具体实施方式

在描述本组合物、制剂、以及制造与使用及治疗的方法之前，应当理解，本发明不限于所述的具体实施方案，因为该具体实施方案当然可以变化。还应该理解，本文中使用的术语仅仅出于描述具体实施方案的目的，而不是意在限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限制。

在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文明确说明，否则还具体地公开了该范围的上限与下限之间的每个中间值至该下限的十分之一单位。所述范围内的任一所述值或中间值与该所述范围内的任一其他所述值或中间值之间的每个更小范围涵盖在本发明内。这些更小范围的上限和下限可以独立地纳入该范围内或排除在该范围外，并且两个界限中的任一者纳入、二者均不纳入或二者均纳入这些更小范围内的各范围也纳入本发明内，以所述范围中的任何具体排除的界限为准。在所述范围包含界限之一或两者时，排除那些已纳入界限中的任一者或两者的范围也纳入本发明。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的任意方法和材料都可以用于本发明的实践或检验，但是现在描述一些可能和优选的方法和材料。本文中提及的全部出版物通过引用并入本文，以公开和描述随出版物一起引用的方法和/或材料。应该理解，本公开取代所并入出版物的任何公开到存在矛盾的程度。

本文讨论的出版物仅因其公开先于本申请的提交日而提供。本文中任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于该出版物。此外，所提供的出版物的日期可能与实际出版日期不同，实际出版日期可能需要单独地确认。

定义

疫苗是意在改进接受者对特定疾病的免疫力的生物学制剂。疫苗一般含有与致病微生物相似的药剂，并且通常由致弱或杀死形式的微生物或其毒素制成。该药剂刺激身体的免疫系统，以将药剂识别为异体、破坏该药剂并“识别”该药剂，使得免疫系统可以更容易地识别并且破坏免疫系统稍后遇到的这些微生物中的任一者。疫苗可以为预防性(例如防止或减轻任何天然或“野生型”病原体所致未来感染的影响)或治疗性(例如抗癌症疫苗也正在被研究)。

人白细胞抗原(HLA)复合体是人主要组织相容性复合体(MHC)。HLA复合体包括HLAI类复合体和HLA II类复合体。HLA-A、HLA-B和HLA-C是分别由HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座(loci)编码的三个类型的人MHC I类复合体。

人白细胞抗原(HLA)基因组是一组编码HLA复合体的基因。HLA基因组包括HLA I类基因组和HLA II类基因组。

程序性死亡-配体1(PD-L1)是人体中由CD274基因编码的蛋白质。程序性死亡-配体1(PD-L1)是一种40kDa 1型跨膜蛋白，据推测该跨膜蛋白在特定事件(诸如妊娠、组织同种异体移植、自身免疫疾病)和其他疾病状态(诸如肝炎)期间在抑制免疫系统的适应性力量(adaptive arm)方面发挥主要作用。正常情况下，适应性免疫系统对与外源性或内源性危险信号的免疫系统激活相关的抗原发生反应。反过来，抗原特异性CD8+T细胞和/或CD4+辅助细胞的克隆扩增(clonal expansion)得以繁殖。PD-L1与抑制性检查点分子PD-1的结合基于与磷酸酶(SHP-1或SHP-2)的相互作用经由免疫受体酪氨酸类开关基序(Immunoreceptor Tyrosine-Based Switch Motif,ITSM)传递抑制性信号。这减少了淋巴结中的抗原特异性T细胞的增殖，而同时减少了调节性T细胞(抗炎性、抑制性T细胞)中的凋亡--进一步由基因Bcl-2的较低调节介导。

如本文所用的术语“抗原”包括本领域已知的含义，并且意指可以与抗体或T细胞受体上的识别位点反应的分子或分子部分，往往出于本发明的目的而意指多肽分子(氨基酸序列)。术语“抗原”还包括本身或联合佐剂或载体可以引起免疫应答的分子或分子部分(也称作“免疫原”)。

如本文所用的术语“新生抗原”包括本领域已知的含义，并且意指在癌细胞表面上存在但患者的正常细胞表面中不存在的抗原。新生抗原为至少约8个氨基酸的长度，和不多于约15至22个氨基酸的长度。T细胞受体识别比抗体更复杂的结构，并且需要主要组织相容性抗原结合袋和抗原性肽二者均存在。T细胞受体与表位的结合亲和力低于抗体与表位的结合亲和力，并且通常将是至少约10-4M、更通常地至少约10-5M。

术语“抗原呈递细胞”或APC可以通常指具有其中存在抗原的表面HLA I类或HLAII类分子的哺乳动物细胞。除非另外说明，否则出于本发明目的，抗原呈递细胞是可以激活或启动T细胞(包括初始T细胞)的“专职”抗原呈递细胞。专职APC通常表达HLA I类和HLA II类分子二者，并且在通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用非常有有效地内化抗原，随后在其细胞表面上展示与适当HLA分子结合的抗原或其片段。合成额外的共刺激分子是专职APC的关键特征。在这些APC中，树状细胞(DC)具有最广范围的抗原呈递作用，并且是最重要的T细胞激活者。巨噬细胞、B细胞和某些激活的上皮细胞也是专职APC。

术语“组数据(ome data)”指关于患者的基因组、外显子组、转录组或它们的组合的数据。

表述“增强的免疫应答”或类似术语意指相对于先前的免疫应答状态(例如，在施用本发明的免疫原性组合物之前的自然状态)升高、改进或增强免疫应答以有益于宿主。

术语“细胞介导的免疫”和“细胞介导的免疫应答”意指淋巴细胞提供的免疫防御，如由T细胞淋巴细胞紧邻靶细胞时所提供的那种防御。细胞介导的免疫应答通常包括淋巴细胞增殖。当测量“淋巴细胞增殖”时，测量淋巴细胞响应于特异性抗原而增殖的能力。淋巴细胞增殖意在指T-辅助细胞或细胞毒性T-淋巴细胞(CTL，cytotoxic T-lymphocyte)的细胞增殖。

术语“免疫原性量”指与在不存在微球制剂的情况下由抗原引起的免疫应答相比，随主题免疫原性组合物一起施用时，足以激发增强的免疫应答的抗原性化合物的量。

术语“治疗”、“治疗(treating)”和“治疗(treat)”等在本文中用来通常指获得所需的药理效应和/或生理效应，诸如增强的免疫应答。该效应可以就完全或部分防止疾病或其症状而言为预防性的、和/或可以以部分或完全稳定或治愈疾病和/或归因于该疾病的不良反应的而言为治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖对受试者、具体地哺乳动物受试者、更具体地人的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病或症状在可能倾向患有该疾病或症状但尚未诊断罹患该疾病或症状的受试者中出现；(b)抑制疾病症状，例如，中止其发展；或减轻疾病症状，即，引起疾病或症状的消退；(c)由疾病的致病原(infectious agent)产生的产物(例如，毒素和抗原等)的水平的降低；和(d)减少对疾病的致病原的不期望的生理应答(例如，发热和组织水肿等)。

抗体或T细胞受体的“特异性”指可变区以高亲和力与抗原结合的能力。抗原中被免疫受体结合的部分称作表位，并且表位是抗原中足以进行亲和力结合的部分。尽管存在抗原含有单个表位的情况，但是单独抗原一般含有多个表位。

