瑞香素在制备防治椎间盘退变药物中的应用
阅读说明：本技术 瑞香素在制备防治椎间盘退变药物中的应用 (Application of daphnetin in preparation of medicine for preventing and treating intervertebral disc degeneration ) 是由 王建儒 陈顺伦 陈凡 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,具体涉及瑞香素在制备防治椎间盘退变药物中的应用,本发明提供了瑞香素的新用途,即可通过抑制NF-κB通路发挥抗氧化应激、抗炎和凋亡作用,从而延缓椎间盘退变,可用于防治椎间盘退变,特别是可制备成防治椎间盘退变药物的形式用于防治椎间盘退变。本发明不仅提供了瑞香素的新应用方向,也为椎间盘退变的治疗提供了一种新的治疗药物和治疗途径。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and particularly relates to application of daphnetin in preparation of a medicament for preventing and treating intervertebral disc degeneration. The invention not only provides a new application direction of daphnetin, but also provides a new therapeutic drug and a new therapeutic approach for the treatment of intervertebral disc degeneration.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及瑞香素在制备防治椎间盘退变药物中的应用。
背景技术
椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IVDD)是引起腰痛(Low BackPain,LBP)的主要原因之一，病理表现为细胞外基质的合成和分解代谢失衡、髓核细胞的凋亡、局部炎症反应和氧化应激增强等。IVDD给人的生理、心理和经济带来了严重的负担，目前对IVDD发生的具体机制仍不明确，此前研究主要集中于生物力学方向和炎症病理等方向，而近来学者开始关注髓核能量代谢与退变发生的联系。目前临床上非手术治疗的疗效并不明确，大多数患者后期仍需行髓核摘除手术，手术不可避免的具有一定创伤性，因此如何有效地防治IVDD已成为脊柱外科领域的一个重要课题。
瑞香素(Daphnetin)又名祖师麻甲素，化学名为7，8-二羟基香豆素(7，8-dithydroxycoumarin)，是瑞香科属植物长白瑞香(Daphne Korean Nakai)的自然提取物，属于香豆素类化合物。瑞香素对疼痛、疟疾、血栓闭塞性脉管炎、心绞痛和类风湿性关节炎等有治疗作用。但目前尚未有关于瑞香素对腰痛或椎间盘退变的有治疗作用的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了瑞香素的新用途，即瑞香素可通过抑制NF-κB通路发挥抗氧化应激、抗炎和凋亡作用，从而延缓椎间盘退变，为椎间盘退变提供了新的治疗途径。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了瑞香素在制备防治椎间盘退变药物中的应用。
优选的，所述防治椎间盘退变为通过抑制NF-κB通路发挥抗氧化应激、抗炎和凋亡作用，从而延缓椎间盘退变。
本发明从细胞和动物模型两个层面，以体外和体内两个角度来研究瑞香素对椎间盘的作用和机制，研究结果表明(如图1所示)，瑞香素可通过抑制NF-κB通路发挥抗氧化应激、抗炎和凋亡作用，从而延缓椎间盘退变。提示瑞香素可用于防治椎间盘退变，特别是制备成防治椎间盘退变药物的形式用于防治椎间盘退变。
优选的，所述瑞香素的浓度为2-5μM。在该浓度下瑞香素对细胞的毒性低，安全、无害。
本发明还提供了一种防治椎间盘退变的药物，该药物以瑞香素为主要活性成分。
优选的，还包括其他与瑞香素配伍起协同作用的有效成分。
优选的，还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。即该药物可与药学上可接受的载体或赋形剂混合制备成组合物。
