一种原位疫苗及其制备方法
阅读说明：本技术 一种原位疫苗及其制备方法 (In-situ vaccine and preparation method thereof ) 是由 汪勇 马洁 高明远 王杨云 张乐帅 于 2021-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种原位疫苗及其制备方法,该制备方法包括培养并灭活的肿瘤细胞抗原原液、制备纳米材料@Mal溶液后加入佐剂合成纳米材料@Mal-佐剂颗粒,然后将肿瘤细胞抗原原液和纳米材料@Mal-佐剂颗粒按体积比5:1-5:3配比混合孵育,得到纳米材料@Mal-佐剂@抗原。本发明的原位疫苗制备方法,制备方法绿色、简单、易于操作。且本发明的原位疫苗制备方法适用于多种肿瘤,具有普适性。纳米材料@Mal表面的马来酰亚胺可与蛋白质上的巯基形成稳定的硫醚键从而捕获肿瘤相关抗原,提高抗原利用率,且能够实现佐剂和抗原的共递送。纳米材料@Mal本身可作为佐剂,激活抗原提呈细胞并增强其吞噬,提呈抗原的能力,进一步激活T细胞,提高癌症免疫治疗安全性以及疗效。(The invention relates to an in-situ vaccine and a preparation method thereof, and the preparation method comprises the steps of culturing and inactivating tumor cell antigen stock solution, preparing a nano material @ Mal solution, adding an adjuvant to synthesize nano material @ Mal-adjuvant particles, and then mixing and incubating the tumor cell antigen stock solution and the nano material @ Mal-adjuvant particles according to the volume ratio of 5:1-5:3 to obtain the nano material @ Mal-adjuvant @ antigen. The preparation method of the in-situ vaccine is green, simple and easy to operate. The in-situ vaccine preparation method is suitable for various tumors and has universality. The maleimide on the surface of the nanomaterial @ Mal can form a stable thioether bond with a thiol group on a protein so as to capture a tumor-associated antigen, improve the utilization rate of the antigen, and realize the co-delivery of an adjuvant and the antigen. The nano material @ Mal can be used as an adjuvant to activate antigen presenting cells and enhance phagocytosis and antigen presenting capability of the antigen presenting cells, further activate T cells, and improve the safety and curative effect of cancer immunotherapy.)
技术领域
本发明涉及一种原位疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
近年来，随着免疫检查点抑制剂及CAR-T的发展，免疫疗法在肿瘤治疗领域显示了巨大的前景。肿瘤免疫治疗的新策略发展迅速，已经成为肿瘤治疗最受瞩目的领域。