总体发明

公开了与个性化癌症疫苗有关的方法和组合物。本公开提供制造个性化癌症疫苗的方法，所述方法包括：预测特定个体患者的第一新生抗原或第二新生抗原是否对患者的人白细胞抗原(HLA)复合体具有更强的结合亲和力；和创建含有具有更强的预测结合亲和力的新生抗原的粒子。这种预测步骤包括人工智能、统计建模或它们的组合。通过将对患者的HLA复合体具有更强的预测结合亲和力的新生抗原包封在材料中来创建这种粒子。这里，在特定尺寸的粒子中放置抗原称作尺寸排阻抗原呈递控制(SEAPAC)。本公开还提供使用这种个性化癌症疫苗治疗患者的方法。本公开提供个性化癌症疫苗组合物和含有个性化癌症疫苗组合物的试剂盒。

在一些实施方案中，该方法还包括通过获得关于患者的组数据，鉴定患者中的第一新生抗原和第二新生抗原，其中组数据包括来自患者的正常细胞和癌细胞的基因组数据、外显子组数据、转录组数据中的一者或多者。

在一些实施方案中，该方法还包括确定患者的HLA基因型。在一些情况下，HLA基因型是HLA I类基因型。在一些情况下，HLA I类基因型选自：HLA-A基因型、HLA-B基因型、HLA-C基因型或其组合。

预测HLA-新生抗原结合亲和力

如上文所述，预测患者的第一新生抗原或第二新生抗原是否对患者的HLA复合体具有更强的结合亲和力的步骤包括人工智能、统计建模或它们的组合。该步骤基于训练数据和患者的HLA基因型来执行。

人工智能包括基于来自相似场景的已知结果，尝试预测场景结果(例如新生抗原与HLA复合体的可能结合)的计算方法。如本文所用，来自相似场景的已知结果称作训练数据。作为示例，训练数据可能包括发现特定的新生抗原是否与特定HLA复合体(例如HLA-A*0201)结合或不结合。作为实施例，这类新生抗原可能基于首个和最末氨基酸而变化，例如AMFPNAPYL、AMFPNAPYP和RMFPNAPYL。因此，这类训练数据可以用来预测具有不同但是相似的氨基酸序列的新生抗原(例如RMFPNAPYP)是否将与HLA-A*0201结合。如本文所用，其中未知特定新生抗原是否将与特定HLA复合体结合或以何种强度结合的数据集称作测试数据。通过预测在细胞培养基中体外验证的新型新生抗原候选物，生成并扩充稳健的数据集。可以通过使荧光团与候选新生抗原肽结合来创建高通量分析，以便使成功的抗原呈递事件可视化。这使用各自含有单一荧光团标记序列的佐剂化微球来执行。该可视事件可以用配备光源的显微镜数字化，该光源具有从与新生抗原肽结合的荧光团触发荧光事件的适宜波长。用于使用显微术分析这种的细胞需要置于多孔板中。这些板可以利用金属反射性背景材料增强来自肽结合性荧光团的荧光事件，以增强使细胞内荧光团标记肽的移动可视化的能力。还可以通过用荧光团标记肽抗原预处理培养物中的细胞，使抗原呈递细胞表面上的MHC受体用标记肽而变得饱和，来使抗原呈递事件可视化。随后，可以向培养物引入具有未标记肽的微球，并且可以使用光学显微术来观察随着未标记肽的抗原呈递发生，未标记肽从细胞表面的标记肽的位移。这后一种方法具有以下优点：用来患者治疗的相同制剂可以用于体外分析中，因为荧光团标签的确没有并入装载至微球的肽中。

这种技术和其他技术可以允许肽从细胞内移动至细胞表面，从而表明与新生抗原肽-MHC结合相关的呈递事件已经出现。

可以通过各种方法(例如卷积神经网络)处理该可视信号，以便为与该新生抗原肽相关的HLA结合或其他胞内事件提供得分，这些其他事件包括借助TAP蛋白的抗原的蛋白酶剪切和运输。将红外荧光团添加到肽以进行可视化没有显著地干扰肽-MHC结合事件，因为我们已经使用体外肽-MHC结合亲和力测定表明，近红外窗口荧光团(Zhu等人，PNAS 2017年1月31日，第114卷，第5期，第962-967页)与pan-DR结合表位(PADRE)肽(AKFVAAWTLKAAA)的连接维持了生理学适宜的MHC-肽结合事件(表1)。可以通过如上文所述的神经网络增强分析来生成验证MHC结合预测的数据，从而在神经网络模型中创建有价值的反馈，以更好地预测任意新生抗原肽的肽-MHC结合特性。抗原呈递是响应于肽新生抗原而产生T细胞扩增的必要但不充分的步骤。ELISpot测定表明抗原呈递后特异性新生抗原肽产生T细胞扩增事件的程度。该测定通过将待评估的肽新生抗原添加至ELISpot板上的PBMC(外周血单个核细胞，peripheral blood mononuclear cell)孔而执行，该孔设计成如果干扰素γ响应于该肽新生抗原由APC呈递和处理而释放，导致T细胞扩增事件，则造成细胞改变颜色。通过对患者的外周血实施ELISpot测试，新生抗原预测算法还可以进一步得益于这种与新生抗原处理和生理学响应(T细胞扩增)相关的反馈。

如在上述数据中所示，通过使用肽亲和力结合测定，PADRE与DRB3*0202之间的肽-MHC结合亲和力显示为在添加红外荧光团配体之前和之后基本上无变化。

人工智能与硬编码法的区别在于，硬编码法包含由人明确规定的参数。相反，人工智能法使用计算方法调整模型的各种参数，而没有明确的人指令，以便以允许对测试数据进行最佳可能预测的方式准确反映训练数据。在上文描述的实施例的硬编码版本中，人将明确地检查AMFPNAPYL、AMFPNAPYP和RMFPNAPYL新生抗原是否与HLA-A*0201新生抗原结合，并且明确地决定第一氨基酸、最末氨基酸或二者是否影响HLA-新生抗原结合。基于明确的人假设，硬编码法随后将预测测试数据(例如，RMFPNAPYP和HLA-A*0201)的结果。

相反，在人工智能法中，人将向计算系统提供训练数据，但是计算系统将基于训练数据调节模型的参数，以获得测试数据的最佳预测。随着训练数据变得可获得，更多训练数据的添加允许计算系统继续学习并且通过各种实现(implementation)和架构改进预测。

人工智能的一个实施例是机器学习。机器学习可以基于过程的不同方面分成各种类别，例如有监督学习与无监督学习。在有监督学习中，计算系统尝试通过调整由人鉴定为潜在影响结果的参数来优化模型。就上文实施例而言，人可将首个和最末氨基酸鉴定为与结合至HLA-A*0201复合体潜在有关，并且计算系统将在模型中考虑这些变量。在无监督学习中，计算系统未被明确指示哪些参数对结果潜在重要，并因此基于训练数据鉴定潜在有关的参数。作为实施例，计算系统可假设，前两个氨基酸(例如AM与RM)之间的关系与HLA-新生抗原结合有关。

