基于甘油酯的脂质纳米颗粒制剂及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 基于甘油酯的脂质纳米颗粒制剂及其制备方法和应用 (Lipid nanoparticle preparation based on glyceride, and preparation method and application thereof ) 是由 韩悌云 徐实 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于甘油酯的脂质纳米颗粒制剂及其制备方法和应用。一种脂质纳米颗粒制剂,包含由本发明所述的无荷载纳米脂质包封至少一种核酸分子形成的脂质纳米颗粒。所述的无荷载纳米脂质选自以下任意一种：1)由阳离子脂质和甘油酯组成；且阳离子脂质:甘油酯摩尔比为1:10–10:1；2)由阳离子脂质:甘油酯：胆固醇组成,且阳离子脂质:甘油酯摩尔比范围为4-7:1-3,阳离子脂质：胆固醇摩尔比范围为1-2:2-1。较之现有技术,本发明可显著提高体内mRNA的表达水平和靶向能力,从而产生更有效的免疫治疗效果。(The invention discloses a lipid nanoparticle preparation based on glyceride, a preparation method and application thereof. A lipid nanoparticle formulation comprising a lipid nanoparticle formed from an unloaded nano-lipid according to the invention encapsulating at least one nucleic acid molecule. The non-loaded nano-lipid is selected from any one of the following substances: 1) consists of cationic lipid and glyceride; and the molar ratio of the cationic lipid to the glyceride is 1:10-10: 1; 2) from cationic lipids glyceride: cholesterol, and the molar ratio of the cationic lipid to the glyceride is 4-7:1-3, the ratio of the cationic lipid to the glyceride is: the molar ratio of cholesterol is 1-2: 2-1. Compared with the prior art, the invention can obviously improve the expression level and the targeting capability of mRNA in vivo, thereby generating more effective immunotherapy effect.)
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及基于甘油酯的脂质纳米颗粒制剂及其制备方法和应用。
背景技术
疫苗通常有能够被免疫系统识别的抗原构成，且常与能够加强免疫的佐剂搭配使用。通常疫苗分为两大类，即预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要用于预防疾病而产生的针对病原体的抗体和免疫细胞。与之相对应的治疗性疫苗，则用于发病后的治疗，其能够在短时间内产生杀伤病原体的免疫细胞，如CD4+和CD8+T淋巴细胞，以及由B淋巴细胞所产生的中和抗体。治疗性疫苗在治疗包括肿瘤和传染性疾病等危及生命的疾病中发挥着重要的作用，故而具有重大的应用价值。