为了实现最理想的抗肿瘤免疫效果，通常采用“被动”免疫疗法如过继性细胞疗法，基因工程T细胞等直接攻击肿瘤细胞，或采用“主动”免疫疗法如细胞因子、肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂等调节并激活免疫系统。肿瘤疫苗，作为一种主动的肿瘤免疫治疗策略随着越来越多肿瘤新抗原的鉴定取得了长足的发展。常见的肿瘤疫苗类型包括蛋白质/肽疫苗、细胞疫苗(肿瘤细胞和免疫细胞)和遗传疫苗(DNA和RNA)。虽然这些疫苗在一些临床试验中产生了可接受的治疗效果，但其总体临床疗效并不令人满意。主要原因包括：(1)对“冷”肿瘤患者进行了疫苗接种，使患者对疫苗接种应答较低或产生无效的特异性免疫反应。(2)使用了不理想的疫苗接种系统，降低了疫苗的免疫原性和有效性。(3)疫苗对肿瘤内源性自身抗原具有免疫耐受性。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种原位疫苗及其制备方法，制得的原位疫苗生物相容性好，抗原利用率高，可增强免疫原性，提高癌症免疫治疗安全性以及疗效。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种原位疫苗制备方法，包括以下步骤：
S1、培养：复苏并在培养液中培养肿瘤细胞达到对数生长期，使用消化液收集细胞并清洗得到肿瘤细胞液；
S2、灭活：对步骤S1收集的所述肿瘤细胞液进行灭活处理，并将所述灭活处理后的肿瘤细胞液进行孵育，对所述孵育的肿瘤细胞液离心取上清液，得到灭活的抗原原液；
S3、制备纳米材料@Mal溶液：使用纳米材料与PEG-Mal配体按质量比1:10-1:15配比并溶解形成混合液，加入10-15倍所述混合液体积的环己烷使所述混合液沉淀，离心去除上清液，得到沉淀物，所述沉淀物干燥后加超纯水溶解后离心并过膜，再超滤得到纳米材料@Mal溶液，于2-6℃保存备用；
S4、合成纳米材料@Mal-佐剂颗粒：对步骤S3制备的纳米材料@Mal溶液加入佐剂溶液，室温搅拌，进行超滤得到合成的纳米材料@Mal-佐剂颗粒，于2-6℃保存备用；
S5、制备疫苗：使用所述步骤S2中制得的所述抗原原液与所述步骤S4中合成的所述纳米材料@Mal-佐剂颗粒按体积比5:1-5:3配比混合，孵育并进行超滤，得到纳米材料@Mal-佐剂@抗原。
进一步地，所述步骤S1中所述消化液为质量分数为0.2％的胰酶溶液。
进一步地，所述步骤S2中灭活处理方式为微波细胞灭活法，电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法，高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法，酶学消化细胞灭活法中至少一种。
进一步地，所述步骤S2中灭活处理方式为使用X射线辐照。
进一步地，所述步骤S3中纳米材料为油相纳米材料，纳米材料@Mal溶液为水相。
进一步地，所述步骤S3中纳米材料为Fe3O4、γ-Fe2O3、CuS、MnO2和Al2O3中的任一种。
进一步地，所述步骤S3中超滤使用截留分子量为30k的超滤管，转速为3000-5000rpm。
进一步地，所述步骤S4中佐剂为STING或TLR中的任一种。
进一步地，所述步骤S5中孵育时长为2-6h。
本发明还提供一种如上所述任一种原位疫苗制备方法制备的用于医学诊断应用的原位疫苗。
本发明的有益效果在于：本发明的原位疫苗制备方法，制备方法绿色、简单、易于操作。且本发明的原位疫苗制备方法适用于多种肿瘤，具有普适性。纳米材料@Mal表面的马来酰亚胺可与蛋白质上的巯基形成稳定的硫醚键从而捕获肿瘤相关抗原，提高了抗原利用率，且能够实现佐剂和抗原的共递送。纳米材料@Mal本身可作为佐剂，激活抗原提呈细胞并增强其吞噬，提呈抗原的能力，进一步激活T细胞，提高癌症免疫治疗安全性以及疗效。纳米材料@Mal还可应用于医学诊断。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为实施例一制备合成的Fe3O4@Mal-CpG纳米粒子的电镜图。
图2为实施例一制备合成的Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG的水合粒径图和Zeta电势图表征，其中，图2(a)为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG的水合粒径图，图2(b)为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG的电势图表征。
图3为实施例一制备合成的纳米材料的紫外吸收光谱。
