核细胞来源的DC(以用作APC)的来源。在一些实施方案中，单核细胞来源的DC(例如CD11c^高MHCII^高CD14^低细胞)的来源可以从分离的单核细胞通过以下方式离体产生：与GM-CSF和IL-4一起培养4至6天以产生单核细胞来源的树突细胞。在特定实施方案中，单核细胞如通过CD14选择而从PBMC分离，然后与GM-CSF和IL-4一起培养4至6天。

在一些实施方案中，APC是具有复制能力的原代细胞(例如B细胞或单核细胞来源的DC)，例如，细胞未经受辐照、热处理或会导致其失活的其他方法。在特定实施方案中，所提供的方法不使用经辐照的APC。在一些实施方案中，APC是从受试者获得的新鲜分离的原代细胞，或源自从受试者获得的原代细胞。在一些实施方案中，根据提供的方法，在与经刺激的T细胞共培养之前，APC已经被低温保存并随后解冻。

在一些特定实施方案中，B细胞用作APC的来源并且产生自患者单采术，如对于提供肿瘤碎片和/或T细胞的受试者是自体的单采术。在其他特定实施方案中，单核细胞来源的树突细胞用作APC的来源并且产生自来自患者单采术的单核细胞，所述单采术如对于提供肿瘤碎片和/或T细胞的受试者是自体的单采术。

在一些实施方案中，收集分离的或产生的APC并低温冷冻。在分离或产生APC后通过低温保存提供中间保持步骤可用于协调新表位鉴定和肽产生(如第I.A节所述)和/或T细胞初始扩增(如第I.B节所述)的时间安排。在一些实施方案中，对于低温保存，将分离的或产生的APC用低温保护剂配制为组合物。在一些实施方案中，所述低温保护剂是或包含DMSO和/或甘油。在一些实施方案中，配制用于低温保存的组合物可在低温(如超低温)下储存，例如，以范围从-40℃至-150℃，如或约80℃±6.0℃的温度储存。

在一些实施方案中，将低温保存的细胞通过解冻准备用于后续步骤。在一些情况下，可以将细胞在一个或多个洗涤步骤后解冻后立即准备好用于后续与T细胞和肽一起进行培养。

在特定实施方案中，富集或选择肿瘤反应性细胞的方法是通过以下方式起始：使PBMC接触突变氨基酸序列，如一种或多种、如多种新表位肽。然后可以将PBMC/肽与经刺激的T细胞一起培养。PBMC和T细胞可以获得自同一受试者。

在特定实施方案中，富集或选择肿瘤反应性细胞的方法是通过以下方式起始：使B细胞接触突变氨基酸序列，如一种或多种、如多种新表位肽。然后可以将B细胞/肽与经刺激的T细胞一起培养。B细胞和T细胞可以获得自同一受试者。

在特定实施方案中，富集或选择肿瘤反应性细胞的方法是通过以下方式起始：使单核细胞来源的DC接触突变氨基酸序列，如一种或多种、如多种新表位肽。然后可以将单核细胞来源的DC/肽与经刺激的T细胞一起培养。单核细胞来源的DC和T细胞可以获得自或源自同一受试者。

在一些实施方案中，APC是人工抗原呈递细胞(aAPC)。通常，aAPC包括天然APC的特征，包括MHC分子、刺激和共刺激分子、Fc受体、粘附分子的表达和/或产生或分泌细胞因子(例如IL-2)的能力。一般，aAPC是缺乏上述中的一种或多种的表达并且通过引入(例如通过转染或转导)来自MHC分子、低亲和力Fc受体(CD32)、高亲和力Fc受体(CD64)、以下中的一种或多种的缺失元件中的一种或多种而产生的细胞系：共刺激信号(例如CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、3/TR6或B7-H3配体；或者与CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、Toll配体受体或CD83配体特异性结合的抗体)、细胞粘附分子(例如ICAM-1或LFA-3)和/或细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、干扰素-α(IFNα)、干扰素-β(IFNβ)、干扰素-γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、肿瘤坏死因子-β(TNFβ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(GCSF))。在一些情况下，aAPC一般不表达MHC分子，但是可以被工程化以表达MHC分子，或者在一些情况下，被诱导或可以被诱导以表达MHC分子，如通过用细胞因子刺激。在一些情况下，aAPC也可以加载刺激或共刺激配体，其可以包括例如抗CD3抗体、抗CD28抗体或抗CD2抗体。可以用作用于产生aAPC的骨架的细胞系的例子是K562细胞系或成纤维细胞系。各种aAPC在本领域是已知的，参见例如美国专利号8,722,400，公开的申请号US2014/0212446；Butler和Hirano(2014)Immunol Rev.,257(1):10.1111/imr.12129；Suhoshki等人(2007)Mol.Ther.,15:981-988)。在特定实施方案中，富集或选择肿瘤反应性细胞的方法是通过以下方式起始：使aAPC接触突变氨基酸序列，如一种或多种、如多种新表位肽。然后可以将aAPC/肽与经刺激的T细胞一起培养。

诱导APC(例如B细胞或单核细胞来源的DC)以呈递突变氨基酸序列可以使用各种合适的方法进行。在一个实施方案中，诱导APC以呈递突变氨基酸序列(例如肽新表位)包括将APC用包含突变氨基酸序列的合成肽或肽库(所述库中的每种肽包含不同的突变氨基酸序列)脉冲。在一些情况下，通过以下方式用肽脉冲APC：使用电穿孔将肽脉冲到抗原呈递细胞中。然后可以通过有待由CD8细胞(MHC I类)或CD4细胞(MHC II类)识别的抗原呈递细胞呈递合成肽。在某些特定实施方案中，产生合成肽以适合于由MHC I类限制性分子表达，以便由CD8细胞识别。在其他特定实施方案中，产生合成肽以适合于由MHC II类限制性分子表达，以便由CD4细胞识别。

在一些实施方案中，使APC(例如PBMC、B细胞或单核细胞来源的DC)与单一肽或肽库接触。肽库可以代表许多不同的突变氨基酸序列，如5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或100种肽，或任何前述值之间的任何值。

肽或肽库如通过肽脉冲以如下浓度加载在抗原呈递细胞(例如树突细胞)上，所述浓度适合于它们在主要组织相容性复合体(MHC)的表面上的呈递。

在一些实施方案中，代表单独或单一肽的肽浓度的范围可以在为或约0.00000 1μg/mL与为或约10μg/mL之间。在一些实施方案中，代表单独或单一肽的肽浓度的范围可以是在为或约0.00001μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.00001μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.00001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在为或约0.00001μg/mL与为或约0.01μg/mL之间、在为或约0.00001μg/mL与为或约0.001μg/mL之间、在为或约0.00001μg/mL与为或约0.0001μg/mL之间、在为或约0.0001μg/mL与10μg/mL之间、在为或约0.0001μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.0001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在为或约0.0001μg/mL与为或约0.01μg/mL之间、在为或约0.0001μg/mL与为或约0.001μg/mL、在为或约0.001μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.001μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在为或约0.001μg/mL与为或约0.01μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在为或约0.1μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.1μg/mL与为或约1μg/mL之间、或者在为或约1μg/mL与为或约10μg/mL之间。在一些实施方案中，代表单独或单一肽的浓度可以是为或约0.00000 1μg/mL、为或约0.00001μg/mL、为或约0.0001μg/mL、为或约0.001μg/mL、为或约0.01μg/mL、为或约0.1μg/mL、为或约1μg/mL，或任何前述值之间的任何值。

在一些实施方案中，肽是代表许多不同突变氨基酸序列的肽库，并且所述库中单独或单一肽的平均浓度范围可以在为或约0.00000 1μg/mL与为或约10μg/mL之间。在一些实施方案中，肽是代表许多不同突变氨基酸序列的肽库，并且在库中的单独或单一肽的平均浓度的范围可以是在为或约0.00001μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.00001μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.00001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在为或约0.00001μg/mL与为或约0.01μg/mL之间、在为或约0.00001μg/mL与为或约0.001μg/mL之间、在为或约0.00001μg/mL与为或约0.0001μg/mL之间、在为或约0.0001μg/mL与10μg/mL之间、在为或约0.0001μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.0001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在为或约0.0001μg/mL与为或约0.01μg/mL之间、在为或约0.0001μg/mL与为或约0.001μg/mL、在为或约0.001μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.001μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在为或约0.001μg/mL与为或约0.01μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在为或约0.1μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.1μg/mL与为或约1μg/mL之间、或者在为或约1μg/mL与为或约10μg/mL之间。在一些实施方案中，在库中的单独或单一肽的平均浓度可以是为或约0.000001μg/mL、为或约0.00001μg/mL、为或约0.0001μg/mL、为或约0.001μg/mL、为或约0.01μg/mL、为或约0.1μg/mL、为或约1μg/mL，或任何前述值之间的任何值。

在一些实施方案中，一种或多种非天然肽的单独肽的平均浓度是小于0.02μg/mL。在一些实施方案中，一种或多种非天然肽的单独肽的平均浓度是从为或约0.00001μg/mL至为或约0.01μg/mL，如为或约0.00001μg/mL至为或约0.005μg/mL、为或约0.00001μg/mL至为或约0.002μg/mL、为或约0.00001μg/mL至为或约0.001μg/mL、为或约0.00001μg/mL至为或约0.0005μg/mL、为或约0.00001μg/mL至为或约0.0002μg/mL、为或约0.00001μg/mL至为或约0.0001μg/mL、为或约0.00001μg/mL至为或约0.00005μg/mL、为或约0.00001μg/mL至为或约0.00002μg/mL、为或约0.00002μg/mL至为或约0.005μg/mL、为或约0.00002μg/mL至为或约0.002μg/mL、为或约0.00002μg/mL至为或约0.001μg/mL、为或约0.00002μg/mL至为或约0.0005μg/mL、为或约0.00002μg/mL至为或约0.0002μg/mL、为或约0.00002μg/mL至为或约0.0001μg/mL、为或约0.00002μg/mL至为或约0.00005μg/mL、为或约0.00005μg/mL至为或约0.005μg/mL、为或约0.00005μg/mL至为或约0.002μg/mL、为或约0.00005μg/mL至为或约0.001μg/mL、为或约0.00005μg/mL至为或约0.0005μg/mL、为或约0.00005μg/mL至为或约0.0002μg/mL、为或约0.00005μg/mL至为或约0.0001μg/mL、为或约0.0001μg/mL至为或约0.005μg/mL、为或约0.0001μg/mL至为或约0.002μg/mL、为或约0.0001μg/mL至为或约0.001μg/mL、为或约0.0001μg/mL至为或约0.0005μg/mL、为或约0.0001μg/mL至为或约0.0002μg/mL、为或约0.0005μg/mL至为或约0.005μg/mL、为或约0.0005μg/mL至为或约0.002μg/mL、为或约0.0005μg/mL至为或约0.001μg/mL、为或约0.001μg/mL至为或约0.005μg/mL、为或约0.001μg/mL至为或约0.002μg/mL、或者为或约0.002μg/mL至为或约0.005μg/mL。

在一些实施方案中，代表单一肽或肽库的肽浓度的范围可以是在为或约0.0001μg/mL与为或约40μg/mL之间。代表单一肽或肽库的肽浓度的范围可以是在为或约0.001μg/mL与为或约40μg/mL之间、在为或约0.001μg/mL与为或约25μg/mL之间、在0.001μg/mL与为或约10μg/mL之间、在0.001μg/mL与为或约5μg/mL之间、在0.001μg/mL与为或约1μg/mL之间、在0.001μg/mL与为或约0.5μg/mL之间、在0.001μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在0.001μg/mL与为或约0.01μg/mL之间、在0.01μg/mL与为或约40μg/mL之间，如在为或约0.01μg/mL与为或约25μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约5μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约0.5μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在为或约0.01μg/mL与为或约0.05μg/mL之间、在0.05μg/mL与为或约40μg/mL之间、在为或约0.05μg/mL与为或约25μg/mL之间、在为或约0.05μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.05μg/mL与为或约5μg/mL之间、在为或约0.05μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.05μg/mL与为或约0.5μg/mL之间、在为或约0.05μg/mL与为或约0.1μg/mL之间、在0.1μg/mL与为或约40μg/mL之间，如在为或约0.1μg/mL与为或约25μg/mL之间、在为或约0.1μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.1μg/mL与为或约5μg/mL之间、在为或约0.1μg/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约0.1μg/mL与为或约0.5μg/mL、在0.5μg/mL与为或约40μg/mL之间、在为或约0.5μg/mL与为或约25μg/mL之间、在为或约0.5μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约0.5μg/mL与为或约5μg/mL之间、在为或约0.5μg/mL与为或约1μg/mL之间、在1μg/mL与为或约40μg/mL之间、在为或约1μg/mL与为或约25μg/mL之间、在为或约1μg/mL与为或约10μg/mL之间、在为或约1μg/mL与为或约5μg/mL之间、在5μg/mL与为或约40μg/mL之间、在为或约5μg/mL与为或约25μg/mL之间、在为或约5μg/mL与为或约10μg/mL之间、在10μg/mL与为或约40μg/mL之间、在为或约10μg/mL与为或约25μg/mL之间、或者在为或约25μg/mL与为或约40μg/mL之间。在一些实施方案中，代表单一肽或肽库的肽浓度可以是为或约0.0001μg/mL、为或约0.001μg/mL、为或约0.01μg/mL、为或约0.1μg/mL、为或约1μg/mL、为或约10μg/mL、为或约20μg/mL、为或约30μg/mL、或者为或约40μg/mL，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，肽浓度是肽库的浓度。在一些实施方案中，肽浓度是单一或单独肽的浓度。

在一个实施方案中，诱导APC(例如B细胞或单核细胞来源的DC)以呈递突变氨基酸序列包括将编码突变氨基酸序列的核苷酸序列引入APC中。将核苷酸序列引入APC中，以使得APC在细胞膜上表达和展示与MHC分子结合的突变氨基酸序列。编码突变氨基酸的核苷酸序列可以是RNA或DNA。可以以多种不同方式中的任一种将核苷酸序列引入APC中。可用于将核苷酸序列引入APC中的技术的非限制性例子包括转化、转导、转染和电穿孔。在一些情况下，用于结合MHC II类限制性分子的肽被作为编码突变的DNA的基因呈递，并被电穿孔到抗原呈递细胞中。然后，该DNA将在体外转录成编码由CD4+细胞识别的表面肽的RNA。在一些情况下，串联小基因(Tandem Mini Gene)方法可用于对MHC II类限制性分子执行此操作，参见例如已公布的PCT专利申请号WO 2016/053338和Parkhurst等人(2016)Clin CancerRes.,23:2491-505。在鉴定多于一种基因的实施方案中，所述方法可包括制备多于一种核苷酸序列(每种核苷酸序列编码由不同基因编码的突变氨基酸序列)，并将每种核苷酸序列引入不同的APC群体中。在这方面，可以获得多个APC群体，每个群体表达和展示不同的突变氨基酸序列。例如，在使用串联小基因的情况下，将APC(例如B细胞或单核细胞来源的DC)用编码不同突变氨基酸序列的DNA(多种DNA)的混合物进行电穿孔，所述DNA然后在体外转录成编码由CD4+T细胞表面识别的肽的RNA。在一些实施方案中，使用Lonza 4D Nucleofector连续电穿孔系统对APC(例如B细胞或单核细胞来源的DC)进行电穿孔。

这些方法包括将T细胞(例如来自患有肿瘤的患者)与呈递肽的APC的培养物一起添加，并将APC和T细胞共培养一段时间，以允许将肽呈递在APC表面上并由群体中的一种或多种T细胞识别。在所提供的实施方案中，T细胞包括经刺激的T细胞的群体。