随本方法可用的机器学习技术的实施例是人工神经网络(artificial neuralnetwork,ANN)。ANN如此命名是由于受生物大脑启发。ANN包括多个所谓的层，该多个层包括一个输入层、一个或多个隐藏层和一个输出层，其中各层具有各种节点。始于输入层，各节点连接于下一层处的一个或多个节点，并且各连接具有加权系数。类比于生物大脑，各节点是神经元。训练数据被剖析成独立参数，这些独立参数随后被分配到相应的输入节点。基于各节点的值和节点之间的加权因子，所谓的值从输入层通过隐藏层传导至输出层。在以上实施例中，输入层将是新生抗原的氨基酸序列并且随后是HLA复合体的特性。在以上实施例中，输出层将是新生抗原是否与HLA复合体结合，或该结合有多么地强烈。为了改进预测HLA-新生抗原结合的准确性，可以改变节点之间各连接的加权因子，以便最佳拟合训练数据。在存在两个或更多个隐藏层的ANN中，ANN称作深度ANN。机器学习技术使过去的神经网络扩展成聚类、随机森林等。

支持向量机(SVM，Support vector machines)是随本方法可用的机器学习技术的另一实施例。SVM是可用于分类和回归分析的有监督学习法。而ANN可以用来预测结果的大小，例如HLA-新生抗原结合的强度，SVM用来预测若干离散结果之一，例如新生抗原是否将与HLA复合体结合或不结合。

随本方法可用的人工智能的另一实施例是进化算法。进化算法从生物进化借用概念，以改进训练数据预测出测试数据的结果的能力。进化算法涉及各种参数的随机变化或伪随机变化，即类似于生物系统中的突变，随后评估新的参数是否更准确地对训练数据建模，即类似于进化适应性(evolutionary fitness)的生物学概念。

HLA-新生抗原结合的预测还可以涉及统计建模，例如位置特异性得分模型(position specific scoring models,PSSMs)和马尔可夫模型。统计建模与人工智能区别在于，人工智能涉及多重迭代中各种参数的调整，其中每次迭代后评估模型与训练数据之间的相似性。相反，统计建模不涉及这类多重迭代，反而涉及执行预定义的算法，以便预测出测试数据的结果。与人工智能一样，用统计建模预测HLA-新生抗原结合的强度涉及使用已生成的训练数据。

在本方法中使用PSSM涉及决定待考虑的新生抗原的长度，例如8个氨基酸、9个氨基酸等的新生抗原。一旦决定了新生抗原的长度，则各氨基酸被标记为不同的位置，即该氨基酸与HLA复合体相互作用的位置。接下来，构建数值矩阵，其中行可以是氨基酸位置，而列可以是氨基酸的身份(identity)，例如组氨酸(H)、赖氨酸(K)等。各细胞中的数值(即，特定位置和氨基酸的每种组合)可以反映对HLA-新生抗原结合的相对重要性。作为实施例，如果训练数据显示或表明第4位置处的组氨酸氨基酸强烈地增加结合亲和力，则4-组氨酸细胞可以被分配相对大的数值，例如+18。相反，如果基于训练数据，第4位置处的赖氨酸强烈地不利于结合亲和力，则该第4位置处的赖氨酸可以被分配较低的值，例如-9。如果特定位置处氨基酸的身份似乎并未有意义地影响结合亲和力，则该特定位置处氨基酸可以被分配绝对值相对小的值，例如对于轻度不利于结合指定-2，或对于轻度有利于结合指定+1。可以通过训练数据调整或确定矩阵中全部值的相对权重。为了预测出测试数据中新生抗原的结合强度，与各位置中的氨基酸相对应的值可以被总和并与已知HLA-新生抗原复合体的总和进行比较。由于新生抗原的氨基酸序列是变化的，而HLA复合体保持恒定，所以当测试数据的HLA复合体与用来构建PSSM的HLA复合体相同或高度相似时，PSSM最有用。

马尔可夫模型是一种用来对随机变化系统建模的统计模型。隐马尔可夫模型是一种类型的马尔可夫模型，并且是动态贝叶斯网络的最简单再现。另一种类型的马尔可夫模型是马尔可夫链。鲍姆-韦尔奇算法是在隐马尔可夫模型中找出未知参数的一种方式。本文所述的马尔可夫模型中的每一种随本方法可用。

在上述预测HLA-新生抗原结合的方式中的每一种中所用的训练数据可以源自各种来源，并且可以具有各种类型。这些训练数据包括多个条目，其中各条目包括：(i)抗原的氨基酸序列或三维化学结构或其组合；(ii)HLA复合体的氨基酸序列或三维化学结构或身份或其组合；和(iii)HLA-抗原结合的描述，例如存在结合、不存在结合或结合的强度。

如本领域技术人员所理解的，患者的HLA基因型指编码患者携带的HLA复合体的基因的特定等位基因。与本方法有关的HLA复合体包括：HLA I类复合体，该HLA I类复合体包括HLA-A、HLA-B和HLA-C复合体；和HLA II类复合体，该HLA II类复合体包括HLA-DP、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DQ和HLA-DR复合体。HLA II类复合体也与本方法有关。

由于患者一般携带HLA基因的两个副本，即来自父母中的每个的一个副本，患者一般将具有HLA-A的两个不同等位基因。在一些情况下，患者将从父母双方继承相同的HLA-A等位基因，从而患者将仅具有一个HLA-A等位基因。因此，大部分患者将具有六个HLA复合体I等位基因和六个HLA复合体I复合体：两个HLA-A、两个HLA-B和两个HLA-C。HLA-A等位基因和复合体的身份的一个实施例是HLA-A*0201。

同样地，使用特定新生抗原和对应于特定HLA等位基因的特定HLA复合体，执行估计如本文所述的HLA-新生抗原结合的强度。在一些情况下，该方法包括估计两种新生抗原对一种特定HLA复合体的结合亲和力。在一些情况下，该方法包括估计两种新生抗原对两种或更多种特定HLA复合体(如三种或更多种HLA复合体、四种或更多种HLA复合体、五种或更多种HLA复合体或六种HLA复合体)的结合亲和力。

因此，预测第一或第二新生抗原是否将对HLA复合体具有更强的结合亲和力可以包括估计HLA-新生抗原对多个特定HLA复合体的结合强度。

在一些情况下，训练数据包括氨基酸序列数据(例如新生抗原的氨基酸序列数据)。在一些情况下，训练数据包括HLA复合体的氨基酸序列数据。在一些情况下，训练数据包括新生抗原、HLA复合体、HLA-新生抗原复合体或其组合的三维化学结构。这类三维化学结构数据可以从晶体结构分析、相关化学结构的计算机建模或本领域已知的任何其他方式而获得。可以以本领域已知的任何方式(例如质谱法)获得氨基酸数据。在一些情况下，从晶体结构分析、质谱法、计算机建模、解离动力学分析或其任意组合获得HLA-新生抗原结合的存在、不存在或强度。在一些情况下，训练数据描述HLA-新生抗原结合的存在或不存在。在一些情况下，训练数据描述HLA-新生抗原结合的强度。新生抗原处理并非唯一地取决于新生抗原肽序列。侧翼(Flanking)氨基酸序列可以影响处理和呈递新生抗原的方式。训练数据相对于这些侧翼区而言是重要的。新生抗原不仅仅由错义的体细胞突变而产生，即造成种系中见不到的氨基酸变化。可以产生新生抗原的其他方式包括移码突变(frameshiftmutation)、可变剪接事件(alternative splicing event)、翻译的非编码区(translatednon-coding region)和新阅读框(neo-reading frame)。DNA和RNA的下一代测序可以揭示这些已表达序列的存在。