进一步地，上述赋形剂是指可用于药学领域的稀释剂、黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稳定剂等以及一些药用基质。上述载体是药物领域中可得到的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(PLGA)、透明质酸等。
优选的，所述药物的剂型包括但不限于注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂、缓释剂、口服液制剂。上述剂型是指临床上常用的剂型。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了瑞香素的新用途，即可通过抑制NF-κB通路发挥抗氧化应激、抗炎和凋亡作用，从而延缓椎间盘退变，可用于防治椎间盘退变，特别是可制备成防治椎间盘退变药物的形式用于防治椎间盘退变。本发明不仅提供了瑞香素的新应用方向，也为椎间盘退变的治疗提供了一种新的治疗药物和治疗途径。
附图说明
图1为瑞香素延缓椎间盘退变的原理图；
图2为瑞香素对髓核细胞的毒性作用；
图3为瑞香素对TNF-α诱导的氧化应激的逆转作用(β-actin为内参蛋白)；
图4为瑞香素对H2O2诱发的氧化应激的抑制作用；
图5为炎症因子(IL-6和IL-1β)mRNA的表达水平的RT-qPCR检测结果；
图6为炎症因子IL-6蛋白分泌水平的ELISA检测结果；
图7为炎症因子IL-6蛋白质表达水平的WB检测结果(Tublin为内参蛋白)；
图8为瑞香素的抗凋亡效果；
图9为瑞香素对NF-κB通路的抑制作用(β-actin为内参蛋白)；
图10为瑞香素处理后穿刺IVDD模型小鼠的椎间盘退变程度(CTR为对照组，未穿刺；Puncture为穿刺IVDD模型组；Puncture+DAP为建模后腹腔注射DAP组)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1瑞香素(abcam,ab143113)对髓核细胞的作用
(1)髓核细胞的提取和培养
髓核细胞来源于临床手术后取下的椎间盘标本在无菌条件下分离出的髓核组织(获取标本前签署患者的知情同意书且经过中山大学附属第一医院伦理委员会审查批准)或大鼠椎间盘在无菌条件下分离出的髓核组织(取得实验动物中心伦理委员会批准)。
由髓核组织分离髓核细胞的方法为：首先将分离出的髓核组织(一个节段)放置于37℃，5％CO2培养箱内，加入20mL DMEM(含0.2％蛋白酶、10％FBS)消化髓核组织1h。随后再加入20mL另一种DMEM(含0.025％胶原酶、10％FBS)消化15h。最后将其收集入离心管中进行离心(900r/min)，将沉淀重悬后加入含10％FBS的DMEM培养基中，置于37℃，5％CO2培养箱内进行传代培养。铺满培养皿80-90％可进行传代，第三代后部分细胞进行冻存，保存在液氮中，后续使用时直接复苏即可。
(2)瑞香素的细胞毒性
将人或大鼠髓核细胞种在DMEM培养皿中，24h后换上新的DMEM全培养基，然后加入不同浓度(2μM,5μM,10μM,20μM,50μM)的瑞香素(DAP)处理髓核细胞24h，并采用细胞毒性试剂盒(CCK-8)(Dojindo Lab,Japan)检测瑞香素对髓核细胞的毒性。
(3)瑞香素的抗氧化应激、抗炎、抗凋亡作用
将人或大鼠髓核细胞种在DMEM培养皿中，24h后换上新的DMEM全培养基，然后进行以下处理：TNF-α(20μM)处理组为诱导炎症、凋亡细胞模型组，处理24h；H2O2(200μM)诱导组为氧化应激模型组，处理4h；瑞香素处理组，先将瑞香素溶解在DMSO中，母液浓度为10mM，处理时分别将瑞香素的终浓度设置为1μM,2μM,5μM,10μM四个梯度,先用瑞香素处理30min，再加入TNF-α(24h)或H2O(2h)。处理完成后，根据实验需要直接提取总蛋白或总RNA，最后，通过蛋白免疫印迹(Western blot,WB)来检测目的蛋白(超氧化物歧化酶SOD1)的表达情况；用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)来检测目的mRNA(IL-1β、IL-6)的表达情况；用细胞内氧化应激探针DCFH-DA(Sigma,D6883)来检测细胞内的氧化应激水平；用ELIA试剂盒(MultiSciences，EK301B/3-96；EK306/3-96)来检测炎症因子(IL-1β、IL-6)的分泌情况。