在一些实施方案中，对于肽脉冲，APC(例如B细胞或单核细胞来源的DC)与肽一起孵育，持续如下时间：在为或约2小时与为或约48小时之间，如在为或约2小时与为或约36小时之间、在为或约2小时与为或约24小时之间、在为或约2小时与为或约24小时之间、在为或约2小时与为或约18小时之间、在为或约2小时与为或约12小时之间、在为或约2小时与为或约6小时之间、在为或约6小时与为或约48小时、在为或约6小时与为或约36小时之间、在为或约6小时与为或约24小时之间、在为或约6小时与为或约24小时之间、在为或约6小时与为或约18小时之间、在为或约6小时与为或约12小时之间、在为或约12小时与为或约48小时、在为或约12小时与为或约36小时之间、在为或约12小时与为或约24小时之间、在为或约12小时与为或约18小时之间、在为或约18小时与为或约48小时、在为或约18小时与为或约36小时之间、在为或约18小时与为或约24小时之间、在为或约24小时与为或约48小时之间、在为或约24小时与为或约36小时之间、或者在为或约36小时与为或约48小时之间。在一些实施方案中，将APC(例如B细胞或单核细胞来源的DC)与肽一起孵育为或约4小时、为或约6小时、为或约7小时、为或约8小时、为或约9小时、为或约10小时、为或约12小时、为或约14小时、为或约16小时、为或约18小时、为或约20小时、为或约22小时、为或约24小时，或任何前述值之间的任何值。在特定实施方案中，将APC(例如PBMC、B细胞或单核细胞来源的DC)与肽一起孵育过夜，如持续为或约8至12小时之间。在一些实施方案中，共培养孵育持续为或约6小时。

T细胞(例如经刺激的T细胞)和APC(例如B细胞或单核细胞来源的DC)可以以T细胞与APC的如下比率存在于培养物中：1:100至100:1，如1:50至50:1、1:25至25:1、1:10至10:1、或1:5至5:1。在一些实施方案中，T细胞(例如经刺激的T细胞)与APC的比率是为或约1:100、为或约1:50、为或约1:25、为或约1:10、为或约1:5、为或约1:2.5、为或约1:1、为或约2:5:1、为或约5:1、为或约10:1、为或约25:1、为或约50:1、或者为或约100:1，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，T细胞(例如经刺激的T细胞)与APC的比率在20:1与1:1之间、在15:1与1:1之间、在10:1与1:1之间、在5:1与1:1之间、或在2.5:1与1:1之间。在一些实施方案中，T细胞(例如经刺激的T细胞)与APC的比率在1:20与1:1之间、在1:15与1:1之间、在1:10与1:1之间、在1:5与1:1之间、或在1:2.5与1:1之间。在特定实施方案中，将通过以大约3:1比率混合T细胞(例如经刺激的T细胞的群体)和APC(例如B细胞或单核细胞来源的DC)来进行共培养。在一些实施方案中，将通过以大约1:1比率混合T细胞(例如经刺激的T细胞的群体)和APC(例如B细胞或单核细胞来源的DC)来进行共培养。

在一些实施方案中，将用于维持T细胞的一种或多种重组细胞因子添加至共培养物中。在一些实施方案中，重组细胞因子可包括IL-2、IL-7、IL-15或IL-21中的一种或多种。在一些实施方案中，共培养是在重组IL-2、IL-15和IL-7的存在下进行。在一些实施方案中，共培养是在IL-2的存在下进行。在一些实施方案中，共培养是在IL-15和IL-17的存在下进行，在一些方面，不另外包括IL-2。

重组细胞因子通常是重组人蛋白质。在特定实施方案中，在共培养期间重组细胞因子以如下浓度存在于细胞培养基中：至少或至少约或者为或约10IU/mL、至少或至少约或者为或约100IU/mL、至少或至少约或者为或约1000IU/mL、至少或至少约或者为或约1500IU/mL、至少或至少约或者为或约2000IU/mL、至少或至少约或者为或约2500IU/mL、至少或至少约或者为或约3000IU/mL、至少或至少约或者为或约3500IU/mL、至少或至少约或者为或约4000IU/mL、至少或至少约或者为或约4500IU/mL、至少或至少约或者为或约5000IU/mL、至少或至少约或者为或约5500IU/mL、至少或至少约或者为或约6000IU/mL、至少或至少约或者为或约6500IU/mL、至少或至少约或者为或约7000IU/mL、至少或至少约或者为或约7500IU/mL、或者至少或至少约或者为或约8000IU/mL。在一个实施方案中，细胞培养基包含在为或约10IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约1000与为或约2000IU/mL之间、在为或约2000与为或约3000IU/mL之间、在为或约3000与为或约4000IU/mL之间、在为或约4000与为或约5000IU/mL之间、在为或约5000与为或约6000IU/mL之间、在为或约6000与为或约7000IU/mL之间、在为或约7000与为或约8000IU/mL之间，每个都包含端值。

在一些实施方案中，重组IL-2存在于细胞培养基中。在一些实施方案中，将重组IL-2以如下浓度添加至培养基中：在为或约10IU/mL与为或约1000IU/mL之间，如在为或约10IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约50IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约600IU/mL之间、或者在为或约600IU/mL与为或约1000IU/mL之间。在一些实施方案中，重组IL-2以在50与400IU/mL之间的量存在。

在一些实施方案中，重组IL-15存在于细胞培养基中。在一些实施方案中，将重组IL-15以如下浓度添加至培养基中：在为或约10IU/mL与500IU/mL之间，如在为或约10IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约70IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约50IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约30IU/mL之间、在为或约30IU/mL与500IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约70IU/mL之间、在为或约30IU/mL与为或约50IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约70IU/mL之间、在为或约70IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约70IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约70IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约70IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约70IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约300IU/mL之间、在为或约300IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约400IU/mL之间、或者在为或约400IU/mL与为或约500IU/mL之间。在一些实施方案中，将IL-15以在为或约100IU/mL与在为或约200IU/mL之间的量添加至培养基中。在一些实施方案中，将IL-15以为或约180IU/mL添加至培养基中。

在一些实施方案中，将重组IL-7添加至培养基中。在一些实施方案中，将重组IL-7以如下浓度添加至培养基中：在为或约100IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约800IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约200IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约800IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约200IU/mL与为或约400IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约800IU/mL之间、在为或约400IU/mL与为或约600IU/mL之间、在为或约600IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约600IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约600IU/mL与为或约1000IU/mL、在为或约600IU/mL与为或约800IU/mL之间、在为或约800IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约800IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约800IU/mL与为或约1000IU/mL之间、在为或约1000IU/mL与为或约2000IU/mL之间、在为或约1000IU/mL与为或约1500IU/mL之间、在为或约1500IU/mL与为或约2000IU/mL之间。在一些实施方案中，将IL-7以在为或约1000IU/mL与在为或约2000IU/mL之间的量添加至培养基中。在一些实施方案中，将IL-7以为或约600IU/mL添加至培养基中。

在一些实施方案中，将重组IL-21添加至培养基中。在一些实施方案中，将重组IL-21以如下浓度添加至培养基中：在为或约0.5IU/mL与为或约20IU/mL之间、在为或约0.5IU/mL与为或约15IU/mL之间、在为或约0.5IU/mL与为或约10IU/mL之间、在为或约0.5IU/mL与为或约5IU/mL之间、在为或约0.5IU/mL与为或约2.5IU/mL之间、在为或约0.5IU/mL与为或约1IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约20IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约15IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约10IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约5IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约2.5IU/mL之间、在为或约2.5IU/mL与为或约20IU/mL之间、在为或约2.5IU/mL与为或约15IU/mL之间、在为或约2.5IU/mL与为或约10IU/mL之间、在为或约2.5IU/mL与为或约5IU/mL之间、在为或约5IU/mL与为或约20IU/mL之间、在为或约5IU/mL与为或约15IU/mL之间、在为或约5IU/mL与为或约10IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约20IU/mL之间、在为或约10IU/mL与为或约15IU/mL之间、或者在为或约15IU/mL与为或约20IU/mL之间。在一些实施方案中，将IL-21以在为或约0.5IU/mL与在为或约2.5IU/mL之间的量添加至培养基中。在一些实施方案中，将IL-21以为或约1IU/mL添加至培养基中。

可以将APC和T细胞的共培养物在适合于在MHC上呈递肽和激活培养物中的T细胞的温度下孵育，例如至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常为或约37摄氏度。在一些实施方案中，孵育进行多至96小时。孵育可进行24小时至96小时，如为或约24小时、为或约36小时、为或约48小时、为或约60小时、为或约72小时、为或约84小时、或者为或约96小时，或任何前述时间之间的时间。在特定实施方案中，将共培养物孵育24至48小时。

在一些实施方案中，在共培养结束时，将肿瘤反应性T细胞与共培养物中存在的APC分离。在一些实施方案中，分离可包括选择出或去除APC的方法。在一些实施方案中，分离可包括阳性选择或保留共培养物中存在的T细胞的方法。在一些实施方案中，可以选择共培养物中的总T细胞。在特定实施方案中，可以选择肿瘤反应性T细胞或表达与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种上调标记物(例如激活标记物)的T细胞。

D.肿瘤反应性T细胞的选择

在所提供方法的实施方案中，所述方法涉及通过选择或分离与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞，来富集或选择肿瘤反应性T细胞或者可能或怀疑是肿瘤反应性T细胞的T细胞。在一些实施方案中，从已分离或选择自生物样品的T细胞群体中进一步选择或富集一种或多种激活标记物呈表面阳性的T细胞，如第I.B.1节中所述。在一些实施方案中，从经刺激的T细胞的群体中进一步选择或富集一种或多种激活标记物呈表面阳性的T细胞，如第I.B.2节中所述。在一些实施方案中，在与APC共培养后，从T细胞群体中进一步选择或富集一种或多种激活标记物呈表面阳性的T细胞，如第I.C节中所述。在一些实施方案中，所述方法可包括用于获得或富集肿瘤反应性T细胞或者可能或怀疑是肿瘤反应性T细胞的T细胞的任何上述选择的组合。在一些实施方案中，富集的细胞群体用于随后的处理步骤，如涉及以下的后续处理步骤：根据任何所提供方法的一个或多个步骤进行的孵育、刺激或激活和/或扩增。

在任何所提供的实施方案的方面，根据任何所提供的方法从生物样品中富集肿瘤反应性T细胞和/或表达与肿瘤反应性T细胞相关的至少一种T细胞激活标记物的T细胞。在一些方面，在富集之前或并行地，可以如基于T细胞标记物CD3、CD4或CD8从生物样品中富集或选择T细胞。在一些实施方案中，富集一种或多种细胞表面标记物呈表面阳性的T细胞包括任何基于此类标记物的分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于一种或多种标记物(通常是细胞表面标记物)在细胞中的表达或表达水平来分离细胞和细胞群体，例如通过与特异性结合至此类标记物的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并将已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞分离。

在一些实施方案中，在进一步扩增来自共培养物的T细胞之前，所提供的方法还涉及富集或选择肿瘤反应性T细胞或者可能或怀疑是肿瘤反应性T细胞的T细胞。在一些实施方案中，此类富集包括从共培养物中选择或分离与肿瘤反应性T细胞相关的一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，从共培养物中选择的T细胞产生富集了CD3+T细胞或CD4+细胞和CD8+细胞的T细胞群体，其还呈一种或多种此类T细胞激活标记物阳性。在一些实施方案中，此类细胞包括或富集了肿瘤反应性T细胞或与肿瘤反应性T细胞相关的T细胞。例如，可以通过以下方式将此类CD3+T细胞或CD4⁺和/或CD8⁺群体进一步分选为亚群：针对在肿瘤反应性T细胞或表达与肿瘤反应性T细胞相关的T细胞激活标记物的T细胞上表达或相对高程度表达的标记物进行阳性或阴性选择。在特定实施方案中，将富集的细胞群体在扩增条件下培养，如第I.E节中所述。

在一些方面，针对一种或多种T细胞激活标记物进行阳性选择。当T细胞被靶标或突变肽激活时，它开始表达上调标记物，如但不限于CD107、CD107a、CD39、CD103、CD137(4-1BB)、CD59、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134(OX40)、CD258、CD256、PD-1、TIM-3和/或LAG-3。在特定实施方案中，上调标记物是CD107、CD107a、CD39、CD137、CD59、CD90、CD38或CD103。然后可以使用这些标记物来选择反应性细胞。特别地，T细胞激活标记物包括在抗原刺激T细胞后上调和/或其表达被特异性地检测到的那些标记物，使得抗原特异性效应物可以被鉴定为正在激活或刺激细胞的抗原的替代物。例如，在抗原诱导的刺激后，人T细胞经历动态的功能和表型变化，包括多种激活相关分子(如CD25、CD69、CD38等)的表面表达上调。表面分子的上调提供了通过上调决定簇的抗体结合和随后的流式细胞术富集(包括通过涉及磁分离和荧光激活细胞分选(FACS)的方法)来鉴定和分离抗原特异性T细胞如肿瘤反应性T细胞的机会。

在一些实施方案中，对于CD107、CD107a、CD39、CD103、CD137(4-1BB)、CD59、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134、CD258、CD256、PD-1、TIM-3和/或LAG-3中的任何一种或多种选择T细胞激活标记物。在一些实施方案中，T细胞激活标记物选自CD107、CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134、CD258和/或CD256中的任何一种或多种。在一些实施方案中，T细胞激活标记物选自CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90和/或CD38中的任何一种或多种。

在一些实施方案中，T细胞激活标记物是或包括CD107a。CD107a是溶酶体相关蛋白，其通常发现于T细胞表面。在TCR触发后，CD8 T细胞会迅速发生脱颗粒，并且CD107和其他溶酶体蛋白可以被转运到细胞膜上，以促进穿孔素和颗粒酶的释放。例如，在一些情况下，可以在抗原特异性CD8 T细胞上检测到CD107表达，如在刺激后30分钟那么早检测到。(Betts等人(2003)J.Immunol.Methods 281:6578)。

在一些实施方案中，T细胞激活标记物是或包括CD39。在一些实施方案中，T细胞激活标记物是或包括CD103。在一些实施方案中，T细胞激活标记物是或包括CD59。在一些实施方案中，T细胞激活标记物是或包括CD90。在一些实施方案中，T细胞激活标记物是或包括CD38。

在一些实施方案中，T细胞激活标记物是或包括CD137(41BB)。在一些实施方案中，T细胞激活标记物是或包括CD134(OX40)。

在一些实施方案中，基于至少两种或更多种T细胞激活标记物(如至少3、4、5或6种T细胞激活标记物)的阳性表面表达来选择、富集或分离肿瘤反应性T细胞或与肿瘤反应性T细胞相关的T细胞。在一些实施方案中，基于以下中的两种或更多种的阳性表面表达来选择、富集或分离肿瘤反应性T细胞或与肿瘤反应性T细胞相关的T细胞：PD-1、TIM-3、LAG-3、CD137、CD107、CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134、CD258和/或CD256。

在一些实施方案中，至少两种T细胞激活标记物选自CD107a和CD39、CD107a和CD103、CD107a和CD59、CD107a和CD90、CD107a和CD38、CD39和CD103、CD39和CD59、CD39和CD90、CD39和CD38、CD103和CD59、CD103和CD90、CD103和CD38、CD59和CD90、CD59和CD38、以及CD90和CD38。

在一些实施方案中，基于PD-1、TIM-2、LAG-3和/或CD137和至少另一种T细胞激活标记物的阳性表面表达来选择、富集或分离肿瘤反应性T细胞或与肿瘤反应性T细胞相关的T细胞。在一些实施方案中，基于CD137和至少另一种T细胞激活标记物的阳性表面表达来选择、富集或分离肿瘤反应性T细胞或与肿瘤反应性T细胞相关的T细胞。在一些实施方案中，所述至少另一种T细胞激活标记物选自PD-1、TIM-3、LAG-3、CD107、CD107a、CD137、CD39、CD103、CD59、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134、CD258和CD256中的一种或多种。在一些实施方案中，所述至少另一种T细胞激活标记物选自CD107、CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90、CD38、CD30、CD154、CD252、CD134、CD258和CD256中的一种或多种。在一些实施方案中，所述至少另一种T细胞激活标记物选自CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90和CD38中的一种或多种。在一些实施方案中，基于CD107a和CD137、CD38和CD137、CD103和CD137、CD59和CD137、CD90和CD137、以及CD38和CD137的阳性表面表达来选择、富集或分离肿瘤反应性T细胞或与肿瘤反应性T细胞相关的T细胞。