鉴定新生抗原

可以通过将一个或多个正常细胞的基因组、外显子组、转录组或它们的组合与一个或多个癌细胞的基因组、外显子组、转录组或它们的组合进行比较，鉴定新生抗原。如上文所述，如本文所用的术语“新生抗原”包括本领域已知的含义，并且意指在癌细胞表面上存在但患者的正常细胞表面中不存在的抗原。如本文所用，术语“组数据”指关于患者的基因组、外显子组、转录组或其组合的数据。

可以从中获得正常细胞和癌细胞的组织样品包括新鲜活检、冷冻或以其他方式保存的组织或细胞样品、循环癌细胞、外泌体、各种体液(例如血液)等。

在获得有关细胞后，获得组数据的合适方式包括：核酸测序，并且特别是对DNA运行的NGS法(例如，Illumina测序、离子激流测序(ion torrent sequencing)，454焦磷酸测序、纳米孔测序等)；RNA测序(例如，转录组测序技术(RNAseq)、基于逆转录的测序等)；和蛋白质测序或基于质谱法的测序(例如，SRM、MRM、CRM等)。从提取的DNA检索人外显子组和/或基因组的测序规范可以包括改进捕获和下游分析(如使用无PCR文库(PCR free library))的各种步骤。对于RNA-Seq，涉及不同捕获方法(如多聚腺苷酸(Poly-A)、核糖体损耗(Ribosomal depletion)等)的制备步骤可以用来有效捕获感兴趣的区域。同样，可以以多种方式执行序列数据的计算分析。然而，在最优选的方法中，分析是通过肿瘤样品和正常样品的位置导引同步比对而在计算机中执行的，如例如美国专利公开2012/0059670和2012/0066001中公开的使用BAM文件和BAM服务器，所述专利公开通过引用而并入本文用于获得组数据和鉴定新生抗原的方法。由软件或人工智能算法使用的额外生物信息学格式还可以包括FASTQ、VCF、(G)VCF、FASTQC、FASTA等。这种分析有利地且显著地减少假阳性新表位。可以通过本领域技术人员容易已知的技术或通过使用标准程序，如例如在美国专利公开第2011/0293637号中所述那样，执行癌症基因组的遗传测序，所述专利公开通过引用而并入本文用于获得组数据的方法。

可以例如通过突变类型、转录强度、翻译强度和先验已知分子变异中至少一者进行过滤，通过比较来自正常细胞的组数据与癌细胞的组数据来鉴定新生抗原。作为实施例，高亲和力结合物对至少一个HLA I类亚型或至少一个HLA II类亚型具有小于150nM的亲和力，和/或使用de Bruijn图，经由电脑模拟确定患者的HLA基因型。美国专利公开2017/0028044中描述了组数据的这种比较的实施例，所述专利公开通过引用而并入用于鉴定新生抗原的方法。

可以通过考虑突变的类型(例如，缺失、插入、颠换、转换、移位)和突变的影响(例如，无义、错义、移码等)，来鉴定癌细胞中的突变，这可以充当籍此消除沉默突变和其他不相关(例如，无表达)突变的第一内容过滤器。

另外，由于新生抗原包括几个氨基酸，例如8、9、10、11个，癌细胞中的单突变可能会产生数个新生抗原。按另一种方式拟订，氨基酸中的变化可以出现在遍及新生抗原的任何位置，例如第一氨基酸、第二氨基酸、第三氨基酸、最末氨基酸。因此，在基于氨基酸中的变化鉴定新生抗原后，也可以鉴定含有相同的变化的氨基酸的额外新生抗原。因此，单突变可以导致多种新生抗原，这可以评估这些新生抗原对HLA复合体的结合亲和力，从而增加将找到强结合亲和力的可能性。

如果HLA复合体是HLA I类复合体，则通常新生抗原长度将是约8-11个氨基酸，而用于经由HLA II类复合体的呈递的通常新生抗原将具有约13-17个氨基酸的长度。如将容易地领会的，由于新表位中的变化的氨基酸的位置可以是除中心之外，因此新生抗原的实际氨基酸序列和新生抗原的实际拓扑结构可能大幅度改变。

图1示意性地显示在BALB/c小鼠中使用4T1三阴性乳腺癌肿瘤模型的小鼠中新生抗原鉴定的过程。这项研究评估了载有肽新生抗原QP19的FlowVax BreastCA^TM微球的肿瘤抑制作用，通过RNA测序确定该肽新生抗原存在于三阴性乳腺癌细胞上，但不存在于正常乳腺组织上(参见图1和图2)。通过注射将4T1剂量的250个细胞(该剂量在我们的先前研究中预测在50％对照小鼠中产生肿瘤)递送入两组小鼠(每组10只)的乳腺组织中，一组充当对照，并且另一组设计成评估FlowVax BreastCA^TM的效力。初步数据显示，在肿瘤注射前14天接受FlowVax BreastCA^TM并随肿瘤注射接受第二剂量的存活小鼠比对照组小鼠具有更少肿瘤(图3)。治疗组的小鼠比未治疗小鼠显示对肿瘤新生抗原QP19的更强的免疫应答(图4和图5)。

这项研究还显示，这些小鼠中的4T1肿瘤并不产生(elaborate)检查点抑制剂PD-L1，PD-L1存在于不到半数的三阴性乳腺癌肿瘤中。这尤其重要，因为目前FDA批准的三阴性乳腺癌的特定治疗涉及使用针对PD-L1或PD-1的抗体。已经显示这些治疗在肿瘤产生PD-L1时有效。实际上，由Genentech作为TECENTRIQ(特善奇)销售的阿特朱单抗(atezolizumab)与免疫组织化学测定法共同销售，以检测三阴性肿瘤样品中PD-L1的存在，以便如果PD-L1存在于肿瘤样品中，则指导治疗医生使用TECENTRIQ。本发明特别意在用来在肿瘤细胞并未正在产生PD-L1时治疗三阴性乳腺癌。

确定HLA基因型

如上文所述的，患者具有多种HLA复合体，其中每种HLA复合体对应于编码HLA复合体的多个基因中一者的特定等位基因。作为实施例，患者一般具有六种HLA I类等位基因和复合体：两种HLA-A、两种HLA-B和两种HLA-C。因此，确定患者的HLA基因型意味着确定患者中一个或多个等位基因或复合体的身份。在一些情况下，该确定包括确定患者中的两个或更多个等位基因，如三个或更多个等位基因、四个或更多个等位基因、五个或更多个等位基因或六个或更多个等位基因。

可以使用本领域已知的用于确定患者的HLA基因型的任何方法，如测序患者的全基因组和鉴定编码HLA复合体的一个或多个等位基因。本领域已知的方法包括美国专利申请2010/008691的那些方法，所述专利申请通过引用而并入用于确定患者的HLA基因型的方法。