图4为实施例一制备合成的纳米粒子体外捕获抗原定量图，其中，图4(a)为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG体外捕获4T1抗原定量图；图4(b)为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG体外捕获803抗原定量图；图4(c)为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG体外捕获B16F10抗原定量图；图4(d)为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG体外捕获MC38抗原定量图；图4(e)为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG体外捕获L1210抗原定量图；图4(f)为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG体外捕获B16F10-OVA抗原定量图。
图5为实施例一制备合成的纳米粒子捕获乳腺癌肿瘤抗原前后的粒径和电势图表征，其中，图5(a)为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG体外捕获4T1抗原前后及4T1抗原的粒径图，图5(b)为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG体外捕获4T1抗原及4T1抗原的Zeta电势图。
图6为实施例一制备合成的原位疫苗在体外刺激树突状细胞(DCs)成熟的表征，其中，图6(a)为DCs表面共刺激分子CD80表达结果，图6(b)为DCs表面共刺激分子CD86表达结果。
图7为实施例一与实施例三制备的纳米粒子体外捕获抗原的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明提供一种原位疫苗制备方法，包括以下步骤：
S1、培养：复苏并在培养液中培养肿瘤细胞达到对数生长期，使用消化液收集细胞并清洗得到肿瘤细胞液；
S2、灭活：对步骤S1收集的肿瘤细胞液进行灭活处理，并将灭活处理后的肿瘤细胞液进行孵育，对孵育的肿瘤细胞液离心取上清液，得到灭活的抗原原液；
S3、制备纳米材料@Mal溶液：使用纳米材料与PEG-Mal配体按质量比1:10-1:15配比并溶解形成混合液，加入10-15倍混合液体积的环己烷使混合液沉淀，离心去除上清液，得到沉淀物，沉淀物干燥后加超纯水溶解后离心并过膜，再超滤得到纳米材料@Mal溶液，于2-6℃保存备用；
S4、合成纳米材料@Mal-佐剂颗粒：对步骤S3制备的纳米材料@Mal溶液加入佐剂溶液，室温搅拌，进行超滤得到合成的纳米材料@Mal-佐剂颗粒，于2-6℃保存备用；
S5、制备疫苗：使用步骤S2中制得的抗原原液与步骤S4中合成的纳米材料@Mal-佐剂颗粒按体积比5:1-5:3配比混合，孵育并进行超滤，得到纳米材料@Mal-佐剂@抗原。
其中，肿瘤细胞可从任何肿瘤组织进行分离提取，如肿瘤细胞可为卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌或黑色素瘤细胞的一种或多种，但不仅限于此，还可以为其他癌症细胞。使用完全培养基对肿瘤细胞进行培养，当肿瘤细胞培养到对数生长期时，且通过显微镜观察发现肿瘤细胞铺满培养皿底部后，使用PBS缓冲液清洗未贴壁的肿瘤细胞，然后使用消化液将贴壁的肿瘤细胞变为悬浮状态，离心收集，并使用PBS缓冲液多次洗涤，使培养皿中的完全培养基成分去除，使得肿瘤细胞悬浮在PBS缓冲液中形成肿瘤细胞液，并计数。需要说明的是，此处使用的消化液为质量分数为0.2％的胰酶溶液；且清洗的溶液不限于PBS，还可以为无菌生理盐水，但并不只限于这些溶剂，可以使用各种不引起机体过敏反应的具有缓冲能力的溶剂。
步骤S2中对肿瘤细胞液进行灭活处理，灭活处理方式为微波细胞灭活法，电磁波细胞灭活法，激光细胞灭活法，高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融、匀浆、离心、沉淀细胞灭活法，酶学消化细胞灭活法中至少一种。优选的，灭活处理方式为使用X射线辐照，使得肿瘤细胞死亡破裂。将经X射线辐照后的肿瘤细胞液放进细胞培养箱中孵育0.5-1h，使得细胞中物质完全暴露在肿瘤细胞液，使用3000-5000rpm离心10min，去除肿瘤细胞液中的细胞和细胞碎片，收集上清液并再次离心，进一步去除溶液中的细胞碎片，得到灭活的抗原原液。