在一些实施方案中，T细胞激活标记物包括CD137(41BB)和CD134(OX40)。

在一些实施方案中，使用结合突变相关肽或肿瘤相关肽的MHC四聚体来选择肿瘤反应性T细胞。在一些实施方案中，四聚体是使用MHC I类或MHC II类算法制备的。在一些实施方案中，四聚体被可检测地标记，如用荧光标记。在一些实施方案中，四聚体与提供生物细胞来源的受试者的HLA匹配。在一些实施方案中，对于来自受试者的样品，使用MHC四聚体选择细胞是直接从细胞来源(例如外周血)进行的。在一些实施方案中，使用MHC四聚体选择细胞是在选择或富集T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞之后进行。

分离、选择和/或富集细胞的方法可以通过各种方法中的任一种，如通过基于阳性或阴性选择的方法，如通过使用如上文第I.B节中所述的任何方法。在一些实施方案中，方法可以包括基于免疫亲和力的选择。在一些实施方案中，可通过多种方式(包括但不限于磁珠分离、荧光细胞分选和基于一次性封闭盒的细胞分选仪)富集或分选T细胞。在特定方面，可以使用一种或多种T细胞激活标记物通过使用(但不限于)细胞选择设备(但不限于CliniMACS、Sony FX500或Tyto细胞分选系统(Miltenyi))上的荧光抗体、纳米颗粒或珠来选择反应性细胞。

在一些实施方案中，选择产生富集的细胞群体，如富集CD3+T细胞或CD4+细胞和CD8+细胞的细胞群体，其还呈一种或多种此类T细胞激活标记物阳性。在一些实施方案中，此类细胞包括或富集了肿瘤反应性T细胞或与肿瘤反应性T细胞相关的T细胞。在一些实施方案中，富集的细胞群体用于随后的处理步骤，如涉及以下的后续处理步骤：根据任何所提供方法的一个或多个步骤进行的孵育、刺激或激活和/或扩增。

在一些实施方案中，富集的细胞群体是从如上文所述的起始样品富集的细胞，其中特定表型的细胞(例如肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞)在富集的细胞群体中的百分比与此类细胞在起始样品中的百分比相比增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、500％、1000％、5000％或更多。在一些实施方案中，在富集的组合物中肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞的纯度，即在富集的细胞群体中所选细胞表面标记物呈阳性的细胞相对于总细胞的百分比是至少90％、91％、92％、93％、94％，并且通常是至少95％、96％、97％、98％、99％或更高。

E.进一步扩增和收获

在一些实施方案中，将来自共培养物的T细胞或从中选择的T细胞在共培养后在离体扩增细胞的条件下进一步孵育。在刺激T细胞(例如以扩增T细胞)的条件下，在一种或多种T细胞刺激剂的存在下进行孵育。一种或多种T细胞刺激剂可以包括如上文第B.2节中所述的任何一种。

在任何所提供的实施方案的一些中，一种或多种T细胞刺激剂选自启动TCR/CD3细胞内信号传导的药剂和/或启动经由共刺激受体的信号传导的药剂。在任何所提供的实施方案的一些中，启动TCR/CD3细胞内信号传导的药剂是抗CD3抗体，如OKT3。在任何所提供的实施方案的一些中，启动经由共刺激受体的信号传导的药剂包括外周血单核细胞(PBMC)，任选地非分裂或辐照的PBMC。在任何所提供的实施方案的一些中，启动经由共刺激受体的信号传导的药剂是抗CD28抗体。在任何所提供的实施方案的一些中，一种或多种T细胞刺激剂是各自可溶的抗CD3抗体和抗CD28抗体。

一般而言，可以在重组细胞因子的存在下进行培养和孵育。在一些实施方案中，细胞因子被添加至培养基中或者对于培养基是外源的。在任何所提供的实施方案的一些中，在选自IL-2、IL-15、IL-7和IL-21的重组细胞因子的存在下进行培养。在一些实施方案中，培养和孵育是在重组IL-2、IL-15和IL-7的存在下进行。在一些实施方案中，培养是在IL-2的存在下进行。在一些实施方案中，培养是在IL-15和IL-17的存在下进行，在一些方面，不另外包括IL-2。

可以将分选或选择的T细胞在适合细胞扩增的培养器皿中在一种或多种刺激条件下扩增。在一些实施方案中，培养器皿是透气性培养器皿，如G-Rex系统(例如G-Rex 10、G-Rex 10M、G-Rex 100M/100M-CS或G-Rex 500 M/500M-CS)。在一些实施方案中，培养器皿是微孔板、烧瓶、棒或其他适合于在封闭系统中扩增细胞的培养器皿。在一些实施方案中，可以在生物反应器中进行扩增。在一些实施方案中，将扩增的T细胞的组合物从封闭系统中取出并置于和/或连接至用于扩增的生物反应器。可以通过将细胞转移到如与生物反应器(例如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare))相连的透气袋，使用细胞扩增系统来扩增分选或选择的T细胞。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括培养器皿，如袋，例如透气细胞袋，体积为约50mL、约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L、和约10L，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，所述方法是自动化的或半自动化的。适合的用于自动灌注扩增的生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM20|50、Finesse SmartRocker生物反应器系统、和Pall XRS生物反应器系统或MiltenyiProdigy。在一些方面，扩增培养是在静态条件下进行。在一些实施方案中，扩增培养在摇动条件下进行。培养基可以大剂量添加或可以按灌注时间表添加。在一些实施方案中，生物反应器将温度维持在或接近37℃，且CO2水平维持在或接近5％，同时具有为、为约、或至少0.01L/min、0.05L/min、0.1L/min、0.2L/min、0.3L/min、0.4L/min、0.5L/min、1.0L/min、1.5L/min或2.0L/min或大于2.0L/min的稳定空气流。在某些实施方案中，至少一部分培养通过灌注如以290ml/天、580ml/天、和/或1160ml/天的速率进行。

在一些方面，细胞在灌注启用的自动封闭扩增系统中扩增。灌注可以连续地向细胞添加培养基，以确保达到最佳生长速度。

在一些实施方案中，使用Xuri细胞扩增系统生物反应器进行扩增。可以将细胞以每毫升50万-150万个细胞接种。可以将细胞在静态或摇动条件下培养。培养基可以大剂量添加或按灌注时间表添加。在实施方案中，生物反应器将温度维持在或接近37℃并且将CO2水平维持在或接近5％。培养物的体积可保持在约0.5L至1.0L。在一些实施方案中，扩增进行7-14天，如7-10天。在一些方面，扩增在扩增后产生1亿至500亿个细胞和/或导致10至1000倍扩增的扩增倍数。

在一些实施方案中，使用Miltenyi Prodigy生物反应器进行扩增。可以将细胞以每毫升50万-150万个细胞接种。可以将细胞在静态或振荡条件下培养。培养基可以大剂量添加或按灌注时间表添加。在实施方案中，生物反应器将温度维持在或接近37℃并且将CO2水平维持在或接近5％。培养物的体积可保持在大约70mL至400mL。在一些实施方案中，扩增进行7-14天，如7-10天。在一些方面，扩增在扩增后产生1亿至30亿个细胞，和/或导致扩增10至1000倍。

在一些实施方案中，使用透气袋进行扩增。可以将细胞以每毫升50万-150万个细胞接种。可以将细胞在静态条件下培养。在实施方案中，生物反应器将温度维持在或接近37℃并且将CO2水平维持在或接近5％。在此类方面，当细胞浓度超过每毫升200万个细胞时，可以添加培养基以使细胞浓度达到每毫升50万与100万个细胞之间。如果体积达到袋的最大体积，则将细胞添加至更大的袋或多个袋中，以在相同的条件下进行培养。在一些实施方案中，扩增进行7-14天，如7-10天。

在一些实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂孵育以扩增肿瘤反应性细胞进行为或约1天，如通常为或约2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天，或任何前述时间之间的任何时间范围。在一些实施方案中，与一种或多种T细胞刺激剂孵育以扩增肿瘤反应性细胞进行7-21天，如7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天，或任何前述时间之间的任何值。在一些实施方案中，孵育进行7-14天。在一些实施方案中，孵育进行7-10天。在一些实施方案中，孵育持续为或约7天。在一些实施方案中，孵育持续为或约8天。在一些实施方案中，孵育持续为或约9天。在一些实施方案中，孵育持续为或约10天。在一些情况下，可以将培养基在培养或孵育时间期间每天、每隔一天、每三天、每5天或每周更换一次。在一些实施方案中，在每次培养基更换时补充刺激剂(例如细胞因子、抗CD3)。

在一些实施方案中，进行根据任何所提供的方法进行培养以扩增细胞的方法，直至获得阈值量的细胞，如肿瘤反应性细胞或者一种或多种T细胞激活标记物呈阳性的细胞。在一些实施方案中，进行根据所提供的任何方法进行培养以扩增细胞的方法，直至从富集淋巴细胞之时起多至30天。在一些实施方案中，进行根据所提供的任何方法进行培养以扩增细胞的方法，直至在起始第一次扩增后多至20天。在一些实施方案中，进行根据所提供的任何方法进行培养以扩增细胞的方法，直至在起始共培养后多至20天。在任何所提供的实施方案的一些中，在起始培养和/或富集包含肿瘤反应性细胞的T细胞后20天内进行收获。在任何所提供的实施方案的一些中，在起始培养后7至20天、7至14天、7至10天、10至20天、10至14天或14至20天收获细胞。应理解，对天数的提及是指细胞存在于培养物中的天数，并且不包括来自这些步骤中的任何一个或多个的细胞可以在低温保存条件下储存的时间。

在任何所提供的实施方案的一些中，进行培养直至达到细胞的阈值量，所述阈值量是在为或约0.5x10⁸与为或约50x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约0.5x10⁸与为或约30x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在0.5x10⁸与为或约12x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约0.5x10⁸与为或约60x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约0.5x10⁸与为或约15x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约0.5x10⁸与为或约8x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约0.5x10⁸与为或约3.5x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约0.5x10⁸与为或约1x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在1x10⁸与为或约50x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约1x10⁸与为或约30x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在1x10⁸与为或约12x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约1x10⁸与为或约60x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约1x10⁸与为或约15x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约1x10⁸与为或约8x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约1x10⁸与为或约3.5x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约3.5x10⁸与为或约50x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约3.5x10⁸与为或约30x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约3.5x10⁸与为或约12x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约3.5x10⁸与为或约60x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约3.5x10⁸与为或约15x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约3.5x10⁸与为或约8x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约8x10⁸与为或约50x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约8x10⁸与为或约30x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约8x10⁸与为或约12x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约8x10⁸与为或约60x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约8x10⁸与为或约15x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约15x10⁸与为或约50x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约15x10⁸与为或约30x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约15x10⁸与为或约12x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约15x10⁸与为或约60x10⁸个总细胞或总活细胞之间、在为或约60x10⁸与为或约50x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约60x10⁸与为或约30x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约60x10⁸与为或约12x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约12x10⁹与为或约50x10⁹个总细胞或总活细胞之间、在为或约12x10⁹与为或约30x10⁹个总细胞或总活细胞之间、或者在为或约30x10⁹与为或约60x10⁹个总细胞或总活细胞之间，每个都包含端值。

在任何所提供的实施方案的一些中，所述方法导致T细胞的扩增倍数或肿瘤反应性T细胞的扩增倍数为至少或至少约2倍、至少或至少约5倍、至少或至少约10倍、至少或至少约25倍、至少或至少约50倍、至少或至少约100倍、至少或至少约250倍、至少或至少约500倍、至少或至少约1000倍、或更多。

在扩增后达到治疗剂量后，可以将产物浓缩并冷冻在低温保存介质中。本文还提供了通过本文所述的方法产生的T细胞群体及其药物组合物。

II.组合物和药物配制品

本文提供了含有如通过任何所提供的方法产生的经扩增的T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含肿瘤反应性T细胞或含有对肿瘤相关抗原(例如新抗原)具有特异性的内源TCR的T细胞。特别地，所提供的组合物包括富集肿瘤反应性T细胞或含有对肿瘤相关抗原(例如新抗原)具有特异性的内源TCR的T细胞的细胞组合物。

在一些实施方案中，所述组合物包含约5％-99％的肿瘤反应性T细胞或者一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞，或在5％与99％之间(包含端值)的任何百分比的此类细胞。在一些实施方案中，与在受试者中或分离出细胞的生物样品中天然存在的肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞相对于总CD3+T细胞或总细胞而言的百分比相比，所述组合物可以包括增加的或更高的在所述组合物中此类肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞相对于总CD3+T细胞或总细胞而言的百分比。在一些实施方案中，所述百分比增加至少或至少约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更多。在此类实施方案中，所述一种或多种T细胞激活标记物可以是所述的任何一种，如CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90和/或CD38中的任何一种或多种。

在一些实施方案中，所述组合物可以包含至少或至少约20％、至少或至少约30％、至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约65％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约81％、至少或至少约82％、至少或至少约83％、至少或至少约84％、至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、或基本上100％的肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含超过30％的肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含超过40％的肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含超过50％的肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含超过60％的肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含超过70％的肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含超过80％的肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含超过90％的肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在此类实施方案中，所述一种或多种T细胞激活标记物可以是所述的任何一种，如CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90和/或CD38中的任何一种或多种。在此类实施方案中，所述一种或多种T细胞激活标记物可以是CD134和/或CD137。

在一些实施方案中，肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞可以以治疗有效量存在于组合物中。细胞的有效量可以根据患者以及疾病的类型、严重性和程度而变化。因此，医生可以在考虑受试者的健康、疾病的程度和严重性以及其他变量后确定有效量。

在某些实施方案中，所述组合物中此类细胞的数量是治疗有效量。在一些实施方案中，所述量是降低动物中与癌症、病毒感染、微生物感染或脓毒性休克相关的严重性、持续时间和/或症状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是细胞的剂量，其导致相对于未施用本文所述组合物的患者(或动物)或一组患者(或动物)中癌症的生长或扩散，使用所述组合物的患者或动物中癌症的生长或扩散减少至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少35％、至少45％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，治疗有效量是导致细胞毒性活性的量，所述细胞毒性活性导致抑制或减少癌症、病毒和微生物细胞生长的活性。

在一些实施方案中，所述组合物包含一定量的肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞，所述量为或约10⁵至为或约10¹²个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、或为或约10⁵至为或约10⁸个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、或为或约10⁶至为或约10¹²个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、或为或约10⁸至为或约10¹¹个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、或为或约10⁹至为或约10¹⁰个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含大于或大于为或约10⁵个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10⁶个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10⁷个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10⁸个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10⁹个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10¹⁰个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10¹¹个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、或者为或约10¹²个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在一些实施方案中，可以将这种量施用于患有疾病或病症的受试者，如施用于癌症患者。在此类实施方案中，所述一种或多种T细胞激活标记物可以是所述的任何一种，如CD107a、CD39、CD103、CD59、CD90和/或CD38中的任何一种或多种。在一些实施方案中，所述一种或多种T细胞激活标记物是CD134和/或CD137。

在一些实施方案中，所述组合物包含占群体中总细胞的如下百分比的CD3+T细胞：大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约90％、或大于或大于约95％。在一些实施方案中，所述组合物包含占群体中总细胞的如下百分比的CD4+T细胞和CD8+T细胞：大于或大于约60％、大于或大于约70％、大于或大于约80％、大于或大于约90％、或大于或大于约95％。在特定实施方案中，所述组合物包含如下比率的CD8+T细胞与CD4+T细胞：在为或约1:100与为或约100:1之间、在为或约1:50与为或约50:1之间、在为或约1:25与为或约25:1之间、在为或约1:10与为或约10:1之间、在为或约1:5与为或约5:1之间、在为或约1:2.5与为或约2.5:1之间。

在一些实施方案中，所述组合物的体积是至少或至少约10mL、50mL、100mL、200mL、300mL、400mL或500mL，如从或从约10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述组合物具有至少或至少约1x10⁵个细胞/mL、5x10⁵个细胞/mL、1x10⁶个细胞/mL、5x10⁶个细胞/mL、1x10⁷个细胞/mL、5x10⁷个细胞/mL或1x10⁸个细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案，所述组合物的细胞密度是在或在约1x10⁵个细胞/mL至1x10⁸个细胞/mL之间、1x10⁵个细胞/mL至1x10⁷个细胞/mL之间、1x10⁵个细胞/mL至1x10⁶个细胞/mL之间、1x10⁶个细胞/mL至1x10⁷个细胞/mL之间、1x10⁶个细胞/mL至1x10⁸个细胞/mL之间、1x10⁶个细胞/mL至1x10⁷个细胞/mL之间或1x10⁷个细胞/mL至1x10⁸个细胞/mL之间，每个都包含端值。