创建粒子

本发明的创建粒子的步骤涉及将对患者的HLA复合物具有更强的预测结合亲和力的新生抗原包封在材料中。

可以通过任何合适的方法获得待包封在粒子中的新生抗原，例如化学合成新生抗原。本领域已知化学合成新生抗原的几种方法。由于新生抗原含有多个氨基酸，故合成肽的方法与新生抗原的合成有关。溶液相肽合成可以用来构建中等尺寸的新生抗原，或者对于新生抗原的化学构建，可以使用固相合成。Atherton等人(1981)Hoppe SeylersZ.Physiol.Chem.362:833-839.蛋白水解酶也可以用来偶联氨基酸以产生新生抗原。Kullmann(1987)Enzymatic Peptide Synthesis,CRC Press,Inc.。可替代地，可以通过使用细胞的生物化学装置或通过从生物源分离，来获得新生抗原。重组DNA技术可以用来新生抗原的产生。Hames等人(1987)Transcription and Translation:APractical Approach(转录和翻译：实用方法),IRL Press。也可以使用标准技术如亲和色谱(affinitychromatography)，来分离新生抗原。

粒子的材料可以是多种组合物(例如聚合物)中的任一种。在一些情况下，聚合物是生物相容性聚合物。可用于本发明中的生物相容性聚合物的示例包括：羟基脂肪族羧酸，或者均聚物或共聚物，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(dl-丙交酯/乙交酯)、聚(乙二醇)；多糖，例如凝集素，糖胺聚糖，例如壳聚糖；纤维素和丙烯酸酯聚合物等。在一些情况下，生物相容性聚合物是聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、聚己内酯、聚乙交酯、聚乳酸或聚-3-羟基丁酸酯。在一些情况下，粒子包含两种或更多种不同的材料。

可以通过任何合适的方法创建粒子，例如通过将新生抗原与材料混合并从装置挤出混合物，如美国专利6,116,516中所述，所述专利通过引用而并入本文用于制造粒子的方法。也可以根据美国专利9,408,906和10,172,936中所述的方法创建粒子，所述两份专利均通过引用而并入本文用于制造(例如，具有特定尺寸的)粒子的方法，并且在与本文所述技术一起使用时提供称作尺寸排阻抗原呈递控制(SEAPAC)的新型疫苗。

在一些实施方案中，粒子是微球。微球可以基本上为球状。微球可以具有一定范围的直径，例如，在1微米(即微米)至100微米的范围内的直径。粒子的直径可以在11微米±20％、±10％、±5％、±2％或±1％的范围内。在一些情况下，微球的直径介于2微米和50微米之间、介于2微米和35微米之间、介于2微米和20微米之间、介于2微米和15微米之间、介于2微米和10微米之间、介于4微米和35微米之间、介于4微米和20微米之间、介于4微米和15微米之间、介于4微米和10微米之间、介于8微米和20微米之间、介于8微米和15微米之间、介于10微米和20微米之间或介于10微米和15微米之间。粒子的直径可以为约4微米、约6微米、约8微米、约10微米、约12微米、约14微米、约16微米、约18微米、约20微米、约22微米、约24微米、约26微米、约28微米或约30微米。

另外，本公开提供粒子组。在一些情况下，组中的粒子可以全部具有相同的尺寸，或组中的全部粒子可以具有在相同范围内的尺寸。在其他情况下，组中的粒子可以具有不同的尺寸，例如该组中的至少一个粒子的尺寸与至少一个其他粒子的尺寸不同。在一些实施方案中，组中的各粒子的直径在11微米±20％、±10％、±5％、±2％或±1％的范围内。

在一些情况下，组中的全部粒子均可以包封相同的肽种类(peptide species)，即相同肽的多个副本。如本文所用，肽种类是具有特定氨基酸序列的肽，使得来自不同肽种类的肽将具有不同的氨基酸序列。在一些情况下，组中的粒子可以包封不同的肽种类，例如第一粒子包封未经第二粒子包封的第一肽(或该肽的多个相同副本)种类，并且第二粒子包封未经第一粒子包封的第二肽种类(或该肽的多个相同副本)。如此，多个粒子组含有多个肽种类，如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个或更多个。另外，可以组合来自多个组的粒子，以形成新的粒子组。

在一个实施方案中，创建分别包封第一肽种类和第二肽种类的第一粒子组和第二粒子组。第一粒子组和第二粒子组随后被组合，使得所得到的粒子组合是含有第一肽种类和第二肽种类的个性化癌症疫苗。也可以使用分别包封第三、第四、第五、第六等肽种类的三、四、五、六或更多个粒子组，制造这种粒子组合，使得个性化癌症疫苗含有三、四、五、六个或更多个肽种类。个性化癌症疫苗还可以仅含有单个肽种类。另外，个性化癌症疫苗中的多个粒子可以含有具备尺寸、材料和肽种类的任何组合的粒子。

粒子的尺寸可以设计成使得抗原呈递细胞(如树状细胞)可以仅消耗单个粒子。存在以下证据：单个APC呈递多个表位可能导致单个表位的免疫优势，这在需要对多个表位的总体应答性的场景下是不希望的。例如，参见Rodriguez等人,“病毒诱导的CD8+T-细胞应答中的免疫优势受DNA免疫显著修改并且受γ干扰素调节(Immunodominance in Virus-Induced CD8+T-Cell Responses Is Dramatically Modified by DNA Immunization andIs Regulated by Gamma Interferon)”Journal of Virology,76(9):4251-4259(2002年5月)和Yu等人,“急性HIV-1感染后人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)特异性CD8+T细胞应答的发展和免疫优势的一致模式(Consistent Patterns in the Development andImmunodominance of Human Immunodeficiency Virus Type I(HIV-1)-Specific CD8+T-Cell Responses following Acute HIV-1Infection)”Journal of Virology,76(17):8690-9701(2002年9月)，所述两份文献均通过引用并入本文。因此，设计具有使得抗原呈递细胞可以仅消耗单个粒子的尺寸的粒子将允许抗原呈递细胞群呈递多个抗原种类。给定的抗原呈递细胞将仅摄取并呈递有限数目的抗原种类，例如，少于5个种类，少于3个种类，通常单个种类。

实现所需结果的最佳粒子尺寸可以根据正在呈递的肽的电荷而变化，例如，带正电荷的肽可以比中性肽或带负电荷的肽更容易地被抗原呈递细胞摄入。在一些实施方案中，针对实现排他性摄取的微球尺寸来单独地优化每种肽，并且因此尽管肽种类的尺寸将被狭义地限定，但是多个微球/肽组合的制剂仍可能在尺寸方面不均一。

最佳的粒子尺寸可以取决于消耗粒子的抗原呈递细胞的类型。三个主要类别的抗原呈递细胞是树状细胞、巨噬细胞和B细胞。然而，可以针对任何类型的抗原呈递细胞，包括而不限于不成熟的树状细胞、单核细胞、成熟的髓样树状细胞等，来优化粒子的尺寸。在一些实施方案中，针对消耗粒子的抗原呈递细胞的类型来优化粒子的尺寸。在其他实施方案中，针对消耗粒子的抗原呈递细胞的类型未优化粒子的尺寸。