前期所开展的疫苗研发，常采用蛋白质多肽和DNA质粒作为抗原使用(Kantoff，Higano et al.2010,Melero,Gaudernack et al.2014)。蛋白质和多肽类等抗原相对容易制备，且可实现大规模的生产，但是抗原肽的选择主要取决于患者特有的主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)的类型，因此需要针对个体患者定制特殊的蛋白质或多肽来与之匹配。此外，DNA疫苗由于存在与宿主基因组之间高度重组的风险，且会导致较为严重的免疫排斥反应而限制了其应用空间(McNamara,Nair etal.2015)。
与之相应的，mRNA分子由于其特有的功能特征而作为治疗性疫苗的理想抗原，近年来受到越来越广泛的关注(Sullenger and Nair 2016)。而且，mRNA分子在遗传病、肿瘤免疫治疗和干细胞生物研究领域同样具有广泛的用途(Warren,Manos et al.2010)。相交于DNA而言，mRNA具有多个优点：
1)mRNA不包含严重干扰细胞生理的病毒类启动子(如CMV,SV40)或类似的启动子序列，mRNA不包含会导致毒副作用的细菌来源序列；
2)mRNA不参与宿主基因组的整合，从而消除了有害突变所致的不良影响，如致癌(Wurtele,Little et al.2003)
3)mRNA在细胞内可直接翻译为蛋白质，无需入细胞核行转录过程，因此会更快更安全的发挥作用；
4)mRNA由于不涉及入细胞核，因此有助于提高在非分裂细胞中的转染效率(Kallen and Thess 2014)
研究证实，mRNA由于其骨架由磷酸基团构成，磷酸基团带负电，故而mRNA分子呈电负性，而细胞膜由磷脂双分子层构成，同样呈现电负性，导致mRNA无法直接穿透细胞膜，进入抗原递呈细胞内。申请人前期申请的CN202011401158.1中公开了DOTAP可与DOPE或胆固醇(Cholesterol，简写Chol)组合，形成脂质纳米粒子用于介导mRNA的递送。进一步，DOTAP通过一定的摩尔比例同时与DOPE和Chol组合，形成三组分的脂质纳米粒子，可有效介导体内mRNA的递送和表达。同时，对于由DOTAP介导的双组分脂质纳米粒子难以转染的细胞如DC2.4，三组分的脂质纳米粒子则具有更好的转染效果。此外，体内实验证实由DOTAP介导的三组分脂质纳米粒子，在与RNA以一定的摩尔比例组合时，可实现在指定的靶器官(如脾脏)或细胞中进行选择性表达并同时避免在非靶器官中表达。然而，研究发现体外实验如转染DC2.4细胞，体内实验如静脉给药至指定的靶器官，DOTAP介导的纳米脂质所递送的mRNA其表达水平和强度总体稍弱。因此在上述研究的基础上，我们断定通过优化与DOTAP组合的其他组分，可改善mRNA在体外和体内的递送效果。同时通过优化与之相匹配的缓冲体系，可实现该体系在临床前和临床上的推广应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供基于无荷载纳米脂质及其应用。
本发明的另一目的是提供一种脂质纳米颗粒制剂。
本发明的又一目的是提供该脂质纳米颗粒制剂的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种无荷载纳米脂质，所述的无荷载纳米脂质选自以下任意一种：
1)由阳离子脂质和甘油酯组成；且阳离子脂质:甘油酯摩尔比为1:10-10:1；
2)由阳离子脂质:甘油酯：胆固醇组成，且阳离子脂质:甘油酯的摩尔比范围为4-7:1-3，阳离子脂质：胆固醇的摩尔比范围为1-2:2-1；
其中，所述的甘油酯中甘油主链上至少需确保一个羟基的存在。
在上述第二种技术方案中，无荷载纳米脂质由阳离子脂质:甘油酯：胆固醇组成，且阳离子脂质:甘油酯的摩尔比范围为1:0.14-1：0.75，阳离子脂质：胆固醇的摩尔比范围为:1:0.5-1:2。
作为本发明的一种优选，所述的阳离子脂质选自DOTAP，DMTAP,DSTAP，DOSPA,DODAB，DOTMA中至少一种，优选DOTAP。