所述组合物包括用于施用(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。在一些实施方案中，将工程化细胞与药学上可接受的载体一起配制。

药学上可接受的载体可以包括与药物施用相容的所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(Gennaro,2000,Remington:The science andpractice of pharmacy,Lippincott,Williams&Wilkins，费城，宾夕法尼亚州)。此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介物，如不挥发性油类。补充性活性化合物也可掺入到组合物中。药物载体应是适用于NK细胞的载体，如盐水溶液、右旋糖溶液或包含人血清白蛋白的溶液。

在一些实施方案中，用于此类组合物的药学上可接受的载体或媒介物是如下任何无毒的水溶液，在所述无毒的水溶液中NK细胞可以在足以允许施用活NK细胞的时间内维持或保持存活。例如，所述药学上可接受的载体或媒介物可以是盐溶液或缓冲盐水溶液。药学上可接受的载体或媒介物还可以包括可提高NK细胞的效率的各种生物材料。细胞媒介物和载体可以例如包括多糖如甲基纤维素(M.C.Tate,D.A.Shear,S.W.Hoffman,D.G.Stein,M.C.LaPlaca,Biomaterials 22,1113,2001，将其通过引用以其整体并入本文)、壳聚糖(Suh J K F,Matthew H W T.Biomaterials,21,2589,2000；Lahiji A,Sohrabi A,Hungerford D S,等人,J Biomed Mater Res,51,586,2000，将其每一个通过引用以其整体并入本文)、N-异丙基丙烯酰胺共聚物P(NIPAM-共-AA)(Y.H.Bae,B.Vernon,C.K.Han,S.W.Kim,J.Control.Release 53,249,1998；H.Gappa,M.Baudys,J.J.Koh,S.W.Kim,Y.H.Bae,Tissue Eng.7,35,2001，将其每一个通过引用以其整体并入本文)、以及聚(氧乙烯)/聚(D,L-乳酸共乙醇酸)(B.Jeong,K.M.Lee,A.Gutowska,Y.H.An,Biomacromolecules3,865,2002，将其通过引用以其整体并入本文)、P(PF-共-EG)(Suggs L J,Mikos AG.CellTrans,8,345,1999，将其通过引用以其整体并入本文)、PEO/PEG(Mann B K,Gobin AS,TsaiA T,Schmedlen R H,West J L.,Biomaterials,22,3045,2001；Bryant S J,Anseth KS.Biomaterials,22,619,2001，将其每一个通过引用以其整体并入本文)、PVA(Chih-TaLee,Po-Han Kung和Yu-Der Lee,Carbohydrate Polymers,61,348,2005，将其通过引用以其整体并入本文)、胶原蛋白(Lee C R,Grodzinsky A J,Spector M.,Biomaterials22,3145,2001，将其通过引用以其整体并入本文)、藻酸盐(Bouhadir K H,Lee K Y,AlsbergE,Damm K L,Anderson K W,Mooney D J.Biotech Prog 17,945,2001；Smidsrd O,Skjak-Braek G.,Trends Biotech,8,71,1990，将其每一个通过引用以其整体并入本文)。

在一些实施方案中，包括药物组合物在内的所述组合物是无菌的。在一些实施方案中，在封闭或无菌环境中进行细胞分离或富集，例如，以最小化误差、用户操作和/或污染。在一些实施方案中，可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。

本文还提供了适合于低温保存所提供的T细胞的组合物，所述T细胞包括肿瘤反应性T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含低温保护剂。在一些实施方案中，所述低温保护剂是或包含DMSO和/或甘油。在一些实施方案中，配制用于低温保存的组合物可在低温(如超低温)下储存，例如，以范围从-40℃至-150℃，如或约80℃±6.0℃的温度储存。

在一些实施方案中，所述低温保存的细胞通过解冻准备用于施用。在一些情况下，可将细胞在解冻后立即施用于受试者。在这样的实施方案中，所述组合物无需任何进一步处理即可使用。在其他情况下，细胞在解冻后被进一步处理，如通过用药学上可接受的载体重悬、用激活剂或刺激剂孵育、或者在施用于受试者之前被激活洗涤并重悬在药学上可接受的缓冲液中。

III.治疗方法和治疗应用

本文提供了与本文描述的所提供的治疗性细胞组合物相关的组合物和方法，用于治疗受试者的疾病或病症，如癌症。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如涉及向患有疾病、病症或障碍的受试者施用所述治疗性细胞或含有所述治疗性细胞的组合物。在一些情况下，所述疾病或障碍是肿瘤或癌症。在一些实施方案中，以有效量施用所述细胞或其药物组合物以实现所述疾病或障碍的治疗。用途包括所述细胞或其药物组合物在此类方法和治疗中以及在制备药物以实施此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，所述方法由此治疗受试者的疾病或病症或障碍。

在一些实施方案中，治疗方法包括施用有效量的含有肿瘤反应性CD3+T细胞或可包含一种或多种激活标记物呈表面阳性的T细胞的CD3+T细胞的组合物。此类组合物可包括本文所述的任何组合物，包括通过所提供的方法产生的组合物。

在一些实施方案中，受试者(例如自体)被施用通过任何所提供的方法产生的为或约10⁵至为或约10¹²个CD3+T细胞，或通过任何所提供的方法产生的为或约10⁵至为或约10⁸个CD3+T细胞，或通过任何所提供的方法产生的为或约10⁶至为或约10¹²个CD3+T细胞，或通过任何所提供的方法产生的为或约10⁸至为或约10¹¹个CD3+T细胞，或通过任何所提供的方法产生的为或约10⁹至为或约10¹⁰个CD3+T细胞。在一些实施方案中，施用的治疗有效量包括通过任何所提供的方法产生的大于或者大于为或约10⁵个CD3+T细胞，通过任何所提供的方法产生的为或约10⁶个CD3+T细胞，通过任何所提供的方法产生的为或约10⁷个CD3+T细胞，通过任何所提供的方法产生的为或约10⁸个CD3+T细胞，通过任何所提供的方法产生的为或约10⁹个CD3+T细胞，通过任何所提供的方法产生的为或约10¹⁰个CD3+T细胞，通过任何所提供的方法产生的为或约10¹¹个CD3+T细胞，或通过任何所提供的方法产生的为或约10¹²个CD3+T细胞。在一些实施方案中，可以将这种量施用于患有疾病或病症的受试者，如施用于癌症患者。在一些实施方案中，施用的所述数量的T细胞是活T细胞。

在一些实施方案中，治疗方法包括施用有效量的含有肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞的组合物。此类组合物可包括本文所述的任何组合物，包括通过所提供的方法产生的组合物。在一些实施方案中，将为或约10⁵至为或约10¹²个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物(如任何所述的)呈表面阳性的CD3+T细胞、或为或约10⁵至为或约10⁸个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、或为或约10⁶至为或约10¹²个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、或为或约10⁸至为或约10¹¹个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、或为或约10⁹至为或约10¹⁰个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞施用于个体。在一些实施方案中，施用的治疗有效量包括大于或大于为或约10⁵个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10⁶个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10⁷个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10⁸个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10⁹个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10¹⁰个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、为或约10¹¹个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞、或者为或约10¹²个肿瘤反应性CD3+T细胞或者一种或多种激活标记物呈表面阳性的CD3+T细胞。在一些实施方案中，可以将这种量施用于患有疾病或病症的受试者，如施用于癌症患者。在一些实施方案中，施用的所述数量的T细胞是活T细胞。

在一些实施方案中，所述量作为平剂量施用。在其他实施方案中，所述量是按受试者的每千克体重施用。

在一些实施方案中，在根据所提供的方法扩增后不久，将组合物，如通过任何所提供的方法产生的或含有肿瘤反应性T细胞或T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞的组合物施用于个体。在其他实施方案中，如通过上述方法，在施用之前低温保存扩增的T细胞，如扩增的肿瘤反应性T细胞或T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞。例如，T细胞，如肿瘤反应性T细胞或T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞，可以在施用于个体之前储存超过6、12、18或24个月。此类低温保存的细胞可以在施用前解冻。

在一些实施方案中，所提供的组合物，如通过任何所提供的方法提供的或含有肿瘤反应性T细胞或T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞的组合物，可以通过任何便利的途径施用于受试者，所述途径包括肠胃外途径，如皮下、肌肉内、静脉内和/或硬膜外施用途径。

在一些实施方案中，可以以单剂量施用组合物，如通过任何所提供的方法提供的或含有肿瘤反应性T细胞或T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞的组合物。这种施用可以通过注射，例如静脉内注射来进行。在一些实施方案中，可以以多剂量施用肿瘤反应性T细胞或T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞。给药可以是每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或多于六次。给药可以是每月一次、每两周一次、每周一次或每隔一天一次。只要需要，此类组合物和细胞的施用可继续进行。

在一些实施方案中，在施用来自所提供组合物(如通过任何所提供的方法产生的或含有肿瘤反应性T细胞或者T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞的组合物)的细胞的剂量之前，向受试者施用淋巴细胞清除疗法。淋巴细胞清除疗法可包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺(活性形式称为马磷酰胺)及其组合。此类方法描述于Gassner等人(Cancer ImmunolImmunother.201 1,60(l):75-85，Muranski,等人,Nat Clin Pract Oncol,2006 3(12):668-681，Dudley,等人,J Clin Oncol 2008,26:5233-5239，以及Dudley,等人,J ClinOncol.2005,23(10):2346-2357，其全部内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，以如下剂量施用氟达拉滨：10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天、或45mg/kg/天，或任何前述值的范围之间的剂量。在一些实施方案中，氟达拉滨持续2-7天，如3-5天，如为或约3天、为或约4天、或者为或约5天。在一些实施方案中，以如下剂量施用环磷酰胺：100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天、或300mg/m2/天。在一些实施方案中，静脉内施用(即i.v.)环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗持续2-7天，如3-5天、为或约3天、为或约4天、或者为或约5天。在提供的细胞组合物之前施用淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法是在施用所提供的细胞组合物的一周内进行，如在施用细胞剂量之前5-7天进行。

本文所述的组合物可用于治疗过度增殖性障碍的方法中。在优选的实施方案中，它们用于治疗癌症。在一些方面，所述癌症可以是黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、肾细胞癌、急性髓性白血病、结直肠癌、和肉瘤。在一些实施方案中，所述癌症是具有高突变负荷的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、肺鳞癌、肺腺癌、膀胱癌、肺小细胞癌、食道癌、结直肠癌、宫颈癌、头颈癌、胃癌或子宫癌。

在一些实施方案中，所述癌症是上皮癌。在一些实施方案中，所述癌症选自非小细胞肺癌(NSCLC)、CRC、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌、子宫内膜癌。在一些实施方案中，乳腺癌是HR+/Her2-乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，乳腺癌是HER2+乳腺癌。

在一些实施方案中，受试者患有作为血液肿瘤的癌症。血液肿瘤的非限制性例子包括：白血病，其包括急性白血病(如l lq23阳性急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性髓细胞性白血病以及成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红细胞白血病)、慢性白血病(如慢性粒细胞(myelocytic/granulocytic)白血病、慢性髓细胞性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高分级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。

在一些实施方案中，受试者患有实体瘤癌症。实体瘤的非限制性例子，如肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴样恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌(包括基底细胞型乳腺癌、导管癌和小叶乳腺癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。在若干例子中，肿瘤是黑色素瘤、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌或结肠癌。

在一些实施方案中，所述癌症是皮肤癌。在特定实施方案中，所述癌症是黑色素瘤，如皮肤黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是梅克尔细胞或转移性皮肤鳞状细胞癌(CSCC)。

在一些实施方案中，所述肿瘤是癌，其是从上皮细胞发展的癌症或者是上皮起源的癌症。在一些实施方案中，癌症起因于上皮细胞，包括但不限于乳腺癌、基底细胞癌、腺癌、胃肠癌、唇癌、口腔癌、食道癌、小肠癌和胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌和皮肤癌(如鳞状细胞癌和基底细胞癌)、前列腺癌、肾细胞癌，以及影响遍及身体的上皮细胞的其他已知癌症。

在一些实施方案中，受试者患有是涉及胃肠道(GI道)癌症的胃肠癌的癌症，所述胃肠癌包括上消化道或下消化道的癌症，或消化的辅助器官如食道、胃、胆道系统、胰腺、小肠、大肠、直肠或肛门的癌症。在一些实施方案中，癌症是食道癌、胃(stomach/gastric)癌、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、胆囊癌、粘膜相关淋巴组织癌(MALT淋巴瘤)、胆道系统癌症、结直肠癌(包括结肠癌、直肠癌或两者)、肛门癌或胃肠道类癌肿瘤。在特定实施方案中，癌症是结直肠癌。

在一些实施方案中，所述癌症是结直肠癌。结直肠癌(CRC)是发病率渐升的常见肿瘤，在许多情况下，它对检查点抑制或其他免疫疗法没有反应。情况就是这样，即使此类癌症具有与反应相关的特性，例如适度高的突变率和良好确立的在预后与T细胞浸润水平之间的关联。

在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，所述癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。

在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是梅克尔细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是转移性皮肤鳞状细胞癌(CSCC)。在一些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。

在一些实施方案中，受试者是其癌症对检查点阻断剂(如抗PD1或抗PD-L1疗法)具有难治性和或在用所述检查点阻断剂治疗后已复发的受试者。

在一些实施方案中，受试者是为产生治疗性细胞组合物而获得生物样品的同一受试者。在一些这样的实施方案中，所提供的治疗方法是用含有受试者自体T细胞的治疗性组合物进行的过继细胞疗法。

在一些实施方案中，本文提供的细胞组合物对于待治疗的受试者是自体的。在此类实施方案中，用于扩增的起始细胞直接分离自来自如本文所述的受试者的生物样品，在一些情况下包括富集如所述的一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞；并在如本文提供的扩增条件下培养。在一些方面，来自受试者的生物样品是或包括肿瘤或淋巴结样品，并且如通过切除或活检(例如芯针吸活检或细针抽吸)获得这种肿瘤样品和一定量的这种组织。在一些实施方案中，在根据所提供的方法在扩增条件下培养之后，将细胞进行配制并且任选地低温保存以用于随后施用于同一受试者以治疗癌症。

在一些实施方案中，本文提供的细胞组合物对于待治疗的受试者是同种异体的。在一些方面，衍生或分离出细胞的受试者是健康受试者或已知未患有疾病或病症，如癌症。在此类实施方案中，用于扩增的起始细胞直接分离自来自如本文所述的这种受试者的生物样品，在一些情况下包括富集如所述的一种或多种T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞；并在如本文提供的扩增条件下培养。在一些方面，来自受试者的生物样品是或包括肿瘤或淋巴结样品，并且如通过切除或活检(例如芯针吸活检或细针抽吸)获得这种肿瘤样品和一定量的这种组织。在一些实施方案中，在扩增条件下培养之后，将细胞进行配制并且任选地低温保存以用于随后施用于不同受试者以在这个不同的受试者中治疗癌症。

在一些实施方案中，所提供的方法可以与一种或多种其他免疫疗法一起进行。在一些实施方案中，免疫疗法是作为免疫检查点抑制剂的免疫调节剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂特异性结合选自以下的分子：CD25、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、4-1BB、GITR、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CXCR2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、CD28、TIGIT和VISTA。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体或抗原结合片段、小分子或多肽。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、MK-3475、BMS-936559、MPDL3280A、伊匹单抗、曲美目单抗、IMP31、BMS-986016、乌瑞鲁单抗、TRX518、达塞妥珠单抗、鲁卡妥木单抗、SEQ-CD40、CP-870、CP-893、MED16469、MEDI4736、MOXR0916、AMP-224和MSB001078C，或者是它们的抗原结合片段。

在一些实施方案中，所提供的方法包括如所述的细胞疗法与PD-1或PD-L1抑制剂的组合疗法。PD-1或PD-L1抑制剂可包括结合抗体、拮抗剂或抑制剂(即阻断剂)。

在一个实施方案中，PD-I抑制剂是纳武单抗(可商购为来自Bristol-MyersSquibb Co.的OPDIVO)或其生物仿制药、抗原结合片段、缀合物或变体。纳武单抗是阻断PD-I受体的全人IgG4抗体。在一个实施方案中，抗PD-I抗体是免疫球蛋白G4κ、抗(人CD274)抗体。纳武单抗的化学文摘服务社(CAS)注册号指定为946414-94-4，并且还称为5C4、BMS-936558、l\tIDX-1106和ONO-4538。美国专利号8,008,449和国际专利公开号WO 2006/121168中描述了纳武单抗的制备和特性。

