具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行具体的对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。本领域技术人员可根据本发明记载内容，对本发明进行改进，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中涉及到的佛手柑内酯购买于德思特生物公司，LPS购买于Sigma公司，小鼠购买于北京维通利华实验动物有限公司，小胶质细胞(BV2细胞)购买于ATCC公司。

实施例1动物饲养与分组

(1)实验动物

从北京维通利华实验动物有限公司购买40只6周龄雄性C57BL/6J小鼠，平均体重均在21-25g之间。将小鼠饲养于室温为23℃，执行12小时昼夜周期的清洁级或SPF级动物房中，在实验开始前，适应性饲养一周，饲养期间自由饮水。将小鼠分组饲养直至行为学测试开始。

所有的动物实验均获得中央民族大学生物与医学伦理委员会的审查和批准。

(2)药物制备及给药

1)将佛手柑内酯(BG)溶于二甲基亚砜(DMSO)，按照10mg/kg小鼠进行腹腔注射给药

2)LPS溶解于生理盐水中，按照1mg/kg小鼠进行腹腔注射给药。

(3)实验模型的建立及其分组

将预饲养一周后的小鼠随机分为4组，每组10只，即正常组(n＝10)、单给药组(n＝10)、LPS组(n＝10)、BG治疗组(n＝10)，给药4天，所有动物自由饮水，喂食普通日粮饲料，行为检测完毕后，用70mg/kg戊巴比妥钠麻醉小鼠，经心脏灌注后，固定脑组织。

表1动物实验分组及处理方法

实施例2佛手柑内酯对小鼠抑郁样行为的影响

1.行为学测试

(1)开放旷场测试

开放旷场测试是评价小鼠在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。实验前提前2小时将小鼠放入实验环境进行预适应。在实验期间，将小鼠放入一个大小为32×32厘米的测试箱中。启动测试程序，记录小鼠5分钟内的自发活动，统计小鼠活动总距离和在中心区停留的时间。每只小鼠测试后使用75％乙醇溶液清洁，待干燥后放入下一只。实验结果如图1A-C所示，四组小鼠的活动总距离和在中心区停留的时间无显著差异，佛手柑内酯对LPS诱导的小鼠焦虑样行为无显著性作用。

(2)高架十字迷宫测试

高架十字迷宫测试通过小鼠对新异环境的探究特性和对高悬开放臂的恐惧形成矛盾冲突从而考察焦虑状态。在实验开始前2小时将小鼠放入实验环境进行预适应。在测试期间，将小鼠轻轻放入朝着开放臂方向的中心区域，启动测试软件，记录5分钟内小鼠在开放臂中的活动时间和进入次数。开放臂进入次数(必须有两只前瓜进入臂内)，开放臂停留时间，闭合臂进入次数，闭合臂停留时间。每只小鼠测试后使用75％乙醇溶液清洁，待干燥后放入下一只。实验结果如图1D-F所示，四组小鼠进入开放臂的次数和停留时间无显著差异，佛手柑内酯对LPS诱导的小鼠焦虑样行为无显著性作用。

(3)悬尾测试

悬尾测试是一种经典且能快速评价抗抑郁药物、兴奋药物、镇静药物药效的方法。该实验在距离小鼠尾巴末端2.5厘米处用胶带固定，使其倒挂并且头部距离地面15厘米。实验进行6分钟并用视频记录。开始的1分钟为小鼠的适应期，统计后5分钟内小鼠累计静止不动的时间(指小鼠停止挣扎，身体呈垂直倒悬状态，静止不动)。实验结果如图2A所示，LPS组小鼠在悬尾实验中静止不动的时间较正常组和单给药组显著增加，而BG组小鼠的不动时间较LPS组降低了54.7％，注射佛手柑内酯能显著减少抑郁小鼠的不动时间，缓解抑郁状态，可以显著改善由LPS诱导的小鼠抑郁样行为。

(4)强迫游泳测试

强迫游泳测试广泛用于抗抑郁药物筛选和基础研究，也是评价啮齿类动物模型的抑郁类行为最常用的实验之一。该实验将小鼠单独放入圆柱形玻璃烧杯中，烧杯直径12厘米，高度25厘米，水温(25±2)℃，从小鼠入水后计时6分钟，摄像机从烧杯侧面记录小鼠游泳的具体细节。开始的2分钟为小鼠适应期，记录后4分钟内游泳累计静止不动时间(指小鼠在水中停止挣扎，或显示漂浮状态，仅有微小的肢体运动以保持头部浮在水面。)每只小鼠实验后立即更换玻璃烧杯中的水。实验结果如图2B所示，抑郁小鼠在强迫游泳实验中静止不动的时间较正常组和单给药组显著增加，而BG组小鼠的不动时间较LPS组降低了53.8％，因此，注射佛手柑内酯能显著减少小鼠不动时间，显著改善了由LPS诱导的小鼠抑郁样行为。