作为本发明的一种优选，所述的甘油酯选自单脂肪酸甘油酯或双脂肪酸甘油酯；优选碳链长度为C14-C18的单脂肪酸甘油酯或双脂肪酸甘油酯。
作为本发明的进一步优选，所述的甘油酯选自单油酸甘油酯(CAS:111-03-5)、二油酸甘油酯(CAS:25637-84-7)、单亚油酸甘油酯(CAS:2277-28-3)、二亚油酸甘油酯(CAS:30606-27-0)、单硬脂酸甘油酯(CAS:123-94-4)、二硬脂酸甘油酯(CAS:51063-97-9)、棕榈酸甘油酯(CAS:542-44-9)和肉豆蔻酸甘油酯(CAS:589-68-4)，其中的任意一种。
本发明所述的无荷载纳米脂质在制备包封多核苷酸的脂质纳米颗粒制剂中的应用。
一种脂质纳米颗粒制剂，包含由本发明所述的无荷载纳米脂质包封至少一种核酸分子形成的脂质纳米颗粒。
作为本发明的一种优选，所述的核酸分子选自DNA、RNA、质粒中的任意一种；优选RNA，进一步优选mRNA。本发明所述的脂质纳米颗粒制剂，可包装不同长度的RNA，可实现对长度为15000nt以内的RNA有效递送。所述的核酸分子为编码抗原的核酸分子，所述抗原对一种或多种哺乳动物肿瘤细胞或病原体具有特异性。
作为本发明的一种优选，所述的核酸分子与无载荷纳米脂质的质量比为1:0.5～5，优选1:0.5-3。
作为本发明的进一步优选，所述脂质纳米颗粒中正电荷(无荷载纳米脂质)与负电荷(mRNA)的电荷比范围为3:1-1:3，优选为(0.8-1):1。
作为本发明的进一步优选，所述的脂质纳米颗粒制剂还包含Opti-MEM或终浓度为140-160mM的NaCl溶液作为缓冲液。上述无荷载纳米脂质所介导的mRNA体外递送可选用Opti-MEM或终浓度为150mM的NaCl溶液作为转染用缓冲液，由其所介导的mRNA体内递送可选用150mM的NaCl溶液作为缓冲液。
本发明所述的脂质纳米颗粒制剂的制备方法，包含以下步骤：
1)制备本发明所述的无荷载纳米脂质；
2)将所述的无荷载纳米脂质与Opti-MEM或140-160mM NaCl溶液混合，室温静置，促使无荷载纳米脂质在室温下进入稳定状态；将核酸加入到对应的溶液中混匀；然后将含有核酸的溶液与含有无荷载纳米脂质的溶液混匀，室温静置，确保mRNA被纳米脂质所包装，形成所述的脂质纳米颗粒制剂。
作为本发明的一种优选，所述的无荷载纳米脂质的制备方法，包含以下步骤：
1)分别配制浓度为10mg/ml的DOTAP、甘油酯和胆固醇溶液，溶剂选自氯仿、甲醇或乙醇中的任意一种；
2)按照摩尔比混合DOTAP溶液和甘油酯溶液得双组份的混合液，或者按照摩尔比混合DOTAP溶液、甘油酯溶液和胆固醇溶液得三组份的混合液；37-58℃负压旋蒸1-4h，获得薄膜样材料；
3)向薄膜样材料中加入指定体积的DEPC水使其最终浓度为1mg/ml的质量浓度，水浴超声溶解1-2h，获得悬浮物，4℃过夜放置提高混合组分的溶解性和稳定性，次日进一步水浴超声1-2h，提高混合组分的溶解度。
4)按照0.45um、0.22um和0.1um孔径抽滤的顺序，逐次抽滤混合组分，每一孔径抽滤三次，得所述的无荷载纳米脂质。
本发明所述的脂质纳米颗粒制剂在制备预防性或治疗性疫苗中的应用。
一种药物组合物，包含本发明所述的脂质纳米制剂。
作为本发明的一种优选，所述的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体、缓冲液、稀释剂、介质或赋形剂混合，或与一种或多种表面活性剂、脂质体、类脂质体、磷脂、外泌体或由细胞自身产生的其他类型的囊泡混合。
作为本发明的一种优选，所述的药物组合物包含治疗剂、化疗剂、佐剂或另外不同的mRNA疫苗中的任意一种或多种。
在某些实施方案中，所公开的荷载mRNA的脂质纳米颗粒可以被改变配置为治疗性试剂盒的一部分，所述治疗性试剂盒包括所述的纳米脂质以及关于将所述纳米脂质施用于有需要的哺乳动物的至少一套说明书。
该方法可以进一步任选包括想所述动物施用治疗有效量的放射或另外的化学治疗剂的步骤，以单次施用，或在一天或多天的时期内、在一周或多周的时期内、或在一个月或多个月或更长的时期内以一系列多次施用。