在另一个实施方案中，PD-1抑制剂包括派姆单抗(可商购为来自美国新泽西州肯纳尔沃斯堡的Merck&Co.,Inc.的KEYTRUDA)或其抗原结合片段、缀合物或变体。派姆单抗的CAS注册号指定为1374853-91-4，并且还称为兰姆利珠单抗(lambrolizumab)、MK-3475和SCH-900475。派姆单抗的特性、用途和制备描述于国际专利公开号WO 2008/156712 Al、美国专利号8,354,509以及美国专利申请公开号US 2010/0266617 Al、US 2013/0108651Al和US 2013/0109843 A2中。

在一个实施方案中，PD-LI抑制剂是度伐鲁单抗，也称为MEDI4736(可商购于Medimmune,LLC,Gaithersburg,JVIaryland,AstraZeneca plc.子公司)，或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一个实施方案中，PD-LI抑制剂是美国专利号8,779,108或美国专利申请公开号2013/0034559中披露的抗体。

在一个实施方案中，PD-LI抑制剂是阿维鲁单抗，也称为MSB0010718C(可商购于Merck KGaA/EMD Serono)，或其抗原结合片段、缀合物或变体。美国专利申请公开号US2014/0341917 A1中描述了阿维鲁单抗的制备和特性。

在一个实施方案中，PD-LI抑制剂是阿特珠单抗，也称为MPD L3280A或RG7446(可商购为来自瑞士巴塞尔的Roche Holding AG子公司Genentech,Inc.的TECENTRIQ)，或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一个实施方案中，PD-LI抑制剂是美国专利号8,217,149中披露的抗体，其披露内容通过引用特别并入本文。在一个实施方案中，PD-LI抑制剂是美国专利申请公开号2010/0203056Al、2013/0045200Al、2013/0045201Al、2013/0045202Al或2014/0065135Al中披露的抗体。阿特珠单抗的制备和特性描述于美国专利号8,217,149中。

IV.试剂盒和制品

本文提供了包含所提供的组合物的制品和试剂盒，所述组合物如含有通过任何所提供的方法产生的T细胞或者含有或富集肿瘤反应性T细胞或T细胞激活标记物呈表面阳性的T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是通过任何所提供的方法来产生的。

试剂盒可以任选地包括一个或多个部件，如使用说明书、装置和另外的试剂(例如，用于稀释所述组合物和/或重构冻干蛋白质的无菌水或盐水溶液)；以及诸如用于实践所述方法的试管、容器和注射器等部件。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含用于样品的收集、样品的制备和处理的试剂，和/或用于定量样品中一种或多种表面标记物的量的试剂(如但不限于检测试剂，如抗体、缓冲液、用于酶染色的底物、铬或其他材料，如载玻片、容器、微量滴定板)，以及任选地用于执行所述方法的说明书。本领域技术人员将认识到可根据所提供的方法使用的许多其他可能的容器和板以及试剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒可以作为制品提供，所述制品包括用于包装所述细胞、抗体或试剂或其组合物或一种或多种其他组分的包装材料。例如，所述试剂盒可以含有容器、瓶子、管、小瓶以及适合用于分离或组织试剂盒的部件的任何包装材料。所述一个或多个容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。在一些实施方案中，所述一个或多个容器容纳包含细胞或抗体或用于所述方法中的其他试剂的组合物。本文的制品或试剂盒可以在单独的容器中或在同一容器中包含所述细胞、抗体或试剂。

在一些实施方案中，容纳所述组合物的所述一个或多个容器可以是一次性使用的小瓶或多次使用的小瓶，其在一些情况下可以允许所述组合物的重复使用。在一些实施方案中，所述制品或试剂盒还可以包含第二容器，所述第二容器包含合适的稀释剂。所述制品或试剂盒还可以包含从商业、治疗和用户角度来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器、治疗剂和/或印有使用说明书的包装插页。

在一些实施方案中，所述试剂盒可以任选地包含说明书。说明书通常包括描述所述细胞组合物、任选地包含在所述试剂盒中的其他组分的有形表达及其使用方法。在一些实施方案中，所述说明书指示了如根据任何所提供的实施方案使用所述细胞组合物施用于受试者以治疗疾病或病症的方法。在一些实施方案中，所述说明书作为标签或包装插页提供，所述标签或包装插页位于所述容器上或与所述容器相关联。在一些实施方案中，所述说明书可以指示针对所述组合物的重构和/或使用的指导。

V.定义

如本文所用的，单数形式“一种/个(a/an)”和“所述(the)”包括复数种/个指示物，除非上下文另外明确说明。例如，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。

在整个本公开文本中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应理解，以范围形式描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当将范围的描述视为已明确公开该范围内所有可能的子范围以及单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其他所述值或中间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括一个或两个所述限值的情况下，排除那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都适用。

如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)涉及所述值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。

术语“表位”意指源自蛋白质抗原的短肽，其中该肽结合主要组织相容性复合体(MHC)分子并在MHC结合的背景中被T细胞识别。表位可以结合MHC I类分子(例如HLA-A1、HLA-A2或HLA-A3)或MHC II类分子。

如本文所用的术语“同种异体的”意指从一种生物体取出并随后输注或过继转移至相同物种的遗传上不同的生物体中的细胞或组织。

如本文所用的术语“自体的”意指从生物体中取出并且之后输注或过继转移的同一生物体中的细胞或组织。

本文的术语“抗体”是以最广义使用，并包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')₂片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异源缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二scFv、串联三scFv。除非另外说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。该术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。所提供的抗体包括抗体片段。

“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了常规或完整抗体以外的分子，其包含常规或完整抗体的一部分，这部分至少含有结合抗原的可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fv、单链Fv(sdFv)、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂；双抗体；线性抗体；仅包含V_H区的单域抗体(VHH)。

如本文所用，“结合”、“结合的”或其语法变体是指分子参与和另一种分子的任何有吸引力的相互作用，导致稳定缔合，其中这两种分子彼此非常靠近。结合包括但不限于非共价键、共价键(如可逆和不可逆共价键)，并且包括分子(如但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小分子，如包括药物在内的化合物)之间的相互作用。

术语“生物样品”意指一定量的来自活物或曾经的活物的物质。此类物质包括但不限于血液(例如全血)、血浆、血清、尿液、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾脏。

如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群体时，“富集”是指例如与组合物中的细胞总数或组合物体积相比或者相对于其他细胞类型，如通过基于所述群体或细胞表达的标记物的阳性选择，或通过基于不存在于待耗尽的所述细胞群体或细胞上的标记物的阴性选择来增加所述细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不需要从组合物中完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在富集的组合物中以等于或甚至接近100％存在。

术语“并行”在本文中用于指涉及两种或更多种药剂的程序，如孵育、选择、富集或施用，其中用一种药剂的特定程序的至少一部分与至少第二种药剂在时间上重叠。

术语“间歇地”在本文中用于指涉及两种或更多种药剂的程序，如孵育、选择、富集或施用，其中涉及每种药剂的特定程序不以规律间隔发生或不是连续的，或重复地停止和开始(中间间隔一定时间段)。

术语“依序”在本文中用于指涉及两种或更多种药剂的程序，如孵育、选择、富集或施用，其中涉及每种药剂的特定程序在时间上不重叠。

如本文所用的，就肽、蛋白质或多肽而论，“分离的”或“纯化的”是指基本上不含所有其他多肽、污染物、起始试剂或其他材料，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品的分子。如果如通过本领域技术人员用于评估这种纯度的诸如高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)或毛细管电泳(CE)等标准分析方法确定的，制剂显现不含容易检测到的杂质，或者足够纯使得进一步的纯化不会可检测地改变该物质的物理和化学性质的话，可以确定所述制剂基本上是游离的。

如本文所用的，术语“重组”是指通过引入外源(如异源)核酸分子而被修饰的细胞、微生物、核酸分子或载体，或者是指已经被改变使得内源核酸分子或基因的表达受到控制、去调节或是组成型的细胞或微生物，其中此类改变或修饰可以通过遗传工程引入。遗传改变可以包括例如引入编码一种或多种蛋白质或酶的核酸分子(其可以包括表达控制元件，如启动子)的修饰或其他核酸分子添加、缺失、取代或对细胞遗传材料的其他功能性破坏或添加。示例性修饰包括来自参考或亲本分子的异源或同源多肽的编码区或其功能片段中的修饰。术语“重组体”还可以指从这种核酸分子或载体或者从引入了外源核酸或用外源核酸修饰的这种细胞或微生物表达的蛋白质产物。

如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。

如本文所用，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形发生或不发生，并且所述描述包括所述事件或情形发生的情况和不发生的情况。例如，任选地取代的基团意指所述基团未被取代或被取代。

术语“药物组合物”是指适用于哺乳动物受试者(通常为人)中的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如，如根据所提供的方法扩增的细胞)和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

“药学上可接受的载体”是指本领域常规的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、配制辅助剂或载体，其与共同包含用于施用于受试者的“药物组合物”的治疗剂一起使用。药学上可接受的载体在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与配制品的其他成分相容。所述药学上可接受的载体适用于所用的配制品。

在本文中“细胞群体”的提及意为指代具有共同特征的许多细胞。细胞群体通常包含多个细胞，如大于为或约100个细胞、为或约1000个细胞，并且数量通常在1x10⁴至1x10¹⁰的范围内。

如本文所用的关于蛋白质的术语“可溶的”意指蛋白质未结合、固定或附着于颗粒，如细胞或固体支持物，例如珠。例如，可溶性蛋白质包括不像跨膜蛋白质那样与细胞的细胞膜结合的蛋白质。在一些情况下，蛋白质的溶解性可以通过直接或间接地经由接头与另一种分子如Fc结构域连接或附接来改善，在一些情况下，Fc结构域也可以改善蛋白质的稳定性和/或半衰期。在一些方面，可溶性蛋白质是Fc融合蛋白。

如本文所用术语“特异性地结合”意指蛋白质在特异性地结合条件下结合至靶蛋白使得其亲和力或亲合力大至相同蛋白质与足够统计尺寸的随机肽或多肽的集合的平均亲和力或亲合力的至少10倍，且任选地50、100、250或500倍，或甚至至少1000倍的能力。特异性结合蛋白不需要专门结合单一靶分子，而是可以特异性结合多于一种靶分子。在一些情况下，特异性结合蛋白可以结合与靶蛋白在结构构象上具有相似性的蛋白质(例如旁系同源物或直系同源物)。本领域技术人员将认识到，与不同动物物种中具有相同功能的分子(即直系同源物)或与具有与靶分子基本相似的表位的分子(例如，旁系同源物)的特异性结合是可能的，并且不会减弱相对于独特非靶标的统计学上有效的集合(例如随机多肽)确定的结合特异性。可使用固相ELISA免疫测定、ForteBio Octet或Biacore测量来确定两种蛋白质之间的特异性结合。通常，两种结合蛋白之间的相互作用具有小于约1x10^-5M、并且通常低至约1x10^-12M的解离常数(Kd)。在本公开文本的某些方面，两种结合蛋白之间的相互作用具有小于约1x10^-6M、1x10^-7M、1x10^-8M、1x10^-9M、1x10^-10M或1x10^-11M或更小的解离常数。

如本文所用，细胞或细胞群体对特定标记物呈“阳性”的陈述是指特定标记物(通常为表面标记物)在细胞上或细胞中的可检测的存在。当提及表面标记物时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记物特异性地结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平与已知对所述标记物呈阳性的细胞的水平基本上相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平。

如本文所用，细胞或细胞群体对特定标记物呈“阴性”的陈述是指特定标记物(通常为表面标记物)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记物时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记物特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记物呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。

如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。所述受试者可以是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指治疗性组合物(如含有例如根据所提供的方法扩增的细胞)的量和/或浓度，其当施用于患者时以任何方式导致病症、障碍或疾病或其他适应症的症状得以改善或以其他方式有益地改变。治疗疾病或障碍的有效量可以是减轻、减少或缓解与所述疾病或障碍相关的至少一种症状或生物反应或效应、阻止所述疾病或障碍进展或改进患者的身体机能的量。在特定方面，如例如通过改善或消除疾病的症状和/或病因，对疾病进展具有统计学上显著的抑制。在细胞疗法的情况下，有效量是施用于患者的细胞的有效剂量或数量。在一些实施方案中，患者是人类患者。

如本文所用，“疾病”、“障碍”或“病症”是指由包括但不限于感染、获得性病症、遗传病症的原因或病症引起的且由可识别症状表征的在生物体中的病理病症。特别地，它是一种需要和/或期望治疗的病症。

如本文所用对疾病或障碍的“治疗”(“treating”、“treatment”)或“疗法”意指通过施用单独的或与如本文所述的另一种化合物组合的本发明的免疫调节蛋白或工程化细胞来减慢、停止或逆转疾病或障碍的进展，如通过临床或诊断症状的减少、停止或消除所证实。“治疗”(“treating”、“treatment”或“therapy”)还意指急性或慢性疾病或病症中症状的严重性降低，或例如在复发或缓解自身免疫疾病病程的情况下复发率的降低，或在自身免疫疾病的炎性方面的情况下炎症的减少。如在本发明情况下所用的疾病或障碍的“预防(preventing)”、“预防(prophylaxis)”或“预防(prevention)”是指施用单独的或与另一化合物组合的免疫调节蛋白或表达本发明免疫调节蛋白的工程化细胞，以防止疾病或障碍或疾病或障碍的一些或所有症状出现或发作，或减少疾病或障碍发作的可能性。例如，在癌症的背景下，术语对癌症的“治疗”或“意指(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指以下中的至少一种：肿瘤生长速率的统计学上显著的下降、肿瘤生长的停止、或者肿瘤的大小、质量、代谢活性或体积的降低，如通过标准准则(例如但不限于实体肿瘤的反应评估准则(RECIST))所测量；或者无进展存活期(PFS)或总存活期(OS)的统计学上显著的增加。

术语“抗原”是指可以诱导免疫应答的分子。通常，抗原是如果由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递则能够被免疫分子(如抗体或T细胞受体)上的识别位点结合的分子。抗原可以具有一个或多个表位，其中作为抗原一部分的每个表位可以被抗体或TCR/MHC复合体的识别位点结合。在一些实施方案中，抗原能够诱导体液免疫应答或细胞免疫应答，导致激活B淋巴细胞和/或T淋巴细胞。

如本文所用，“肿瘤相关抗原”或“肿瘤特异性抗原”是指仅在癌细胞上而不在正常细胞上发现的蛋白质或其他分子。

如本文所用，“新抗原”是指免疫系统之前尚未暴露于其的抗原，如通过病毒感染、致瘤性转化、药物代谢或其他方式改变宿主抗原而产生的抗原。在特定方面，新抗原是如下抗原，其由肿瘤特异性突变基因编码或者是在肿瘤细胞中产生的新的抗原。

术语“体内”是指在哺乳动物受试者体内发生的事件。

术语“离体”是指在哺乳动物受试者的组织或细胞之上或之内发生但在所述哺乳动物受试者体外的事件。通常，所述事件是在外部环境中进行的。在特定方面，离体程序包括其中器官、细胞或组织从受试者(通常是活体)取得以用于治疗或程序并且然后返回至受试者的任何程序。

术语“体外”是指在测试系统中(如在实验室中)发生的事件。

如本文所用，试剂盒是任选地包括其他要素(如另外的试剂，以及使用其中的组合或要素的说明书)的经包装的组合。

术语“包装插页”用于指代通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

如本文所用，“制品”是制造的并且在一些情况下可以出售的产品。在一些实施方案中，该术语可指包含在包装制品中(如在容器中)的组合物。

应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含多个方面和实施方案”、“由多个方面和实施方案组成”和“基本上由多个方面和实施方案组成”。