称取油相的纳米材料在离心管中，向离心管中加入丙酮溶液与油相纳米材料反应，使得包裹在油相内的纳米材料沉淀，然后以5000g离心力转速离心7-10min去除上清液，向离心管中加入有机溶剂使得沉淀完全溶解。需要说明的是，油相纳米材料中混有环己烷。称取合适质量的PEG-Mal配体，油相纳米材料与PEG-Mal配体的质量比为1:10-1:15，向PEG-Mal配体中滴加有机溶剂使PEG-Mal配体完全溶解，需要说明的是，纳米材料和PEG-Mal溶于同一种有机溶剂。将溶于有机溶剂的纳米材料加入溶于同一种有机溶剂的PEG-Mal中形成混合液，超声1-2h，使其完全混匀。冷却至室温，在混合液中加入10-15倍体积的环己烷沉淀，3000-5000rpm离心10min去除上清液得到沉淀物。沉淀物干燥后加入超纯水使沉淀物完全溶解，离心并过膜。使用30K的超滤离心管进行离心，转速为3000-5000rpm，每次离心5-7min，超滤3-4次，去除溶液中多余的环己烷，最终得到水相的纳米材料@Mal溶液，并将制备的纳米材料@Mal溶液在2-6℃下保存。纳米材料作为载体，可同时负载佐剂和抗原，实现佐剂和抗原的共递送。需要说明的是，纳米材料优选为磁性纳米材料，磁性便于活体磁共振成像，用于检测肿瘤体积变化。步骤S3中纳米材料为Fe3O4、γ-Fe2O3、CuS、MnO2和Al2O3中的任一种，还可以为其他磁性纳米材料。使用Fe3O4纳米粒子等做磁性纳米材料时，Fe3O4纳米粒子本身还可以作为佐剂使用。
步骤S4中的佐剂为STING或TLR中的任一种，还可以使用其他的佐剂得到纳米材料@Mal-佐剂颗粒。搅拌可使用磁力搅拌，在不仅限于此，还可以使用其他搅拌方式，在此不一一列举
步骤S5中将步骤S2中得到的抗原原液加入到步骤S4中合成的纳米材料@Mal-佐剂颗粒中孵育2-6h，并进行多次超滤去除未与纳米材料@Mal-佐剂颗粒结合的抗原，最后收集溶液，得到纳米材料@Mal-佐剂@抗原。
本发明还提供一种如上任一种原位疫苗制备方法制备的用于医学诊断应用的原位疫苗。
下面以具体实施例进行详细说明：
实施例一
按照下述步骤制备原位疫苗：
(a)复苏并培养乳腺癌肿瘤细胞(4T1)达到其对数生长期，通过显微镜观察4T1细胞铺满培养皿底部后，使用PBS缓冲液清洗未贴壁的肿瘤细胞，然后使用使用质量分数为0.2％的胰酶溶液消化将贴壁的肿瘤细胞变为悬浮状态，离心收集，并使用PBS缓冲液4次洗涤，使培养皿中的完全培养基成分去除，使得肿瘤细胞悬浮在PBS缓冲液中形成肿瘤细胞液，然后进行计数，调整细胞量约为4M；
(b)对收集的细胞进行X射线照射，之后放入细胞培养箱中孵育0.5h，随后离心去除细胞以及细胞碎片，收集上清液再次离心去除残留的细胞碎片，待用；
(c)首先吸取1mL浓度为8.2mg/mL的油相Fe3O4到15mL离心管中，油相Fe3O4含有环己烷，向离心管中加入10mL的丙酮溶液至完全沉淀，然后以5000g转速离心5min去除上清液，再加入1mL四氢呋喃溶液至沉淀完全溶解。然后称取82mg的PEG-Mal配体，此时油相Fe3O4和PEG-Mal配体的质量比为＝1﹕10，并向其中滴加四氢呋喃溶液振荡使其完全溶解。将溶于四氢呋喃的Fe3O4加入到同样溶于四氢呋喃的PEG-Mal中，超声1h。冷却至室温，随后加入10倍体积的环己烷，离心去除上清液，待沉淀干燥后加入适量超纯水使其完全溶解，然后离心并进行过膜。最后用30K的超滤管离心，转速为4000rpm，时间为5min，超滤3次，以除去多余的环己烷。最终获得水相Fe3O4@Mal溶液，并4℃保存备用；
(d)取摩尔浓度为100μM的CpG溶液150μL加入到摩尔浓度为35mM，体积为430μL的Fe3O4@Mal溶液(c)中，室温搅拌。随后，对收集的溶液进行超滤三次。最后制备成Fe3O4@Mal-CpG纳米颗粒，4℃保存备用；
(e)将收集到的上清液(b)加入到合成的Fe3O4@Mal-CpG纳米材料(d)中，上清液(b)和Fe3O4@Mal-CpG纳米材料的体积比为5:1，共孵育2h，随后超滤三次去除未与纳米材料结合的抗原，最后收集溶液，得到Fe3O4@[email protected]疫苗。
实施例二
按照下述步骤制备原位疫苗：
(a)同实施例一；
(b)同实施例一；
(c)首先吸取2mL浓度为6.6mg/mL的油相Fe3O4到15mL离心管中，油相Fe3O4含有环己烷，向离心管中加入15mL的丙酮溶液至完全沉淀，然后以5000g转速离心5min去除上清液，再加入2mL四氢呋喃溶液至沉淀完全溶解。然后称取158mg的PEG-Mal配体，此时油相Fe3O4和PEG-Mal配体的质量比为＝1﹕12，并向其中滴加四氢呋喃溶液振荡使其完全溶解。将溶于四氢呋喃的Fe3O4加入到同样溶于四氢呋喃的PEG-Mal中，超声1h。冷却至室温，随后加入10倍体积的环己烷，离心去除上清液，待沉淀干燥后加入适量超纯水使其完全溶解，然后离心并进行过膜。最后用30K的超滤管离心，转速为4000rpm，时间为5min，超滤3次，以除去多余的环己烷。最终获得水相Fe3O4@Mal溶液，并4℃保存备用；
(d)同实施例一；
(e)同实施例一。
实施例三
按照下述步骤制备原位疫苗：
(a)同实施例一；
(b)同实施例一；
(c)同实施例一；
(d)同实施例一；