本文所述的方法一般包括向有需要的哺乳动物对象提供一种或多种本文所公开的脂质纳米颗粒，其量和时间有效地将mRNA疫苗施用于存在所述对象体内或体周围的一种或多种选定的组织、器官、系统或细胞(如抗原呈递细胞---树突状细胞)。在特定优选的实施方案中，所述对象为人类，并且所述脂质纳米颗粒包含mRNA抗原编码部分，所述组分包含在多聚复合物中。
所公开的脂质纳米颗粒在各种体内和体内治疗方案中具有特别的用途，并且可以被单独配制，或者与一种或多种另外的药剂组合配制。
在相关实施方案中，本发明可提供治疗或治疗试剂盒，其包括一种或多种本文公开的mRNA疫苗递送系统，通常与以下各项组合：一种或多种可药用的载体、一种或多种可用于向目标对象施用所述组合物的装置以及关于在治疗哺乳动物疾病中施用脂质纳米颗粒的一套或多套说明书。
在某些实施方案中，所公开的组合物将适用于被引入到一种或多种类型的哺乳动物细胞类型中，例如包括但不限于树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、T细胞、B细胞、肿瘤细胞或其组合。
如本文所述，本公开的脂质纳米颗粒可通过任何一种或多种常规施用方法施用于所述对象，所述施用方法包括但不限于静脉注射、皮下注射和肌肉注射，或直接注射至所述对象体内或周围的一种或多种细胞或一种或多种组织、器官或肿瘤。
在特定的实施方案中，本发明的mRNA脂质纳米颗粒可配制用于药物施用，并且优选施用于人类。此脂质纳米颗粒可进一步包括一种或多种另外的治疗剂、化疗剂、佐剂或另外不同的mRNA疫苗。
本发明脂质纳米颗粒优选配制用于向哺乳动物全身施用，并优选用于皮内或静脉内施用，或肌肉内施用，并且特别是用于与一种或多种抗原呈递细胞接触并被其摄取，所述抗原呈递细胞包括但不限于树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞等。
该方法可以进一步任选包括向所述动物施用治疗有效量的放射或另外的化学治疗剂的步骤，以单次施用，或在一天或多天的时期内、在一周或多周的时期内、或在一个月或多个月或更长的时期内以一系列多次施用。
有益效果
本发明所公开的多种甘油酯类等化合物，为首次证明的可作为DOPE等中性脂质的替代辅助材料，该类化合物能很好的与DOTAP组合，有效地将mRNA分子递送至一种或多种免疫细胞(如：树突状细胞，巨噬细胞和单核细胞等)，并实现在指定的靶器官进行选择性表达同时避免在非靶器官中表达。本文所述的甘油酯类等化学物，通过适宜的比例与DOTAP或DOTAP及胆固醇组合，相较于DOTAP-DOPE、DOTAP-胆固醇组合以及DOTAP-DOPE-胆固醇组合，可显著提高体内mRNA的表达水平和靶向能力，从而产生更有效的免疫治疗效果。
附图说明
图1不同正负电荷比例下，探究DOTAP与单油酸甘油酯MO的组合物LNP2-MO对EGFPmRNA的体外转染HEK293的情况
图2指定正负电荷比例下，测定由DOTAP分别与多种甘油酯组合形成的脂质纳米颗粒与mRNA组装形成的复合物的理化性质，包括mRNA脂质纳米复合物的粒径(图a)和ζ表面电势(图b)。
图3体外实验探究各类甘油酯等化合物分别与DOTAP组合形成的纳米脂质对HEK293T(图a)和DC2.4细胞(图b)的转染情况，图c是图b荧光图片半定量后的统计结果柱状图
图4体外实验探究各类甘油酯等化合物分别与DOTAP和胆固醇组合形成的纳米脂质对HEK293T细胞的转染情况，并与双组分纳米脂质的转染效果进行对比.图a单脂肪酸链甘油酯介导的双组分和三组分纳米脂质转染效果对比图，图b二油酸甘油酯介导的双组分和三组分纳米脂质转染效果对比图，图c三脂肪酸链甘油酯介导的双组分和三组分纳米脂质转染效果对比图，图d胆固醇及其衍生物介导的三组分纳米脂质转染效果对比图
图5动物实验，mRNA脂质纳米复合物经尾静脉给药，探究mRNA脂质纳米复合物体内的表达和器官分布情况图a为balb/c小鼠的活体成像，图b为图5a小鼠各组织器官的离体成像图，图c是图5b半定量统计结果柱状图