VI.示例性实施方案

所提供的实施方案包括：

1.一种制造用于在治疗性细胞组合物中使用的T细胞的方法，其中所述T细胞表达识别靶细胞表面抗原的T细胞受体(TCR)，所述方法包括：(a)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体以产生第一T淋巴细胞群体；(b)将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生第二激活T细胞群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(c)在使用无血清培养基的封闭系统中，在将一种或多种非天然肽呈递于主要组织相容性复合体(MHC)上的抗原呈递细胞的存在下，共培养所述第二T细胞群体，以产生包含含有对所述肿瘤的突变编码肽具有反应性的内源T细胞受体的T细胞(肿瘤反应性T细胞)的第三群体，所述一种或多种非天然肽是对应于受试者的肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽；(d)在封闭系统中，将抗原呈递细胞与所述第三细胞群体中的T细胞群体分离；(e)分离后，基于在封闭系统中培养的T细胞上的上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞的群体，以产生含有所选T细胞的第四群体；并且(f)在使用无血清培养基的封闭系统中，在淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂的存在下，扩增所选细胞的第四群体，以产生用于在治疗性细胞组合物中使用的扩增的T细胞的组合物。

2.一种制造用于在治疗性细胞组合物中使用的T细胞的方法，其中所述T细胞表达识别靶细胞表面抗原的T细胞受体(TCR)，所述方法包括：(a)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体以产生第一T淋巴细胞群体；(b)将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生第二激活T细胞群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(c)在使用无血清培养基的封闭系统中，在将一种或多种非天然肽呈递于主要组织相容性复合体(MHC)上的抗原呈递细胞的存在下，共培养所述第二T细胞群体，以产生包含含有对所述肿瘤的突变编码肽具有反应性的内源T细胞受体的T细胞(肿瘤反应性T细胞)的第三细胞群体，所述一种或多种非天然肽是对应于受试者的肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽；(d)基于在封闭系统中培养的T细胞上的上调标记物，从所述第三细胞群体中选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞的群体，以产生含有所选T细胞的第四群体；并且(e)在使用无血清培养基的封闭系统中，在淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂的存在下，扩增所选细胞的第四群体，以产生用于在治疗性细胞组合物中使用的扩增的T细胞的组合物。

3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是有核细胞，如树突细胞、单核吞噬细胞、B淋巴细胞、内皮细胞或胸腺上皮细胞。

4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于患有肿瘤的受试者是自体的。

5.根据实施方案1所述的方法，其中所述T细胞对于所述患者是自体的。

6.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述T细胞获得自健康供体。

7.根据实施方案1所述的方法，其还包括体外扩增T细胞。

8.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述MHC分子是I类分子。

9.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述MHC分子是II类分子。

10.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述MHC分子是MHC I类和II类。

11.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述T细胞是CD4+细胞。

12.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述T细胞是CD8+细胞。

13.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述T细胞是CD4+细胞和CD8+细胞。

14.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述T细胞刺激剂选自以下中的一种或多种：抗CD3抗体；抗CD28抗体；或选自IL-2、IL-7、IL-15和IL-2114的重组细胞因子。

15.根据实施方案1所述的方法，其中非天然肽是对应于患者肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽。

16.根据实施方案1所述的方法，其中通过以下方式在抗原呈递细胞上表达非天然肽：合成编码非同义体细胞突变氨基酸的小基因构建体，所述非同义体细胞突变氨基酸以串联方式在每一侧侧接来自内源蛋白质的12个氨基酸；然后使用体外RNA转录进行转录以产生单独肽；并且然后转染到抗原呈递细胞中。

17.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中通过转染编码非同义体细胞突变氨基酸的在体外转录的合成小基因构建体在抗原呈递细胞上表达非天然肽，任选地其中所述突变氨基酸以串联方式在每一侧侧接来自内源蛋白质的12个氨基酸，其中所转录的小基因构建体产生单独肽。

18.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中通过将与非同义体细胞突变相关的肽库肽脉冲(任选地通过电穿孔)到所述抗原呈递细胞中，在有核细胞上表达非天然肽。任选地，其中所述肽库的每种肽是长度为12个氨基酸的肽。

19.根据实施方案1所述的方法，其中通过将由与非同义体细胞突变相关的12种长肽组成的肽库电穿孔到所述抗原呈递细胞中，在有核细胞上表达非天然肽。

20.根据实施方案14所述的方法，其中在所述肽脉冲期间，肽库与抗原呈递细胞的比率在0.001与100ug/100万个细胞之间、在0.01与100ug/100万个细胞之间、在0.1与100ug/100万个细胞之间、在1与100ug/100万个细胞之间、在10与100ug/100万个细胞之间；或者在所述肽脉冲期间，单独肽与抗原呈递细胞的比率在0.001与100ug/100万个细胞之间、在0.01与100ug/100万个细胞之间、在0.1与100ug/100万个细胞之间、在1与100ug/100万个细胞之间、在10与100ug/100万个细胞之间。

21.根据实施方案14所述的方法，其中用于所述肽脉冲的肽库的浓度在为或约0.01μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约0.1μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约1μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约0.01μg/mL与为或约10μg/mL之间、或者为或约1μg/mL与为或约10μg/mL之间；或者用于所述肽脉冲的单独肽的浓度在为或约0.0001μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约0.001μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约0.01μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约0.1μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约1μg/mL与为或约40μg/mL之间、为或约0.01μg/mL与为或约10μg/mL之间、或者为或约1μg/mL与为或约10μg/mL之间。

22.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中非天然肽源自内体或溶酶体蛋白。

23.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中非天然肽衍生自胞质蛋白。

24.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中抗原呈递细胞与T细胞的共培养物比率在20:1与1:1之间、在15:1与1:1之间、在10:1与1:1之间、在5:1与1:1之间、在2.5:1与1:1之间、在1:20与1:1之间、在1:15与1:1之间、在1:10与1:1之间、在1:5与1:1之间、或在1:2.5与1:1之间。

25.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中抗原呈递细胞的分离使用磁分离、重力分离、选择性结合、或使用流式细胞术的细胞分选。

26.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中在使用无血清培养基的封闭系统中，使用基于荧光的细胞分选仪进行选择。

27.根据实施方案21所述的方法，其中使用基于荧光的一次性流体细胞分选仪以10,000与100,000个细胞/秒之间的速率进行所述选择。

28.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中上调标记物是所述T细胞的表面表达的蛋白质，其仅当T细胞内源TCR识别由所述APC表达的肽时才表达。

29.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中从富集淋巴细胞群体到产生扩增的T细胞的时间少于30天。

30.根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中扩增的细胞的组合物用于治疗癌症患者。

31.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述封闭系统在袋系统中。

32.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞群体来自肿瘤浸润性淋巴细胞、淋巴的淋巴细胞或外周血单核细胞。

33.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞群体来自切除的肿瘤，任选地来自切除的肿瘤的肿瘤碎片。

34.通过根据实施方案1-28中任一项所述的方法产生的T细胞群体，其中所述T细胞群体表达大于或等于1种T细胞表面受体，所述大于或等于1种T细胞表面受体识别表达非同义突变的靶细胞上的大于或等于1种特异性抗原。

35.表达大于或等于1种T细胞表面受体的T细胞的群体，所述大于或等于1种T细胞表面受体识别表达非同义突变的靶细胞上的大于或等于1种特异性抗原；(a)富集从供体受试者获得的淋巴细胞群体以产生第一T淋巴细胞群体；(b)将所述第一群体用淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂刺激以产生第二激活T细胞群体，其中在使用无血清培养基的封闭系统中进行所述刺激；(c)在使用无血清培养基的封闭系统中，在将一种或多种非天然肽呈递于主要组织相容性复合体(MHC)上的抗原呈递细胞的存在下，共培养所述第二T细胞群体，以产生包含含有对所述肿瘤的突变编码肽具有反应性的内源T细胞受体的T细胞(肿瘤反应性T细胞)的第三细胞群体，所述一种或多种非天然肽是对应于受试者的肿瘤中相关的非同义体细胞突变的肽；(d)在封闭系统中，将抗原呈递细胞与所述第三细胞群体中的T细胞分离；(e)分离后，基于在封闭系统中培养的T细胞上的上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的内源TCR的T细胞，以产生含有所选细胞的第四群体；并且(f)在使用无血清培养基的封闭系统中，在淋巴细胞的一种或多种T细胞刺激剂的存在下，扩增所选细胞的第四群体。

36.根据实施方案30所述的群体，其中所述细胞表面标记物是TCR。

37.根据实施方案30所述的群体，其中所述靶细胞是癌细胞。

38.根据实施方案31所述的群体，其中所述癌细胞是上皮恶性肿瘤。

39.根据实施方案30-32中任一项所述的群体，其中所述抗原是新抗原。

40.根据实施方案30-33中任一项所述的群体，其中从富集淋巴细胞群体到产生扩增的T细胞的时间少于30天。

41.根据实施方案30-34中任一项所述的群体，其中所述T细胞用于治疗癌症患者。

42.一种药物组合物，其包含通过根据实施方案1-29中任一项所述的方法产生的T细胞的治疗性组合物。

43.根据实施方案36所述的药物组合物，其包含治疗剂量的T细胞。

44.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗剂量的根据实施方案36或实施方案37所述的药物组合物。

45.根据实施方案38所述的方法，其中所述治疗有效剂量在1x10⁹与10x10⁹个T细胞之间。

46.根据实施方案38所述的方法，其中所述治疗有效剂量是每公斤体重大于100万至小于1亿个T细胞。

47.根据实施方案38所述的方法，其中所述治疗有效剂量是每公斤体重大于100万至小于1千万个T细胞。

48.根据实施方案38所述的方法，其中所述治疗有效剂量是每公斤体重为或约1000万至为或约5000万个T细胞。

49.一种制造T细胞的方法，其包括：(a)获得淋巴细胞；(b)在使用无血清培养基的封闭系统中，刺激淋巴细胞群体以产生激活T细胞群体；(c)在呈递一种或多种MHC相关的所呈递非天然肽的抗原呈递细胞的存在下，共培养T细胞；(d)在封闭系统中，将抗原呈递细胞与T细胞分离；(e)基于在使用无血清培养基的封闭系统中在呈递肽的有核细胞的存在下培养的T细胞上的上调标记物，选择含有对所述APC上呈递的肽具有反应性的细胞表面受体的T细胞；并且(f)在使用无血清培养基的封闭系统中，在细胞因子的存在下，扩增所选细胞。

50.根据实施方案43所述的方法，其中所述细胞表面受体是对突变编码肽具有反应性的一组新型内源T细胞受体。

51.根据实施方案36所述的药物组合物，其中所述细胞表面受体是T细胞受体(TCR)。

52.根据实施方案36所述的药物组合物，其中所述TCR是对与患者肿瘤相关的独特体细胞突变组具有反应性的一组新型内源TCR。

VII.实施例

以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并不意图限制本发明的范围。

实施例1对肿瘤处理方法在获得肿瘤来源的T细胞群体中的评估

将来自结直肠癌(CRC)或黑色素瘤患者的肿瘤按如下所述进行处理，并分析所得浸润性T细胞群体的细胞计数活力。

A.结直肠癌

肿瘤来源于结直肠癌患者的原发性肿瘤，并在4℃下在HypoThermosol中运送过夜。肿瘤被处理为碎片或单细胞悬浮液(SCS)培养物。

对于碎片培养，将肿瘤切碎成直径为1-8mm的碎片，并将每个1-8mm的碎片放入在含有5％人血清的洛斯维帕克纪念研究所培养基(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)或无血清OpTmizer培养基(ThermoFisher)的存在下的培养器皿(透气性24孔培养板或常规6孔板)孔中。培养基补充有300或6000IU/mL重组IL-2，并且还含有10μg/ml的庆大霉素，根据制造商的建议在2％与5％之间的免疫细胞血清替代品(ThermoFisher)，以及终浓度为2.0mM的谷氨酰胺的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽形式(GlutaMAX Supplement；Thermofisher)。维持碎片培养物并进行肉眼监测，直到在培养的大约第5天和第11天之间进行细胞计数。

对于SCS培养，也将肿瘤切碎成直径为1-8mm的碎片。然后在存在或不存在消化肿瘤的酶的情况下使用Miltenyi GentleMACS在封闭系统中将碎片匀浆化，所述酶是根据制造商推荐使用的来自Miltenyi Tumor Dissociation Kit,human(货号130-095-929)的酶混合物、胶原酶I/II共混物(Nordmark,Collagenase NB 4G Proved Grade，货号：S1746503)或胶原酶IV(Worthington Biomedical货号：LS004130)(1mg/ml或5mg/ml)。将指定用于SCS的采用匀浆化和酶消化的碎片与酶混合物或胶原酶孵育总计60分钟。在产生SCS后，立即在NC-200自动细胞计数器(ChemoMetec)上进行细胞计数和活力评估。

如图3A所示，与从CRC肿瘤碎片培养后获得的总活细胞相比，采用或不采用酶消化的SCS培养物产生的总活细胞(TVC)更多。图3B描绘了在酶的存在下通过匀浆化产生的碎片或SCS所产生的培养物中活细胞的百分比是相似的。

B.黑色素瘤

肿瘤来源于黑色素瘤患者的原发性肿瘤，并在4℃下在HypoThermosol中运送过夜。与上文描述的类似方式培养细胞。

简而言之，对于碎片培养，将肿瘤切碎成直径为1-8mm的碎片，并将每个1-8mm的碎片在含有5％人血清的RPMI或无血清OpTmizer培养基(补充有浓度为300IU/ml或6000IU/ml的重组IL-2)的存在下在透气性24孔培养板或常规6孔板的孔中培养。培养基还含有10μg/ml的庆大霉素和终浓度为2.0mM谷氨酰胺的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽形式(GlutaMAXSupplement；Thermofisher)。维持碎片培养物并进行肉眼监测，直到在培养的第5天和第9天之间进行细胞计数。

为了产生SCS培养物，在存在或不存在酶的情况下使用Miltenyi GentleMACS匀浆化肿瘤碎片，所述酶包括浓度为1mg/mL或5mg/mL的胶原酶IV或浓度为1mg/mL或5mg/mL的胶原酶I/II共混物(Nordmark，Collagenase NB 4G Proved Grade，货号：S1746503)。如上，在使用NC-200自动细胞计数器(Chemometec)生成SCS后立即进行细胞计数和活力评估。

图4A描绘了与通过匀浆化和酶解离产生的SCS相比，由黑色素瘤肿瘤碎片产生的培养物产生更多的总活细胞。如图4B所示，无论酶促匀浆化如何，碎片培养物的活细胞百分比也高于SCS培养物中的细胞。

实施例2评估肿瘤来源的细胞的T细胞扩增动力学

如实施例1中所述处理肿瘤以产生直径为1-8mm的碎片或SCS培养物，然后将其在扩增存在于肿瘤中的T细胞群体的条件下孵育。如下文所述，在重组IL-2的存在下，在各种测试条件下使培养物生长以评估细胞扩增。测试的条件包括培养板类型、培养基和IL-2浓度对细胞扩增的影响。

A.培养条件

如实施例1所述，将通过匀浆化和酶消化来自患有CRC或黑色素瘤的供体患者的原发性肿瘤获得的单细胞悬浮液(SCS)在常规6孔板或透气性24孔培养板中培养。在可能的情况下，起始化并平均化来自每名供体的多个条件(误差条代表±标准差)。对于6孔板，将细胞以250,000与1,000,000个细胞/mL之间进行接种，而对于透气性24孔板，将细胞以5,000与750,000个细胞/mL之间进行接种。在这两种情况下，将细胞接种在含有5％人血清的RPMI或无血清OpTmizer培养基中，所述培养基补充有浓度为300IU/mL或6000IU/mL IL-2的重组IL-2。培养基还含有10μg/ml的庆大霉素和终浓度为2.0mM谷氨酰胺的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽形式(GlutaMAX Supplement；Thermofisher)。将细胞孵育多至31天，通常为14至21天，其中从培养的第5天开始每隔一天更换50％的细胞培养基。

为了从肿瘤碎片进行扩增，将如实施例1所述从患有CRC或黑色素瘤的供体患者的原发性肿瘤中获得的单独1-8mm肿瘤碎片置于透气性24孔培养板或6孔板的孔中，并在含有5％人血清的RPMI或无血清OpTmizer培养基中培养，所述培养基补充有浓度为300IU/mL或6000IU/mL的重组IL-2。培养基还含有10μg/ml的庆大霉素和终浓度为2.0mM谷氨酰胺的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽形式(GlutaMAX Supplement；Thermofisher)。将细胞孵育多至31天，如通常为14至21天，其中从培养的第5天开始每隔一天更换50％的细胞培养基。