(4)实验结果
1)瑞香素对髓核细胞的毒性
如图2所示，用不同浓度瑞香素(DAP)处理髓核细胞24h后，发现2-5μM范围内的瑞香素对细胞毒性低，和对照组(CTR)相比没有显著性差异。
2)瑞香素促进超氧化物歧化酶SOD1表达
SOD1在体内氧化应激时表达增多，从而发挥抗氧化应激的作用。图3的a图中，CTR为对照组，不予任何处理，其余为加入不同浓度DAP(0.5-10uM)24小时后提取总蛋白，进行Western blot实验检测，可见DAP可以促进SOD1蛋白表达水平，0.5-5uM效果明显，从而说明DAP能够发挥抗氧化应激作用；b图中的CTR为对照组，不予任何处理，从左至右第二组不加DAP，只加TNF-α，其余在加入TNF-α前加入DAP(1-5uM)预处理2h,然后加入TNF-α处理24h后提取总蛋白，进行Western blot实验检测，可见TNF-α可以抑制SOD1的表达，DAP可以减弱TNF-α对SOD1的抑制作用，2uM或5uM效果最佳，从而说明DAP能够逆转TNF-α诱导的模型，从而发挥抗氧化应激作用。可见，图3的WB结果表明瑞香素本身能够促进SOD1的表达，同时在TNF-α处理诱导模型中，能够逆转TNF-α的作用。
3)瑞香素具有抗氧化应激的作用
图4中，DCFH-DA为细胞内氧化应激检测试剂盒，H2O2诱导细胞内氧化应激模型，表明瑞香素(DAP)能够抑制细胞内氧化应激，也能抑制H2O2诱发的氧化应激。
4)瑞香素具有抗炎的作用
由图5的炎症因子mRNA的表达水平，图6的炎症因子蛋白分泌水平以及图7的炎症因子蛋白质表达水平(Tublin为内参蛋白)可以看出，瑞香素能够抑制炎症因子的表达，具有抗炎的作用。
5)瑞香素具有抗凋亡的作用
按照处理的不同，将细胞分为对照组(CTR，不予任何处理)，DAP组(加入2uM DAP),TNF-α+DAP组(加入不同浓度(1-5uM)DAP 2h后，再加入TNF-α，20ng/mL)，按照凋亡试剂盒(MultiSciences，AP107)说明书进行操作，再用流式细胞仪(Beckman Coulter,Fullerton)进行检测。图8中的数据表示正常细胞比例，表明TNF-α可以诱导细胞凋亡，而瑞香素(DAP)能够发挥抗凋亡的作用。
6)瑞香素通过抑制NF-κB通路发挥抗氧化应激、抗炎和抗凋亡的作用
图9的结果表明TNF-α能促进P65磷酸化，PP65表达增多(P65磷酸化后成为PP65,PP65可以进入细胞核激活炎症相关基因，从而启动炎症、氧化应激和凋亡等生物过程)，而瑞香素(DAP)能够抑制这种作用，因此瑞香素能够抑制NF-κB通路，从而发挥抗氧化应激、抗炎和抗凋亡的作用。
综合上述分析可见，瑞香素具有抗氧化应激、抗炎、抗凋亡的作用。
实施例2瑞香素对IVDD模型小鼠的治疗作用
(1)动物模型的建立
鼠针刺退变模型是应用得最为广泛且模拟人体IVDD相似度较高，也是研究IVDD最为公认的经典动物模型。本研究以C57BL/6N小鼠(Gempharmatech,China)建立鼠针刺退变模型(IVDD小鼠模型)。具体操作为：经腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉小鼠，备皮后将小鼠仰卧位固定于手术台，常规消毒、铺巾。切开皮肤、皮下组织，暴露L4/5椎间盘。在手术显微镜下进行操作，利用小血管钳限深，用31G注射器针头平行于终板穿刺入椎间盘纤维环约3mm，停留约30秒后缓慢拔出，使用3-0丝线缝合肌肉及4-0丝线缝合皮肤。麻醉苏醒后常规分笼饲养。对照组仅按以上操作暴露L4/5椎间盘，不进行穿刺操作，而后进行缝合。
(2)动物腹腔注射瑞香素及核磁共振(MRI)检查
IVDD小鼠模型建立后次日，用PBS稀释瑞香素，按3mg/kg的量对模型小鼠给予腹腔注射，连续注射2周，后继续喂养，待建模后4周，8周进行MRI检测，以明确椎间盘的退变情况。
(3)实验结果
图10的结果表明，白色箭头指示为穿刺椎间盘，Puncture组椎间盘退变明显，腹腔注射瑞香素后4周和8周，能够缓解小鼠椎间盘退变程度。
综上实施例1和实施例2可见，本发明从细胞和动物两个层面研究发现，瑞香素能够通过抑制NF-κB通路发挥抗氧化应激、抗炎和凋亡作用，从而延缓椎间盘退变。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
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