图6动物实验，mRNA脂质纳米复合物经肌肉注射给药，探究mRNA脂质纳米复合物体内表达的时效性和器官分布情况
图a肌肉给药后的活体成像，图b肌肉给药24h后离体器官成像
具体实施方式
实施例1制备DOTAP-单油酸甘油酯组合物并分析不同正负电荷比对mRNA的体外转染效果
首先将DOTAP和单油酸甘油酯(monoolein,MO)用氯仿按照10mg/ml的浓度配置，按照摩尔比为DOTAP:MO＝2:1的比例将双组分在圆底烧瓶中混合均匀。37℃真空旋蒸1h，形成薄膜状固体。然后加入适量的DEPC水配制成浓度为1mg/ml的悬浊液。水浴超声1.5h，然后4℃过夜，次日再次水浴超声1h以确保充分溶解。依次用0.45、0.22和0.1um滤器各抽滤三次，如此获得符合实验要求大小的无荷载纳米脂质。
配制后的无荷载纳米脂质的浓度为1mg/ml，按照正负电荷比分别为1:1、1.5:2、1.7:2、2:1、2.5:1和3:1的比例加入指定量的无荷载脂质纳米颗粒包被mRNA。本实施例中培养细胞所用的时24孔板，对应的可转染mRNA量为1ug。具体操作为先将上述指定比例对应的无荷载纳米脂质用Opti-MEM定容至25ul，室温静置5min，促使无荷载纳米脂质在室温下进入稳定状态。等待期间，将1ug EGFP mRNA用Opti-MEM定容至25ul。5min后将两者混匀，室温静置30min，确保mRNA被纳米脂质所包被，形成脂质纳米颗粒。30min后，将混合液加入24孔板中，转染HEK293T细胞。
分别于转染后的24、48和72h通过荧光显微镜观察EGFP表达情况。如图1所示，可发现正负电荷比范围在1:1-2:1时，具有良好的转染效率，尤其是电荷比为1:1和1.7:2时，转染效果最佳。后期，我们对其他甘油酯、胆固醇酯和乙醇酰胺类与DOTAP组合的无荷载脂质，与mRNA组合的正负电荷比例均指定为1.7:2。
实施例2检测不同甘油酯与DOTAP或DOTAP和胆固醇组合形成的纳米脂质与mRNA形成的复合物的粒径和表面电势
归纳总结各类甘油酯并按照英文字母首字母大写的方式命名各化学物，如下表所示：
按照实施例1的配制方法配制无荷载纳米脂质，用DEPC水溶解和抽滤，各无荷载纳米脂质终浓度均为1mg/ml。具体配制组合如下表所示：
上述各无荷载纳米脂质均按照正负电荷比为1.7:2的比例，按照实施例1中所描述的配制方法配制EGFP mRNA脂质纳米复合物。自组装获得的EGFP mRNA脂质纳米复合物经BeNano 90 Zeta纳米粒度及Zeta点位分析仪测试，结果如图2所示，各EGFP mRNA脂质纳米复合物的粒径介于350-500nm区间，相较于LNP3(专利CN202011401158.1实施例制备的正电荷与负电荷的电荷比为1.7：2的EGFPmRNA的脂质纳米颗粒,下同)差异不显著。此外，分析ζ电势发现，EGFP mRNA纳米脂质复合物表面均呈现为弱的电负性，介于-10～-30mV。
实施例3体外实验探究DOTAP分别与多种甘油酯组合形成的复合物对mRNA的递送效果
采用实施例2中的无荷载纳米脂质，按照正负电荷比为1.7:2的比例，按照实施例1中所描述的配制方法配制EGFP mRNA脂质纳米复合物，以单独的DOTAP为control，并分别转染HEK293T和DC2.4(图3)细胞，判定转染水平。
分别于转染后的24、48和72h通过荧光显微镜观察记录EGFP mRNA的递送和表达情况。基于HEK293T细胞发现，DOTAP与甘油酯的组合物，如LNP2-SG、LNP2-GD、LNP2-MO、LNP2-DO、LNP2-LG等均具有良好的转染效果，而LNP2-PT和LNP2-GT以及LNP2-Gto则转染效果较差，推断甘油酯中甘油主链上至少需确保一个羟基的存在，从而可有效保证mRNA的递送能力；若主链上无羟基，则会显著影响mRNA的递送效果。整体而言，上述与DOTAP组合的化合物均为C18:0(硬脂酸链)、C18:1(油酸链)和C18:2(亚油酸链)的C18脂肪链，且单脂肪链与双脂肪链的效果相差无几，而单双脂肪链的效果则均好于三脂肪链。此外，油酸链的效果与硬脂酸链和亚油酸链的效果无显著的差异性。进一步的，探究了短脂肪链是否对mRNA的递送有影响。实验中选用C16:0的棕榈酸甘油和C14:0的肉豆蔻酸甘油与DOTAP组合，分别为LNP2-GP和LNP2-DT，观察发现两者均具有较好的转染效果，且与单硬脂酸甘油的效果相当。