对于所有情况，使用NC-200自动细胞计数器(Chemometec)大约每隔一天进行一次细胞计数，并收集样品用于荧光激活细胞分选(FACS)。扩增阶段完成后(例如第14-31天)，将细胞在PBS中洗涤，然后在低温保护剂的存在下低温保存。使用CoolCell装置(Corning)或VIA Freeze(GE Healthcare)进行低温保存。

B.结果

1.生长曲线

在不同的培养器皿中扩增培养后，从CRC供体患者的肿瘤碎片中获得的SCS的扩增的生长曲线示于图5A和5B中。显示的结果来自与浓度为300IU/mL或6000IU/mL的重组IL-2一起并在任一种培养基类型中孵育的培养物，但基于起始细胞的来源分开。如所示，在这些条件下，可以从来自CRC供体肿瘤的SCS扩增肿瘤来源的细胞。在一些供体中，在直接从CRC肿瘤中获得的细胞的初始扩增阶段中观察到大于2倍甚至高达10倍或更多的扩增。

与来自CRC肿瘤活检产物的肿瘤碎片相比，评估了从SCS实现的扩增。如图5C和5D所示，无论是作为碎片还是作为SCS提取和培养，都可以在这些条件下扩增来自CRC肿瘤的细胞。然而，总体上，在提取为SCS的CRC培养物中实现了更高的扩增，如与培养通过碎片提取的细胞相比，更高的总细胞数(图5C)和扩增倍数(图5D)所证明的。

在不同培养器皿中扩增培养后，来自不同黑色素瘤供体的作为提取的肿瘤碎片或作为来自肿瘤碎片的SCS培养的细胞的扩增生长曲线示于图6A和6B中。显示的结果来自与浓度为300IU/mL或6000IU/mL的重组IL-2一起并在任一种培养基类型中孵育的培养物，但基于起始细胞的来源分开。如所示，在任一培养器皿中在提取为肿瘤碎片的黑色素瘤培养物中观察到大量扩增，而在作为SCS培养的黑色素瘤细胞中观察到较少的扩增。

与之前的观察结果一致，无论肿瘤类型如何，来自某些供体的肿瘤细胞均不适合扩增，这表明在供体之间以及另外在同一供体肿瘤的肿瘤碎片之间扩增潜力存在固有的可变性。在培养期间汇集来自供体患者的肿瘤碎片的更大规模的方法有望通过组合来自同一供体肿瘤的肿瘤碎片来减轻肿瘤内的可变性。

2.根据细胞培养基的生长评估

将如上所述在含有5％人血清的RPMI培养基或含血清替代配制品培养基(OpTmizer培养基)中产生的经扩增的培养物在扩增14与21天之间后进行比较。显示的结果来自与浓度为300IU/mL或6000IU/mL的重组IL-2一起并在任一类型培养器皿中孵育的培养物，但基于培养基类型分开。CRC肿瘤的结果来自从肿瘤碎片获得的SCS的培养物(图7A和7B)，而来自黑色素瘤肿瘤的结果来自肿瘤碎片的培养物(图8A和8B)。

对于两种肿瘤类型，通过在5％人血清或血清替代培养基中培养两种肿瘤类型，观察到增加的总细胞数(图7A和图8A)和扩增倍数(图7B和图8B)。在测试的样品中，使用OpTmizer培养基具有改进扩增的趋势，如初始扩增阶段结束时更高的总细胞数所证明的(图7A和图8A)。

3.IL-2浓度

比较了不同IL-2浓度在不同肿瘤类型的扩增期间的作用。将培养物如上文所述在含有5％人血清的RPMI培养基或含血清替代配制品培养基(OpTmizer培养基)中在300IU/mL或6000IU/mL重组IL-2中扩增14与21天之间。显示的结果来自在任一培养基类型的存在下以及在任一类型培养器皿中孵育的培养物，但基于IL-2浓度分开。CRC肿瘤的结果来自从肿瘤碎片获得的SCS的培养物(图9A和9B)，而来自黑色素瘤肿瘤的结果来自肿瘤碎片的培养物(图10A和10B)。

对于两种肿瘤类型，结果显示在高浓度或低浓度IL-2中生长的细胞的扩增相似，如扩增后相似的总细胞数(图9A和图10A)以及扩增倍数(图9B和图10B)所证明的。这些数据支持如下观察结果：约300IU/mL剂量的IL-2支持扩增，并且高剂量如6000IU/mL的IL-2对于CRC或黑色素瘤培养物的细胞扩增不是必需的。

总之，结果显示，虽然扩增可以是供体依赖性的，而且是肿瘤样品依赖性的，但在多个供体中，来自SCS培养物的CRC肿瘤浸润性T细胞和来自碎片培养物的黑色素瘤浸润性T细胞成功生长。类似地观察到，对于黑色素瘤和CRC来源的T细胞培养物，在与较低剂量相比时，添加高浓度IL-2不会导致明显不同的扩增响应。

实施例3抗CD3刺激对肿瘤来源的细胞的扩增影响的评估

在存在或不存在50ng/mL OKT3(人抗CD3单克隆抗体)的情况下培养如实施例1和2中所述的从黑色素瘤肿瘤碎片处理而来的细胞。细胞培养在具有RPMI或OpTmizer培养基的常规6孔板或透气性培养板中进行至14与31天之间。培养物还补充有300或6000IU/mL重组IL-2、10μg/mL庆大霉素和终浓度为2.0mM的谷氨酰胺的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽形式(GlutaMAX Supplement；Thermofisher)。如前所述，从培养的第5天开始，每隔一天更换约50％的细胞培养基。然后使用NC-200自动细胞计数器(Chemometec)对细胞进行计数。

显示的结果来自与浓度为300IU/mL或6000IU/mL的重组IL-2一起在不同的培养基中并在任一类型培养器皿中孵育的培养物，但基于抗CD3刺激的存在或不存在分开。对来自供体6的细胞在存在或不存在抗CD3刺激的情况下进行了测试，并在所有条件下均展现出2-4倍扩增，其中在补充有300IU/mL IL-2的OpTmizer培养基中在不存在抗CD3刺激(-OKT3)的情况下孵育观察到了13倍扩增。图11A-11B中显示的结果证明经由OKT3进行的CD3刺激支持T细胞扩增，但基本上不影响总细胞数(图11A)或扩增倍数(图11B)。这些数据与以下发现一致，即抗CD3刺激(例如经由OKT3)可能不是扩增来自肿瘤培养物的细胞所必需的。

实施例4刺激后CD4+和CD8+激活标记物的评估

来自三名健康供体的T细胞被解冻，在补充有300IU/mL重组IL-2的OpTmizer培养基中静置过夜，然后使用50ng/mL OKT3(人抗CD3单克隆抗体)激活。使用流式细胞术经3-48小时的时间历程测量CD4+和CD8+细胞群体上的特异性激活标记物。具体而言，评估了以下标记物：CD38和CD39(图12A和图13A)、CD134和CD137(图12B和图13B)、以及CD69和CD90(图12C和图13C)。

CD8细胞表面上的激活标记物的表达结果示于图12A-12C中，展现了与不存在OKT3情况下的培养相比，在用OKT3刺激后48小时内CD8+T细胞上的标记物的上调动力学。在一些情况下，在刺激前第0天可以看到一些基底水平的标记物。如所示，在此时间历程期间，所有评估的标记物都在一定程度上上调，在该研究期间，对于标记物CD38(图12A)、CD134(图12B)和CD69(图12C)最高百分比的细胞上调。

CD4细胞表面上的激活标记物的表达结果示于图13A-13C中，展现了与不存在OKT3情况下的培养相比，在用OKT3刺激后最初48小时内CD4+T细胞上的标记物的上调动力学。如所示，在此时间历程期间，所有评估的标记物都在一定程度上上调，在该研究期间，对于标记物CD38(图13A)、CD137(图13B)和CD69(图13C)最高百分比的细胞上调。

总之，这些数据支持可以将上述标记物的表达用作上调标记物以选择已激活的T细胞，包括在如下激活条件下：预期所述激活条件刺激经由TCR-CD3复合物的信号传导，如与呈递新抗原肽的抗原呈递细胞共培养后发生的。

实施例5供体细胞表型和细胞活力的测定

如实施例1所述，T细胞来源于黑色素瘤或CRC患者的原发性肿瘤。如实施例1中所述，将来自肿瘤的细胞作为肿瘤碎片或作为SCS提取，然后通过流式细胞术评估T细胞表型。

对于肿瘤碎片，将每个1-8mm碎片放入培养器皿(透气性24孔培养板或常规6孔板)的孔中，并在含有5％人血清的RPMI或无血清OpTmizer培养基的存在下孵育5与11天之间。培养基补充有300或6000IU/mL重组IL-2，并且还含有10μg/ml的庆大霉素以及终浓度为2.0mM的谷氨酰胺的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽形式(GlutaMAX Supplement；Thermofisher)。还在具有或不具有50ng/mL抗CD3抗体OKT3的情况下进行孵育。肉眼监测碎片培养物直到确定可以进行细胞计数(通常在培养的第5天与第9天之间)，然后对细胞进行染色并通过流式细胞术分析T细胞标记物。

可替代地，对于SCS培养物，将肿瘤切碎成直径为1-8mm的碎片，然后在存在或不存在1mg/ml或5mg/ml胶原酶IV(Worthington Biomedical货号：LS004130)或1mg/mL胶原酶NB4G Proved Grade(Nordmark Biomedicals；目录号S1746503)的情况下匀浆化。与酶孵育约90分钟后，立即对细胞进行染色并通过流式细胞术分析T细胞标记物。

门控分层设计如下：首先，记录来自总细胞事件的亲本群体的CD3+细胞的百分比，然后是来自CD3+亲本群体的活CD4+细胞的百分比，以及接下来是来自相同亲本CD3+群体的活CD8+细胞的百分比。然后基于它们各自的CD4+和CD8+亲本群体计算记忆T细胞群体(Tem)。因此，CD4/Tem是从活CD4+细胞的亲本群体确定的，而CD8/Tem是从活CD8+细胞的亲本群体确定的。因此，如图12所描绘的结果是记录的来自总细胞事件的亲本群体的CD3+细胞的百分比，它们在分层中被分选为亚群，作为分层中对应亲本群体的百分比。图14描绘了在通过匀浆化和酶消化提取来自示例性CRC供体(供体1)的肿瘤碎片后立即得到的在单细胞悬浮液中对选择的T细胞标记物呈阳性的活细胞的百分比。

比较了仅通过匀浆化(无胶原酶)或通过在用低浓度胶原酶(1mg/mL)或高浓度胶原酶(5mg/mL)消化后匀浆化而提取的SCS样品中CD3+细胞的百分比。来自第二个CRC和黑色素瘤患者的结果分别显示在图15A和图15B中。如图15A所示，结果证明在匀浆化和用低浓度胶原酶消化后，来自CRC供体的SCS中CD3+T细胞的回收增加。尽管来自黑色素瘤供体的SCS中CD3+细胞的百分比较低，但结果还证明，匀浆化和用低浓度胶原酶消化产生了最高百分比的CD3+T细胞(图15B)。综上所述，这些观察结果证明，可以获得相对高纯度的来自黑色素瘤肿瘤的SCS的细胞，并且可支持SCS是黑色素瘤来源的CD3+细胞的可行来源。

还评估了从另外的示例性CRC供体的肿瘤中提取的SCS中CD3+细胞的百分比。此外，在同一供体中，将匀浆化和消化后立即得到的SCS中的CD3+T细胞的百分比与以下进行比较：(1)在SCS用300IU/mL IL-2(低)或6000IU/mL IL-2(高)培养6天后CD3+细胞的百分比，或(2)在存在或不存在CD3刺激(OKT3)的情况下在用300IU/mL IL-2(低)或6000IU/mL(高)培养单独肿瘤碎片长达6天后CD3+细胞的百分比。如图15C所示，基线(第0天)SCS中CD3细胞的百分比大幅高于用IL-2或OKT3培养肿瘤碎片6天后获得的培养物中CD3+细胞的百分比。观察到来自两名另外的供体的肿瘤碎片培养的类似结果，其中在将CRC来源的肿瘤碎片用IL-2和/或OKT3培养11天(图15D)或9天(图15E)后获得的培养物中CD3+细胞的百分比在各种评估条件下从CRC肿瘤碎片提取肿瘤细胞时总体上也显示出低产率。这些结果与以下发现一致，即来自CRC患者肿瘤活检的SCS可能比从肿瘤碎片培养物中获得的细胞更能够提供增加数量的T细胞用于扩增。

与来自CRC患者的肿瘤碎片培养的结果形成对比，图16示出在各种条件下，如存在低(300IU/mL)或高(6000IU/mL)浓度的IL-2、存在或不存在CD3刺激(OKT3)或不同培养基，可以从黑色素瘤肿瘤碎片的培养获得高百分比的CD3+T细胞。描绘于图16中的结果是来自第0天的培养。这些结果与以下发现一致，即与从肿瘤活检的SCS中获得的细胞相比，培养来自黑色素瘤患者的肿瘤碎片可能更能够提供增加数量的T细胞用于扩增。实施例6与抗原呈递细胞共培养后肿瘤来源的T细胞激活的量化

如实施例1所述，T细胞来源于黑色素瘤或CRC患者的作为肿瘤碎片的原发性肿瘤。在补充有300IU/mL重组IL-2、10μg/ml庆大霉素、根据制造商推荐在2％与5％之间的免疫细胞血清替代品(ThermoFisher)、以及终浓度为2.0mM的谷氨酰胺的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽形式的无血清OpTmizer培养基(ThermoFisher)中培养5天后，将肿瘤来源的细胞用OpTmizer培养基洗涤，之后以300xg离心5分钟并以2x10⁶个细胞/mL悬浮。然后将细胞以10,000,000个细胞/孔接种至常规6孔培养板中。

在平行培养中，使抗原呈递树突细胞(DC)从获得自作为T细胞来源的同一患者(自体)的PBMC分化。从液氮储存中解冻从单采术供体分离的冷冻PBMC的冷冻管。将细胞在十倍体积的1X DPBS(Gibco)中解冻并计数(NucleoCounter NC200)。洗涤后，根据制造商试剂盒说明书立即将细胞用于CD14微珠阳性选择(MACS Miltenyi)。对纯化的CD14(单核细胞)细胞进行计数，将细胞重悬浮在DendriMACs(MACS Miltenyi)中，并以0.5-2x10⁶个细胞/mL的密度接种在适当的培养瓶中。将GM-CSF(100ng/mL)和IL-4(20ng/mL)添加至培养物中以促进分化为未成熟的树突细胞。单核细胞培养和分化总计5天，其中在第2天添加50％的培养基(等于培养基起始量的50％)。

通过全外显子组测序和RNA测序为每位患者自体鉴定肿瘤特异性肽的编码转录物，如Parkhurst,Maria R.,等人“Unique neoantigens ari se from somatic mutationsin patients with gastrointestinal cancers.”Cance r discovery 9.8(2019):1022-1035所述。对速冻、未固定的肿瘤组织和正常外周血细胞(正常来源)进行患者样品的全外显子组测序(WES)。使用来自novocraft(http://www.novocraft.com/)的novoalign MPI(针对human gen ome build hg19)进行来自肿瘤与正常样品的序列的比对。使用Picard的Mar kDuplicates工具标记重复。根据GATK最佳实践工作流程(https://www.broadinstitute.org/gatk/)进行插入缺失重新比对和碱基重新校准。数据清除后，使用samtools mpileup(http://samtools.sourceforge.net)和Varscan2(http://varscan.sourceforge.net)、SomaticSniper(http://gmt.genome.wustl.edu/packages/somatic-sniper/)、Strelka(https://sites.google.com/site/strelkasomaticvariantcaller/)和Mutect(https://www.broadinstitute.org/gatk/)创建pileup文件。VCF文件使用GATK CombineVariants工具合并，并使用Annovar(http://annovar.openb ioinformatics.org)进行注释。然后使用Annovar(http://annovar.openbioinfor matics.org)注释患者肿瘤中存在的变体(突变)。