三个主要类别的抗原呈递细胞是树状细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞，但是树状细胞在细胞-细胞基础上明显更有效，并且是激活初始T细胞的唯一抗原呈递细胞。DC前体从骨髓移行并在血液中循环至体内特定部位，在那里该DC前体成熟。这种运输受趋化因子受体和粘附分子的表达指导。暴露于抗原和激活信号时，DC被激活，并离开组织以借助输入淋巴管(afferent lymphatics)迁移至T细胞丰富的引流淋巴结的副皮质区。激活的DC随后分泌涉及T细胞归巢(homing)和激活的趋化因子和细胞因子，并且向T细胞呈递处理的抗原。本发明的粒子组提供关于怎样向T细胞最佳呈递处理的抗原以获得所需免疫应答的信息。

DC通过上调共刺激分子(CD40、CD80和CD86)而成熟，并且迁移至组织化淋巴组织的T细胞区域，在那里，DC激活初始T细胞并且诱导效应子免疫应答。然而，在不存在这类炎性信号或传染性信号的情况下，DC在次级淋巴组织中呈递自身抗原，用于诱导并维持自身耐受。树状细胞包括髓样树状细胞和浆细胞样树状细胞。

出于本发明的目的，例如确定APC对任何制剂(包括疫苗制剂)的粒子的摄取，可以使用任一个种类的APC，包括而不限于不成熟的DC、单核细胞、成熟的髓样DC、成熟的pDC等。例如参见Foged等人(2005)International Journal of Pharmaceutics 298(2):315-322；Reece等人(2001)Immunology and Cell Biology 79:255–263；Tel等人(2010)J.Immunol.184:4276-4283，所述每篇文献通过引用特别并入本文。

在一些情况下，粒子的尺寸使得树状细胞将摄取一个且仅摄取一个粒子，对于人类系统而言，所述粒子通常是基本上为球状且直径在11微米±20％、

±10％、±5％、±2％或±1％的范围内的粒子。

组合物

本公开提供包含粒子的个性化癌症疫苗组合物，所述粒子包含材料和新生抗原，其中新生抗原由材料包封。

在一些实施方案中，例如通过在形成粒子之前混合新生抗原和材料，将新生抗原嵌入材料中。在其他实施方案中，新生抗原与粒子的表面偶联。该表面可以任选地被构造化(texture)，以某种程度模拟感染性细菌、病毒或其他病原体的表面。

粒子的材料可以是多种组合物(例如聚合物)中的任一种。在一些情况下，聚合物是生物相容性聚合物。可用于本发明中的生物相容性聚合物的实施例包括：羟基脂肪族羧酸，或者均聚物或共聚物，如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(dl-丙交酯/乙交酯)、聚(乙二醇)；多糖，例如凝集素，糖胺聚糖，例如壳聚糖；纤维素和丙烯酸酯聚合物等。在一些情况下，生物相容性聚合物是聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)(PLGA)、聚己内酯、聚乙交酯、聚乳酸或聚-3-羟基丁酸酯。在一些情况下，粒子包含两种或更多种不同的材料。

在一些实施方案中，粒子是微球。微球可以基本上为球状。微球可以具有一定范围的直径，例如，在1微米(即微米)至100微米的范围内的直径。在一些情况下，微球的直径介于2微米和50微米之间、介于2微米和35微米之间、介于2微米和20微米之间、介于2微米和15微米之间、介于2微米和10微米之间、介于4微米和35微米之间、介于4微米和20微米之间、介于4微米和15微米之间、介于4微米和10微米之间、介于8微米和20微米之间、介于8微米和15微米之间、介于10微米和20微米之间、介于10微米和15微米之间或介于9和13微米之间。粒子的直径可以为约4微米、约6微米、约8微米、约10微米、约11微米、约12微米、约14微米、约16微米、约18微米、约20微米、约22微米、约24微米、约26微米、约28微米或约30微米。粒子的直径可以在从10微米±20％至25微米±20％的范围内。粒子的直径可以在11微米±20％、±10％、±5％、±2％或±1％的范围内。

粒子尺寸可以被选择成：(a)足够小，从而粒子能够由抗原呈递细胞摄取和处理；和(b)足够大，使得APC通常将摄取不超过一个粒子。粒子的尺寸可以被设计成使得抗原呈递细胞(如树状细胞)可以仅消耗单个粒子。因此，设计具有使得抗原呈递细胞可以仅消耗单个粒子的尺寸的粒子将允许抗原呈递细胞群呈递多种新生抗原。给定的抗原呈递细胞将仅摄取并呈递有限数目的新生抗原，例如，少于5种，少于3种，通常单一新生抗原。在一些情况下，粒子具有使得树状细胞将仅摄取单个粒子的尺寸。

特定肽或肽类别的最佳尺寸可以通过各种方法来经验地确定。例如，两种不同的肽可以用两种不同的荧光团可检测地标记，并且用来制备本发明的粒子。将粒子的混合物提供给抗原呈递细胞，随后通过光学显微镜、流式细胞术等观察该抗原呈递细胞，以确定任何单个APC中是否存在单个荧光团或是否存在多个荧光团，在所述单个APC中选择提供排他性摄取的粒子尺寸。也可以例如通过为不同的T细胞系提供具有同源抗原的粒子并且确定一个或两个细胞系是否被APC激活来执行功能检测。

为了确定对粒子所需的精确尺寸，可以使用多种类型的标记。除上文所提及的荧光团之外，可以用一般称作量子点的半导体纳米晶体执行标记。实施该实验的目的是确定抗原呈递细胞(如巨噬细胞)可以仅消耗单个粒子的尺寸。如果巨噬细胞不能消耗粒子，则尺寸可能太大。如果巨噬细胞可以消耗超过一个粒子，则尺寸可能太小。

实现所需结果的最佳粒子尺寸可以根据正在呈递的新生抗原的电荷改变，例如，带正电荷的新生抗原可以比中性新生抗原或带负电荷的新生抗原更容易地被抗原呈递细胞摄入。在一些实施方案中，针对实现排他性摄取的微球尺寸来单独地优化每种新生抗原，并且因此尽管将狭义地限定新生抗原的尺寸，但是多个粒子/新生抗原组合的制剂在尺寸方面仍可以是异质的。

粒子的最佳尺寸可以取决于消耗粒子的抗原呈递细胞的类型。三个主要类别的抗原呈递细胞是树状细胞、巨噬细胞和B细胞。然而，可以针对任何类型的抗原呈递细胞，包括而不限于未成熟的树状细胞、单核细胞、成熟的髓样树状细胞等，来优化粒子的尺寸。在一些实施方案中，针对消耗粒子的抗原呈递细胞的类型来优化粒子的尺寸。在其他实施方案中，针对消耗粒子的抗原呈递细胞的类型未优化粒子的尺寸。

在一些实施方案中，个性化癌症疫苗包含第一粒子和第二粒子。这些粒子在尺寸方面可以是异质的或同质的，通常为异质的，其中变化性可以不超过直径的100％，不超过直径的50％、不超过直径的20％、不超过直径的10％、不超过直径的2％等。粒子尺寸的直径可以是约8微米、约10微米、约12微米、约14微米、约15微米、约16微米、约17微米、约18微米、约20微米、不超过约25微米。