(5)糖水偏好实验

测试前，所有小鼠的笼内都放入一瓶1％蔗糖水和一瓶普通饮用水，使小鼠适应2天。测试当天，在所有小鼠笼内放入一瓶1％蔗糖水和1瓶普通饮用水，两瓶位置随机，观察23小时内的液体消耗量，排除水瓶漏水的消耗量，并记录。

糖水偏好百分比＝蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+普通饮水消耗量)×100％。

实验结果如图2C所示，LPS组小鼠的糖水偏好百分比较正常组和单给药组显著降低，BG组小鼠的糖水偏好百分比较LPS组显著提高了40.7％，BG组小鼠基本恢复至正常的糖水偏好程度，表明佛手柑内酯缓解抑郁导致的快感消失。

2.生化指标测定

(1)样本收集和组织固定

在行为学测试完成后，立即将小鼠麻醉(戊巴比妥；腹腔注射；70mg/kg)。心脏穿刺收集血液，每组随机选取5只小鼠用无菌生理盐水灌注后在冰上分离海马组织、大脑皮层，每组剩下的5只小鼠用4％多聚甲醛(PFA)灌注后在冰上取小鼠脑组织，在4％多聚甲醛中固定过夜后，用15-30％的蔗糖水梯度脱水。

(2)佛手柑内酯对炎症因子的影响

2×10⁵个BV2细胞接种于含有1mL完全培养基(DMEM，10％胎牛血清，1％双抗)的12孔板中，37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱培养24小时后，加入20μg/ml佛手柑内酯预处理30min后，加入1μg/ml LPS分别刺激6小时和12小时，经PBS洗涤后，收集细胞。在细胞中加入Trizol裂解细胞，分离出总RNA，使用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，利用如下引物进行实时荧光定量PCR。

表2 qPCR引物表

结果如图5所示，体外实验中，佛手柑内酯可显著抑制LPS诱导的炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA水平上的表达量，具有很好的抗炎症作用。

(3)佛手柑内酯对炎症通路的影响

2×10⁵个BV2细胞接种于含有1mL完全培养基(DMEM，10％胎牛血清，1％双抗)的12孔板中，37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱培养24小时后，加入20μg/ml佛手柑内酯预保护30分钟后，加入1μg/ml LPS分别刺激6小时和12小时，经PBS洗涤后，提取总蛋白质并采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白质浓度。采用10％SDS-PAGE凝胶电泳(120V，1h)分离蛋白质，NC膜转膜后(250mA，2h)，10％脱脂牛奶封闭NC膜1小时。然后分别采用不同的一抗(p-IκB、IκB、iNOS、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK)孵育NC膜过夜，以β-tubulin作为内参。TBST洗涤后辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1小时，TBST洗膜3次，最后采用ECL显色液显色。

结果如图6所示，佛手柑内酯可有效抑制小胶质细胞内NF-κB和MAPK信号通路，具有很好的抗炎症作用。

(4)佛手柑内酯对小胶质细胞和星形胶质细胞的影响

使用步骤(1)中4％多聚甲醛固定的小鼠制备脑冠状切片，用Leica CM1950低温恒温仪切制40μm脑冠状切片，然后用0.3％Triton和5％牛血清在室温下冲洗和封闭切片1.5小时。将封闭后的切片分别用Iba-1(1:200,WAKO,Japan)、GFAP(1:200,Millipore,Germany)和DAPI在黑暗中4℃孵育过夜，之后室温孵育荧光二抗1小时。使用Nikon共聚焦荧光显微镜拍摄图像。

观察小胶质细胞形态变化，实验结果如图3A-C、图4A-B所示。与正常组和单给药组相比，LPS组小鼠的小胶质细胞发生了去分支化，呈现出阿米巴样的形态，BG组小鼠的海马CA1区和DG区的小胶质细胞的形态得到的了明显的恢复。可以看出，佛手柑内酯可以逆转LPS引起的小胶质细胞异常形态变化。

为定量小胶质细胞和星形胶质细胞在海马、皮层区域的浸染情况，对Iba-1和GFAP标记的比例面积进行了分析，实验结果如图3D-F、图4C-D所示。与正常组和单给药组相比，LPS小组小鼠的海马CA1区、DG区和大脑皮层的小胶质细胞和星形胶质细胞的比例面积显著上升，BG组小鼠的比例面积较LPS组降低了10％～26％，基本恢复至正常水平。由此可见，佛手柑内酯可以逆转LPS引起的小胶质细胞异常形态变化，显著降低小胶质细胞和星形胶质细胞的数目。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。