使用以下过滤器生成用于评价的初始推定突变列表：(1)肿瘤和正常覆盖度大于10，(2)7％或更高的变异等位基因频率(VAF)，(3)变异读取计数为4或更高，(4)和四个调用程序中的两个鉴定到突变。对于插入和缺失，除了鉴定到突变的仅单个调用程序需要通过过滤器之外，均使用相同截止值，因为这些只被varscan和strelka调用。对于通过四个过滤器的那些变体生成了与连接到由单核苷酸变体(SNV)(Nmer)上游和下游区域编码的12个氨基酸的突变残基对应的氨基酸序列的表格。对于移码转录物，序列被翻译直到在正常编码区或3’非翻译区中产生终止密码子。然后使用允许映射比对可视化的整合基因组浏览器(IGV，Broad研究所)来进行变体调用的人工策管。当人工策管揭示在编码Nmer的转录物内存在的由另外的体细胞变体或种系变体导致的非同义改变时，对Nmer的序列作出改变。将从读段推断的含有多个错配核苷酸(插入/缺失映射至不同读段中的不同位置)的变体以及对应于频繁SNP的变体进行标记以去除。

将在多于一位患者的肿瘤中但在占总肿瘤的少于2.5％中检测到的变体进行标记，但包括在合格变体列表中。只在ENSEMBL数据库中注释的变体转录物通常代表未经验证的编码区，也被去除。标记为已知单核苷酸多态性或存在于多种肿瘤中的变体不会被自动去除，而是使用IGV进一步评价，因为去除潜在的假阳性(这不太可能编码被T细胞识别的产物)与去除可代表假阴性的候选物相比是不太重要的。

然后，使用这些测序数据产生肽库，所述肽库代表与肿瘤相关的突变肽以及与非患病外周血细胞相关的野生型肽。

合成肽是通过Fmoc化学合成的。对于插入缺失(indel)，合成25个氨基酸的肽，根据移码序列被翻译直到下一个终止密码子而重叠了10个氨基酸。在一些情况下，合成具有最小表位的肽。将肽溶解于DMSO中，并以等体积混合。

分化的DC加载有不同数量和浓度的来自如上文所述鉴定的肽库的肽，之后将它们以若干比率的肿瘤细胞:DC添加至肿瘤来源的培养物中。然后将DC和肿瘤来源的细胞在37℃、5％CO₂下共培养6小时，之后将培养物轻轻搅拌和并将悬浮液中的细胞回收。然后将回收的细胞针对激活的T细胞使用T细胞激活标记物4-1BB和OX40通过流式细胞术进行分选。

图17A和17B示出了在20至0.1ng/mL的肽范围内，肿瘤来源的T细胞的激活。如图17A所示，T细胞与DC(加载有所测试的三种肽浓度中的每一种)共培养导致可容易检测水平的4-1BB/OX40+T细胞，包括在1ng/mL肽情况下高至大约80％。图17B中示出相比于与未加载的DC一起培养的细胞，T细胞激活标记物表达增加，其中0.1ng/mL导致最大的δ，但所有三种浓度的肽均导致正倍数变化。这些数据证明，低于20ng/mL的较低肽浓度可导致共培养后T细胞激活标记物(上调标记物)的上调增加。

图16类似地描绘了在研究中随41BB/OX40表达变化的肿瘤来源的T细胞激活，其中DC用一种或两种肽脉冲以在共培养期间进行表面呈递。如在图18A和再在图18B(作为倍数变化)中所示，仅加载有一种肽的DC在共培养中在激活T细胞方面更加明显有效。

如图19所示，当肿瘤来源的T细胞与DC以1:2(T细胞:DC)比率共培养时，与1:1相比，T细胞激活标记物41BB和OX40大幅上调。

实施例7通过细胞分选来富集和回收激活的T细胞

将来自健康供体的T细胞通过基于免疫亲和力的选择来分离，然后低温保存。将T细胞解冻并静置过夜，然后用50ng/mL OKT3激活24-48小时，之后用抗CD4 FITC(BD)、抗CD8PerCPCy.5.5(BD)、抗CD134(Beckman Couleter)和抗CD137(MACs Miltenyi)染色。使细胞浓度达到大约20x10⁶个细胞/mL，并使用BD FACSAriaII以大约每秒15,000个事件的分选速率分选。在表达CD134、CD137、或CD134和CD137二者的细胞周围绘制门，并分选到单一群体中。这是阳性分选群体。缺乏CD134和CD137表达的细胞被分选到单独的群体中。这是阴性分选群体。分选后，来替代流式细胞仪上分析来自阳性和阴性分选群体和未分选群体的细胞，以验证纯度并评估回收率。

如图20所示，将未分选的肿瘤来源的T细胞群体(分选前)与如先前在实施例6中描述的在与加载有突变肽的自体树突细胞共培养后收集并分选到41BB/OX40阳性群体中的阳性分选群体进行比较。观察到，该门控策略导致三名供体的针对反应性TCR百分比的增加的富集(图20A)和增加的平均I类反应性(图20B)。

来自细胞分选的总细胞回收相对于总细胞输入显示于图21A中。类似地参见图21B，两次独立运行的回收百分比为大约80％。结果证明，在选择和分选上调标记物呈阳性的细胞后，有可能获得高细胞回收率。

图22描绘了通过用OKT3激活并如上所述染色的健康供体T细胞的流式细胞术得出的CD4+群体纯度。首先针对CD4+对细胞进行门控，然后接下来对表达最高强度CD134+的群体进行门控，并且所显示的输出示为CD4+与CD8+、以及CD137+与CD134+。这些数据支持使用这些标记物对高纯度肿瘤浸润性T细胞群体进行门控。

实施例8激活的肿瘤来源的T细胞的分选后扩增

如实施例1所述处理来源自原发性CRC肿瘤的T细胞，并且然后使用如实施例6所述的方法与呈递肽的树突细胞共培养。简而言之，将分离的肿瘤浸润性淋巴细胞与自体DC一起培养，所述DC经加载以表达与健康组织相关的肽(野生型，WT)、与肿瘤组织相关的肽(突变体)，或根本不加载肽(无肽)。在不具有DC的情况下培养T细胞的对照亚群(未激活)。共培养后，基于激活标记物4-1BB和OX40的表面表达，通过荧光启用的Sony FX500对细胞进行分选。

然后将细胞以250,000-1,000,000个细胞/cm2接种到在无血清OpTmizer培养基中的透气性24孔培养板中，所述培养基补充有浓度为300IU/mL的重组IL-2、10μg/mL的庆大霉素、以及2.0mM谷氨酰胺的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽形式(GlutaMAX Supplement；Thermofisher)。将细胞孵育总计7天，从培养第5天开始，每隔一天更换50％的培养基。在每个培养日，使用NC-200自动细胞计数器(Chemometec)进行细胞计数。

如在图23A和再在图23B(作为扩增倍数)中所示，测试的每个肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)T细胞群体在培养第3天与第5天之间经历了可测量的扩增，并在培养期的第7天结束时继续呈上升趋势。在实验历程中，与加载有突变体肿瘤相关肽的DC一起培养的肿瘤浸润性T细胞达到最高的总细胞数。

使用以上数据，创建了图23C所示的理论数学模型，以预测分选后回收的细胞数与扩增阶段后培养物中存在的预期细胞数之间的关系。

实施例9对肿瘤来源的T细胞的离体扩增的蒙特卡罗(Monte Carlo)建模

作为对实施例8中确定性点分析的补充，设计了第一次概率性蒙特卡罗模拟来预测由实施例2中所述的第一次扩增产生的肿瘤浸润性淋巴细胞的数量。提取和第一次扩增后可能的总活T细胞数和总反应性T细胞数的蒙特卡罗模拟是通过用概率分布代替具有固有不确定性的两个因素即回收效率和倍数扩增能力来运行的。结果被数万次迭代计算为正态分布，其中回收的细胞的平均值定义为低和中回收，并且扩增倍数变化的平均值定义为低、中和高扩增潜力。然后针对总活T细胞数以及总反应性T细胞计算分布。

对于最初的蒙特卡罗模拟(其中计算了第一次扩增的可能T细胞输出)，运行测试案例以模拟低回收/低扩增、中回收/低扩增、中回收/中扩增、和中回收/高扩增条件。回收和扩增变量二者的平均值和标准差的值指定如下：(1)低回收定义为从经处理的肿瘤培养总计2000万个活细胞，标准差为600万，(2)中回收定义为5000或6000万个细胞，标准差为1500万，(3)低第一扩增倍数定义为50倍，标准差为11，(4)中扩增定义为75倍，标准差为15，以及(5)高扩增定义为500倍，标准差为160。

来自第一次蒙特卡罗模拟A的每个测试案例的数据显示在下表E1中。

使用这些数据，设计第二组蒙特卡罗模拟以预测在如实施例8中所述与APC共培养、通过流式细胞术分选和第二次扩增后反应性肿瘤浸润性淋巴细胞的最终数量。从肿瘤碎片或SCS培养的总T细胞群体中存在的反应性T细胞百分比的固定值被指定为8％的平均值和2.50的标准变异。在数万次迭代计算后，来自第二次蒙特卡罗模拟的每个测试案例的数据描绘于下表E2中。

来自在肿瘤处理后第一次扩增或者来自在与APC于下游共培养后第二次扩增的肿瘤浸润性反应性T细胞的回收和扩增潜力是在供体之间和肿瘤细胞群体内固有可变的因素。通过这里描述的方法产生的T细胞数的预期范围包含在第10和第90百分位数之内。第10百分位数之下的细胞数不太可能产生，并可能不会导致可用的药物产品。因此，来自表E1和E2中的蒙特卡罗模拟的观察结果支持，在第10和第90百分位数之间的所有情境中，在给定关于扩增潜力的一个范围的可变性水平的情况下，本文所述的方法将可能提供稳健的T细胞输出，其接近于治疗给药所需的细胞数。

实施例10 实施例10：通过IFN-γ产生和TCR克隆性评估肿瘤反应性TCR富集

如实施例1所述，从肿瘤碎片处理来源自卵巢癌(样品A)、CRC(样品B)或黑色素瘤(样品C)患者的原发性肿瘤的T细胞。在初始扩增后，使用基本上如实施例6中所述的方法，将T细胞进而与呈递肽的自体树突细胞共培养6小时。对于共培养，自体DC加载有对于患者肿瘤独特的突变体单一长肽(例如25mer)或与来自患者的正常样品相比未突变的野生型单一长肽。共培养后，将肿瘤反应性T细胞通过以下方式富集：通过荧光激活细胞分选(FACS)针对4-1BB(CD137)和/或OX40(CD134)的表达对细胞进行染色并对细胞进行分选。将41BB和OX40中的任一个或二者呈阳性的细胞收集作为“阳性”群体(也称为“突变体富集”群体)，并且将41BB和OX40呈双阴性的细胞收集作为“阴性”群体(也称为“野生型未富集”群体)。

然后将突变体和野生型T细胞群体在仅培养基中或者在刺激IFN-γ分泌的条件下培养16小时。来自共培养物的尚未基于41BB和OX40表达分选的未分选未富集T细胞(大量T细胞)被包括作为选择前对照，并类似地进行刺激。收集培养上清液，并通过ELISA测定IFN-γ的分泌水平。

通过单细胞TCR测序来确定表达对肽新表位具有反应性的TCR的T细胞在所分选群体中的百分比。也通过对TCR-β和TCR-α链的单细胞RNA测序来确定在T细胞群体中的TCR克隆性。

1.样品A(卵巢癌)

将从样品A产生的突变体和野生型富集的T细胞群体或对照大量T细胞在仅培养基中培养16小时，或者通过用抗CD28和抗CD49d抗体连同来自相应患者肿瘤的对应于突变体肽(新表位)的最小肽表位(8mer)或野生型肽培养来刺激。如图24A所示，相比于仅培养基培养，在用新表位培养后，大量T细胞展现出改进的反应性，如通过增加的IFN-γ分泌所证明的。在仅培养基中刺激相比于用新表位条件刺激后，产生IFN-γ的能力在用新表位刺激的突变体富集的T细胞群体中进一步增加，但在野生型富集的T细胞群体中没有观察到差异。此外，野生型未富集的T细胞群体仍包含一定程度的新抗原反应性T细胞，如与仅培养基相比它们对IFN-γ分泌的上调所证明的。该数据表明，共培养后的大量T细胞含有新抗原反应性群体，所述新抗原反应性群体通过基于41BB和OX40的表达进行分选而富集。此外，结果还证明了新抗原富集的特异性。

通过RNA测序和流式细胞术对新表位特异性TCR的分析显示，在突变体富集的T细胞群体中，TCR“A”新抗原特异性TCR富集了17％新抗原特异性TCR，相比之下，在初始大量T细胞群体中为2％或在野生型富集的T细胞群体中为0.1％(图24B)。与选择的群体(突变体富集的T细胞群体)相比，未选择的群体(野生型富集的T细胞群体)中T细胞的TCR克隆性示于图24C中，此图示出未分选的T细胞群体中引进的TCR多样性较高，而在选择的群体中实现了独特TCR克隆的富集。图24D展现出分选前(大量)和分选后细胞群体含有CD4和CD8细胞，表明富集群体中存在I类和II类反应性细胞，

2.样品B(CRC患者)

将从样品B肿瘤细胞产生的突变体和野生型富集的T细胞群体或对照大量T细胞在仅培养基中培养16小时，或响应于使用抗CD3抗体(OKT3)的一般TCR刺激进行刺激。如图25A所示，在响应于一般TCR刺激的共培养和分选后，所有T细胞群体都显示出功能性(即IFNg产生)。

对新表位特异性TCR的分析显示，在突变体富集的T细胞群体中，新抗原“B”特异性TCR富集了71％新抗原特异性TCR，相比之下，在初始大量T细胞群体中为42％或在野生型富集的T细胞群体中为17％(图25B)。与共培养后的大量T细胞相比，这代表分选的T细胞群体中肿瘤反应性T细胞大约1.7倍的富集，并且在未分选的T细胞群体中肿瘤反应性T细胞减少大约2.5倍。与选择的群体(突变体富集的T细胞群体)相比，未选择的群体(野生型富集的T细胞群体)中T细胞的TCR克隆性示于图25C中，此图示出未分选的T细胞群体中引进的TCR多样性较高(807种独特TCR克隆)，而在选择的群体中实现了独特TCR克隆的富集(64种独特TCR克隆)。图25D展现出分选前(大量)和分选后细胞群体含有CD4和CD8细胞，表明富集群体中存在I类和II类反应性细胞。

3.样品C(黑色素瘤患者)

通过RNA测序和流式细胞术和TCR克隆性，针对新表位特异性TCR评估了从样品C肿瘤细胞产生的突变体和野生型富集的T细胞群体中的T细胞或对照大量T细胞。结果显示，在突变体富集的T细胞群体中，新抗原“C”特异性TCR富集了33％新抗原特异性TCR，相比之下，在初始大量T细胞群体中为5％或在野生型富集的T细胞群体中为4％(图26A)。与共培养后的大量T细胞相比，这代表分选的T细胞群体中肿瘤反应性T细胞大约7倍的富集，并且在未分选的T细胞群体中肿瘤反应性T细胞无富集。与选择的群体(突变体富集的T细胞群体)相比，未选择的群体(野生型富集的T细胞群体)中T细胞的TCR克隆性示于图26B中，此图示出未分选的T细胞群体中引进的TCR多样性较高(182种独特TCR克隆)，而在选择的群体中实现了独特TCR克隆的富集(15种独特TCR克隆)。图26C展现出分选前(大量)和分选后细胞群体含有CD4和CD8细胞，表明富集群体中存在I类和II类反应性细胞。

4.结论

总之，结果显示引进的TCR多样性在未分选的T细胞群体中较高(例如100-900种TCR)。这种未分选的群体产生低水平的IFNγ(例如5-25pg/mL)。基于激活标记物(例如OX40/41BB)对TCR群体进行分选后，TCR群体富集在TCR的反应性群体(例如15-64种TCR)中，其产生的IFNγ(例如65.3-98.6pg/mL)高于未分选和阴性分选的TCR群体产生的IFNγ(5pg/mL)。结果表明，这是与肿瘤反应性T细胞的富集一致的特异性激活，因为它在野生型、未分选的共培养物中没有观察到。

本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。

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