在一些情况下，个性化癌症疫苗包含第一粒子和第二粒子，第一粒子含有第二粒子中不存在的第一新生抗原，并且第二粒子含有第一粒子中不存在的第二新生抗原。在一些情况下，每个粒子仅含有单一新生抗原。

另外，本公开提供粒子组。在一些情况下，组中的粒子可以全部具有相同的尺寸，或组中的全部粒子可以具有在相同范围内的尺寸。在其他情况下，组中的粒子可以具有不同的尺寸，例如该组中的至少一个粒子的尺寸与至少一个其他粒子的尺寸不同。

在一些情况下，组中的全部粒子均可以包含相同的新生抗原。在一些情况下，组中的粒子可以包含不同的新生抗原，例如第一粒子包含未经第二粒子包封的第一新生抗原，并且第二粒子包含在第一粒子中不存在的第二新生抗原。这样，粒子组中的多个粒子可以含有多个新生抗原，如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个或更多个新生抗原。另外，可以组合来自多个组的粒子，以便形成新的粒子组。

在一些实施方案中，创建分别包含第一新生抗原组和第二新生抗原组的第一粒子组和第二粒子组。第一粒子组和第二粒子组随后被组合成使得所得到的粒子组合是含有第一新生抗原和第二新生抗原的个性化癌症疫苗。也可以使用分别包含第三、第四、第五、第六等新生抗原的三、四、五、六或更多个粒子组，来制造这种粒子组合，使得个性化癌症疫苗含有三、四、五、六或更多种新生抗原。个性化癌症疫苗还可以仅含有单一新生抗原。另外，个性化癌症疫苗中的多个粒子可以含有具备尺寸、材料和新生抗原的任何组合的粒子。

在一些情况下，个性化癌症疫苗还包含一种或多种抗生素，以防止疫苗的生产和储存期间的细菌生长。本领域技术人员将认识到，可以随本发明使用多种抗生素组合物。

在一些情况下，个性化癌症疫苗还包含一种或多种防腐剂、一种或多种稳定剂或其组合，以帮助疫苗在疫苗的储存期间保持不变。数种防腐剂是可用的，包括硫柳汞(thiomersal)、苯氧乙醇(phenoxyethanol)和甲醛。谷氨酸单钠(MSG)和2-苯氧乙醇作为稳定剂用于少数疫苗中，以帮助疫苗在疫苗暴露于热、光、酸度或湿度时保持不变。苯氧乙醇是可以与个性化癌症疫苗组合的另一种防腐剂。硫柳汞是一种含汞防腐剂，该硫柳汞被添加至含有超过一个剂量的疫苗小瓶中以防止可能有害细菌的污染和生长。硫柳汞对细菌更有效，具有更好的保质期，并且改进疫苗稳定性、效价和安全性，但在美国、欧盟和一些其他富裕国家，由于硫柳汞的汞含量，作为防范措施，硫柳汞不再被用作儿童疫苗中的防腐剂。尽管已经做出硫柳汞导致自闭症的争论性主张，但没有令人信服的科学证据支持这些断言。

在一些情况下，个性化癌症疫苗还包含一种或多种药学可接受的载体，如盐水、林格液(Ringer’s solution)和右旋糖溶液等。通常，个性化癌症疫苗被配制成用于通过注射或吸入的给药，例如，腹腔内、静脉内、皮下、肌内等。因此，这些组合物优选地与药学可接受的载体(如盐水、林格液和右旋糖溶液等)组合。

在一些情况下，个性化癌症疫苗还包含药学可接受的赋形剂。如本领域熟知的，药学可接受的赋形剂是相对惰性的物质，该赋形剂促进药理学有效物质的给药。例如，赋形剂可以提供形式或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿与乳化剂、改变渗透压浓度(osmolarity)的盐、包封剂、缓冲剂和皮肤渗透增强剂。Remington’sPharmaceutical Sciences第19版，编者Mack Publishing(1995)中阐述了用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂。以下赋形剂通常存在于生成免疫应答的组合物(如疫苗制备物)中。铝盐或凝胶作为佐剂添加。添加佐剂以促进对疫苗的应答更早、更强力应答及更持久的免疫应答；佐剂允许更低的疫苗剂量。向一些疫苗添加抗生素以防止在疫苗的生产和储存期间细菌的生长。卵蛋白存在于流感疫苗和黄热病疫苗中，因为这些疫苗是使用鸡蛋制备的。可能存在其他蛋白。甲醛用来为类毒素疫苗灭活细菌产物。甲醛还用来杀死可能在生产期间污染疫苗的不利病毒和细菌。谷氨酸单钠(MSG)和2-苯氧乙醇作为稳定剂用于少数疫苗中，以帮助疫苗在疫苗暴露于热、光、酸度或湿度时保持不变。硫柳汞是一种含汞防腐剂，该硫柳汞被添加至含有超过一个剂量的疫苗小瓶中以防止可能有害细菌的污染和生长。

治疗方法

本发明还包括治疗癌症患者的方法，所述方法包括向患者施用如本文所述的个性化癌症疫苗。患者因患有癌症而需要或将需要这种治疗。

可以通过多种方法向患者施用个性化癌症疫苗，所述方法包括但不限于经口、静脉内、腹腔内、肌内、鞘内、皮下、局部、皮肤(cutaneously)、经皮(transdermally)、直肠、阴道、经眼、通过口腔、通过鼻、或任何其他途径。在一些情况下，可以配制个性化癌症疫苗供经口、静脉内、腹腔内、肌内、鞘内、皮下、局部、皮肤、经皮、直肠、阴道、肠胃外、鼻-咽、肺、经眼、通过口腔、通过鼻或通过任何其他途径施用。

肠胃外施用途径包括但不限于电注射(离子导入)或直接注射(如直接注入中央静脉导管、静脉内、肌内、腹膜内、真皮内或皮下注射)。适于肠胃外施用的组合物包括但不限于药学可接受的无菌等渗溶液。这类溶液包括但不限于用于组合物注射的盐水和磷酸盐缓冲盐水。

鼻-咽和肺施用途径包括但不限于吸入、经支气管和经肺泡途径。本发明包括适于通过吸入施用的组合物，所述组合物包括但不限于用于吸入的各种类型气溶胶，以及用于递送系统的粉末形式。适于通过吸入施用的装置包括但不限于雾化器和气化器。填充有粉末的雾化器和气化器是适合用于粉末吸入递送的多种装置之一。

特定制剂的有效量和施用方法可以基于个体患者和本领域技术人员显而易见的其他因素改变。给予每位患者的绝对量取决于药理特性，如生物利用度、清除率和施用途径。

可以基于患者病史、对一次或多次既往施用个性化癌症疫苗的应答或其他临床参数，调整施用个性化癌症疫苗的剂量、时程等。

在一些情况下，个性化癌症疫苗可以与一种或多种额外的组合物共施用至患者。如本文所用，共施用涉及将个性化癌症疫苗与一种或多种额外的组合物组合并将该组合施用至患者，以及还涉及分别施用个性化癌症疫苗和一种或多种额外的组合物两者，例如，个性化癌症疫苗的施用和额外组合物的施用相隔某个量的空间、时间或这两者。