此外，鉴于转染HEK293T细胞EGFP mRNA表达效果在各纳米脂质之间差异不太显著，实验中选用DC2.4细胞作为转染对象做进一步的探究。分别于转染后的24、48和72h采集荧光图片并做数据分析，研究发现基于甘油酯开发的双组分纳米脂质，转染效果显著好于DOTAP-DOPE和DOTAP-胆固醇纳米脂质。
实施例4探究不同甘油酯与DOTAP和胆固醇组合形成的纳米脂质对mRNA的体外递送效果
按照实施例1所述制备方法，将不同甘油酯分别于DOTAP和胆固醇组合获得无荷载纳米脂质，用DEPC水溶解，并抽滤后的各无荷载纳米脂质终浓度均为1mg/ml。具体各配制组合如下表所示(注：胆固醇Cholesterol，简写为Chol)：
上述各无荷载纳米脂质均按照正负电荷比为1.7:2的比例，按照实施例1中所描述的配制方法配制mRNA递送体系，并转染HEK293T细胞，判定转染水平。
分别于转染后的24、48和72h通过荧光显微镜观察判定mRNA递送和表达情况(图4)。研究结果显示，胆固醇的引入，有助于改善DOTAP-甘油酯介导的mRNA递送效果，尤其是对于三脂肪链甘油酯而言，其与DOTAP形成的双组分复合物(如LNP2-Gto)对于mRNA的转染效果较差。而与之相反的，引入胆固醇形成的三组分复合物则显著改善mRNA的转染效果。除此之外，对于胆固醇，我们同样也探究其是否具有保守性(或可更换性)，实验中我们将胆固醇用β-谷甾醇替换，并与单油酸甘油酯和DOTAP组合，获得新的纳米脂质LNP3-MO(R)，研究发现LNP3-MO(R)所介导的体外转染效果很差，EGFP mRNA的表达水平很低，表明胆固醇在本发明开发的纳米脂质中具有很高的保守性。
实施例5动物实验鉴定纳米脂质复合物所介导的mRNA器官靶向和表达效果
选用LNP2-MO，LNP3-MO和LNP3(CN202011401158.1实施例1制备，作为对照制剂)作为体内给药用的无荷载纳米脂质，给药途径为尾静脉注射给药。研究对象为6-8周龄雄性Balb/c小鼠，按照实施例1的配制方法，将荧光素酶mRNA分别用上述制剂混合形成mRNA纳米脂质复合物，按照每只小鼠10ug mRNA的量行尾静脉推注。
分别于注射后的6、12和24h，腹腔注射D-荧光素钠，用小动物成像设备对小鼠活体成像，观察荧光素酶在体内的表达和分布情况(图5)。活体成像发现荧光素酶的表达呈现器官的靶向性，LNP2-MO介导的荧光素酶表达主要集中在肺部和脾脏，而LNP3-MO和LNP3所介导的荧光素酶表达则主要集中在脾脏；可见胆固醇的引入改善了对器官的靶向性，促使mRNA只在某一器官富集。24h后，采用过量麻醉的方式处死小鼠，分离心脏、肝脏、脾脏、肺部、肾脏、胸腺和淋巴结等组织器官，用小动物成像设备对组织器官成像，判定荧光信号在组织器官上的富集情况。通过对组织器官成像，更进一步的证实了纳米脂质复合物所介导的mRNA表达具有器官靶向性的特性。
实施例6动物实验探究纳米脂质复合物所介导的mRNA表达时效性效果
制备方法和实施例1一致，选用LNP3-MO作为实验用纳米脂质复合物，按照正负电荷比1.7:2的比例制备荧光素酶mRNA纳米脂质复合物，以每只小鼠右侧腿部肌肉注射5ugmRNA的剂量配制脂质纳米颗粒，选用的小鼠为BalB/c小鼠。
分别于注射后的6、12和24h，腹腔注射D-荧光素钠，然后小动物成像鉴定mRNA在体内的表达和分布情况(图6)。实验鉴定发现，荧光素酶的表达随着时间的延长，呈现逐步下降的趋势，而且其表达区域仅限于注射部位，未在其他组织器官检测到荧光信号。
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