(e)将收集到的上清液(b)加入到合成的Fe3O4@Mal-CpG纳米材料(d)中，上清液(b)和Fe3O4@Mal-CpG纳米材料的体积比为5:2，共孵育2h，随后超滤三次去除未与纳米材料结合的抗原，最后收集溶液，得到Fe3O4@[email protected]疫苗。
实施例一至实施例三制备得到的Fe3O4@Mal-CpG纳米粒子尺寸小。请参见图1，为实施例一制备合成的Fe3O4@Mal-CpG纳米粒子的电镜图，尺寸约为3.9±0.6nm，尺寸大小均匀、稳定性高、生物相容度高。
请参见图2，为实施例一制备合成的Fe3O4@Mal纳米材料和Fe3O4@Mal-CpG纳米粒子的水合粒径图和Zeta电势图表征。观察图2(a)，Fe3O4@Mal纳米材料和Fe3O4@Mal-CpG纳米粒子的水合粒径大小相似，不同尺寸的粒径分布相似，即偶联CpG材料使得Fe3O4@Mal粒径未发生较大变化。观察图2(b)，为Fe3O4@Mal和Fe3O4@Mal-CpG的Zeta电势图，Fe3O4@Mal的Zeta电位约为-1mV，Fe3O4@Mal-CpG的Zeta电位约为-7mA。从稳定度角度来看，Zeta电位绝对值越大，溶液越稳定，即Fe3O4@Mal合成为Fe3O4@Mal-CpG后，溶液更为稳定。
请参见图3，为Fe3O4@Mal纳米材料、标记有Cy5.5荧光染料的CpG材料及Fe3O4@Mal纳米材料、标记有Cy5.5荧光染料的CpG材料合成的标记有Cy5.5荧光染料Fe3O4@Mal-CpG纳米粒子的紫外吸收光谱图，在350-800nm范围内检测紫外吸收光谱，观察发现，Fe3O4@Mal-CpGCy5 . 5纳米粒子的吸收峰同时含有Fe3O4@Mal和标记有Cy5.5荧光染料的CpG的吸收峰特征，证明CpG Cy5 . 5成功修饰到Fe3O4@Mal纳米材料上，从而间接证明成功合成了Fe3O4@Mal-CpG纳米粒子。
请参见图4(a)至图4(f)，为实施例一制备的纳米粒子体外捕获抗原定量图。观察图发现，分别使用制备的纳米粒子与4T1、803、B16F10、MC38、L1210、B16F10-OVA肿瘤细胞进行孵育，发现纳米粒子都可以捕获抗原，对于不同的肿瘤细胞都可以进行捕获，对肿瘤细胞具有普适性。
请参见图5，为实施例一制备的纳米粒子捕获乳腺癌肿瘤细胞前后粒径和Zeta电势图表征。观察图5(a)，Fe3O4@Mal与Fe3O4@Mal-CpG纳米粒子捕获乳腺癌肿瘤细胞抗原后，粒径变大。观察图5(b)，Fe3O4@Mal纳米粒子捕获乳腺癌肿瘤细胞抗原后，电势绝对值大于Fe3O4@Mal纳米粒子，小于乳腺癌肿瘤细胞的电势绝对值；Fe3O4@Mal-CpG纳米粒子捕获乳腺癌肿瘤细胞后，电势绝对值小于Fe3O4@Mal-CpG纳米粒子和乳腺癌肿瘤细胞的电势绝对值。
请参见图6，为实施例一制备的原位疫苗在体外刺激树突状细胞(DCs)成熟的表征。从图6(a)和图6(b)中可以看出，ctrl作为对比，实施例中制备的纳米粒子Fe3O4@Mal与Fe3O4@Mal-CpG可以使DCs表面共刺激分子CD80和CD86表达升高，并在体外与乳腺癌肿瘤抗原形成原位疫苗后均可进一步上调CD80和CD86的表达，激活DCs细胞成熟。即Fe3O4@[email protected]、Fe3O4@[email protected]均可进一步上调CD80和CD86的表达，激活DCs细胞成熟。同时证明，Fe3O4不仅可以当作载体，共递送抗原与佐剂，而且其本身也可以当作佐剂，刺激DCs成熟，提高抗原利用率。
请参见图7，为实施例一与实施例三制备的纳米粒子体外捕获抗原定量对比图。实施例三步骤(e)中Fe3O4@Mal-CpG纳米材料添加量为实施例一中Fe3O4@Mal-CpG纳米材料的添加量的两倍，观察图7，随着Fe3O4@Mal-CpG纳米材料的增多，其捕获的抗原会增加。
本发明还提供一种如上的原位疫苗制备方法制备得到的用于医学诊断应用的原位疫苗。
综上，本发明的原位疫苗制备方法，制备方法绿色、简单、易于操作。且本发明的原位疫苗制备方法适用于多种肿瘤，具有普适性。纳米材料@Mal表面的马来酰亚胺可与蛋白质上的巯基形成稳定的硫醚键从而捕获肿瘤相关抗原，提高了抗原利用率，且能够实现佐剂和抗原的共递送。纳米材料@Mal本身可作为佐剂，激活抗原提呈细胞并增强其吞噬，提呈抗原的能力，进一步激活T细胞，提高癌症免疫治疗安全性以及疗效。纳米材料@Mal还可应用于医学诊断。
以上所述实施例的各技术特征以及各检测项目可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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