在一些实施方案中，个性化癌症疫苗可以与一种或多种免疫原性剂共施用。如本文所用，免疫刺激剂与免疫刺激剂互换使用。与全部免疫原性组合物一样，特定制剂的免疫有效量和施用方法可以基于个体、待治疗的病症和本领域技术人员显而易见的其他因素改变。待考虑的因素包括免疫原性、施用途径和的待施用的剂数。这些因素为本领域已知并且完全在肿瘤科医生无需过多实验情况下作出这类决定的技能范围内。合适的剂量范围是基于新生抗原提供对癌细胞的免疫应答的所需调节的剂量范围。通常，参考排除载体的剂量中肽的量，剂量范围可以例如是约以下任一范围：0.01至100μg、0.01至50μg、0.01至25μg、0.01至10μg、1至500μg、100至400μg、200至300μg、1至100μg、100至200μg、300至400μg、400至500μg。可替代地，剂量可以是约以下任一量：0.1μg、0.25μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg、5.0μg、10μg、25μg、50μg、75μg、100μg。因此，剂量范围可以是具有约以下任一下限的剂量范围：0.1μg、0.25μg、0.5μg和1.0μg；以及具有约以下任一上限的剂量范围：250μg、500μg和1000μg。给予每位患者的绝对量取决于药理学特性，如生物利用度、清除率和施用途径。

在一些实施方案中，个性化癌症疫苗可以与一种或多种药学可接受的赋形剂共施用。如本领域熟知的，药学可接受的赋形剂是相对惰性的物质，其促进药理学有效物质的施用。例如，赋形剂可以提供形式或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿与乳化剂、改变渗透压浓度的盐、包封剂、缓冲剂和皮肤渗透增强剂。Remington’sPharmaceutical Sciences第19版，编者Mack Publishing(1995)中阐述了用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂。

在一些实施方案中，个性化癌症疫苗可以与一种或多种佐剂共施用。免疫原性组合物可以含有足以加强(potentiate)对免疫原的免疫应答的佐剂的量。佐剂为本领域已知并且包括但不限于水包油乳剂、油包水乳剂、明矾(铝盐)、脂质体和微粒子，所述微粒子包括但不限于聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚丙交酯/多苷(polylactide/polyglycosides)。其他合适的佐剂还包括但不限于MF59、DETOXTM(Ribi)、鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁肽(muramylpeptide)、皂素衍生物(saponin derivatives)、分枝杆菌细胞壁制备物、单磷酰脂A(monophosphoryl lipid A)、分枝菌酸衍生物(mycolic acid derivatives)、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit)、聚磷腈和衍生物和免疫刺激复合体(ISCOM)，如Takahashi等人(1990)Nature 344:873-875描述的那些，以及基于脂质的佐剂和本文所述的其他佐剂。对于兽医用途和动物中抗体的生产，可以使用(完全和不完全)弗氏佐剂的促有丝分裂组分。

在一些实施方案中，个性化癌症疫苗可以与一种或多种免疫调节易化剂(immunomodulatory facilitator)共施用。因此，本发明提供包含多个限定尺寸的微球的组合物，所述微球包含不同的抗原种类和免疫调节易化剂。如本文所用，术语“免疫调节易化剂”指支持和/或增强免疫调节活性的分子。免疫调节易化剂包括但不限于共刺激分子(如细胞因子、趋化因子、靶向蛋白配体(targeting protein ligand)、反式激活性因子、肽和包含修饰型氨基酸的肽)和佐剂(如明矾、脂质乳剂和聚丙交酯/聚乙交酯微粒子)。

在一些情况下，个性化癌症疫苗可以与一种或多种检查点抑制剂共施用，以增加免疫功能。检查点抑制剂可以包括但不限于伊匹木单抗(ipilmumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿特朱单抗(avelumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)。

在一些情况下，治疗方法涉及递送系统的使用。

递送系统

产生用于注射、局部应用、雾化器和气化器的合适装置的方法为本领域已知并且将不加详述。

上文提到的组合物和施用方法意在描述但不限制施用本发明组合物的方法。产生各种组合物和装置的方法在本领域技术人员的能力范围内并且此处不加详述。

开发中存在数个新的递送系统以使疫苗递送更高效。方法包括脂质体和ISCOM(免疫刺激复合体，immune stimulating complex)。其他疫苗递送技术已经导致口服疫苗。脊髓灰质炎疫苗是由未经正式训练的志愿者接种疫苗来开发和测试的；结果是积极的，因为疫苗接种的易度(ease)大幅度增加。采用口服疫苗时，不存在血液污染风险。口服疫苗可能是已经证明更稳定和更不易冻结的固体；这种稳定性降低了对“冷链”(从制造阶段至施用点将疫苗保持在受限的温度范围内所需的资源)的需求，这转而将降低疫苗成本。

可以使用微针方案，其中微针是“制成阵列的尖端突起物，所述尖端突起物可以创建穿过皮肤的疫苗递送路径”。如本文所用，微针(MN)指包含通常长度在从约25至约2000μm范围内的多个微突起物的阵列，所述阵列附接至基础支承件。阵列可以包含10²、10³、10⁴、10⁵个或更多个微针，并且面积可以从约0.1cm²至约100cm²。应用MN阵列至生物膜创建微米尺度的运输路径，所述运输路径容易地允许大分子(如大的多肽(large polypeptides))的运输。微针阵列可以配制为经皮药物递送贴剂(patch)。MN阵列可以可替代地集成在施药器装置(applicator device)内，其中一经启动，所述施药器装置就可以将MN阵列递送至皮肤表面，或者可以将MN阵列应用至皮肤并随后启动该装置以推送MN穿过皮肤。

试剂盒

本公开还提供试剂盒，所述试剂盒包含如本文所述的个性化癌症疫苗和标签，所述标签包含向患者施用个性化癌症疫苗的说明。

应当理解，本发明不限于所述的特定方法学(methodology)、方案、肽、动物物种或属、构建体(construct)和试剂，当然，就其本身而言可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅受所附权利要求限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解那样相同的含义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述的那些相似或等同的任何方法、装置和材料，但现在描述了优选的方法、装置和材料。

出于描述和公开的目的，本文提及的所有出版物均通过引用而并入本文，例如，在出版物中描述和可能结合当前所述发明一起使用的试剂、细胞、构建体和方法学。上文及本文通篇所讨论的出版物仅因其公开先于本申请的提交日而提供。本文中任何内容均不应被解释为承认发明人由于在先发明而没有早于此类公开的权利。

前述内容仅说明了本发明的原理。将理解的是，本领域技术人员将能够想出多种布局，虽然未在本文中明确描述或显示，但所述布局体现本发明的原理并纳入本发明的精神和范围内。另外，本文援引的全部示例和条件性语言均原则上意在辅助读者理解本发明的原理以及发明人为促进现有技术所贡献的构思，并且应被解读为不限于这类特别援引的示例和条件。另外，本文中援引本发明的原理、方面和实施方案以及本发明的具体示例的全部表述意在涵盖本发明的结构性等同物以及功能性等同物。此外，这类等同物意在包括当前已知的等同物和未来开发的等同物，即，执行相同功能的任何开发的要素，无论其结构如何。因此，本发明的范围不旨在限于本文所示和所述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。