Bix-01294在制备治疗急性肾损伤相关病症药物中的应用
阅读说明：本技术 Bix-01294在制备治疗急性肾损伤相关病症药物中的应用 (Application of BIX-01294 in preparation of medicine for treating acute kidney injury related diseases ) 是由 于晓文 张爱华 贾占军 黄松明 张玥 李书敏 曹诗涵 于 2021-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于BIX-01294的新用途技术领域,公开了BIX-01294在制备治疗急性肾损伤相关病症药物中的应用,本发明提出了BIX-01294可以减轻顺铂诱导的急性肾损伤相关病症,包括急性肾小管损伤、肾功能、肾小管细胞凋亡、炎症因子的表达及分泌等病症,主要是通过抑制肾小管细胞的凋亡来减轻急性肾损伤。(The invention belongs to the technical field of new application of BIX-01294, and discloses application of BIX-01294 in preparation of a medicament for treating acute renal injury related diseases.)
技术领域
本发明涉及BIX-01294的新用途技术领域，特别是涉及BIX-01294在制备治疗急性肾损伤相关病症药物中的应用。
背景技术
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是指突然发生的肾功能下降，可伴或不伴有少尿或无尿，为由肾小球、肾小管、肾间质或血管等病变引起的肾功能在短期内急剧下降或丧失的临床综合征，表现为突然不能保持正常的水电解质平衡，体内代谢产物堆积，出现氮质血症、水及电解质紊乱和代谢性酸中毒等症状。AKI是一种可继发于多种疾病的临床综合征，具有发病急、进展快、病死率高的特点，是慢性肾脏病的重要病因之一。它是一组严重的临床综合征群，死亡率高，延误诊治或治疗不当可导致肾功能呈不可逆改变，使患者进入维持性透析，给社会经济带来很大负面影响。
AKI的患病率社区为1％，在医院为7.1％。发病率为每年医院获得的AKI的病死率为10％～80％，合并多脏器功能衰竭的病死率>50％，需要肾替代疗法的病死率是80％，因此AKI具有高发病率和致死率。它的主要病因是缺血，肾有毒物质所致或原发性肾脏病，肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cells，RTEC)损伤是AKI的主要病理基础。在疾病状态下，功能活跃的RTEC更容易受到肾毒素等造成的损伤而发生急性肾小管坏死(AcuteTubular Necrosis，ATN)，引起AKI及肾功能衰竭。
顺铂(Cisplatin，CP)是临床上治疗实体肿瘤(包括头部、颈部、卵巢等)最常用及最有效的化疗药物之一。临床调查表明，由于其具有剂量依赖性的肾脏毒性作用，极大地限制其临床应用。顺铂诱导的AKI发生率为25％～35％，其引起损伤的主要机制包括诱导肾小管上皮细胞的氧化应激引起细胞凋亡，并且能够触发炎症反应参与肾脏损伤。如何切实有效地预防和减轻顺铂引起的AKI，更好地发挥顺铂抗肿瘤作用已成为当前亟待解决的问题。
在病人和动物模型中肾小管细胞的丢失——包括小管凋亡和坏死被认为是AKI发生发展中主要的参与细胞。另外，脱落的肾小管细胞与蛋白在管腔中形成管型阻断尿流，损伤的小管可能会进一步促进肾脏间质纤维化、间质炎症、毛细血管丢失。所以如何阻止肾小管细胞丢失是治疗AKI的关键。
顺铂进入细胞后能够激活Bcl-2家族中的促凋亡蛋白如Bax，促使线粒体通透性转换孔开放，细胞色素C、凋亡诱导因子等促凋亡因子从线粒体释放到胞浆，产生caspase级联反应，最终导致凋亡的发生。
BIX-01294是一种G9α组蛋白甲基转移酶(G9a Histone Methyltransferase)特异性抑制剂。G9α(也被称作KMT1C或者EHMT2)是第二个被报道的组蛋白甲基转移酶。它属于含SET结构域的Suv39h蛋白家族的成员之一，是一种重要的常染色质HMT，主要负责常染色质区域组蛋白H3中K9和K27位点的甲基化。G9α主要在肌肉、心脏、肝脏等组织中高表达。G9α通过两种不同的机制来调控基因转录：一方面，G9α可以促进基因启动子区域组蛋白或DNA的甲基化，从而抑制基因转录；另一方面，G9α可以作为一种脚手架蛋白来募集转录激活子，从而激活基因转录。近年来，随着研究的深入，发现G9α可以调控自噬反应和细胞分化，并在肿瘤发生、胚胎发育、认知及适应性行为和脂肪形成等多种生物过程中起着重要作用。有研究显示，给予G9α抑制剂BIX-01294，能够增强神经胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，并促进细胞凋亡；也有研究报道BIX-01294可以改善神经损伤引起的痛觉过敏；在肺和肾脏中，均发现给予BIX-01294来抑制G9α，可以改善肺部及肾脏间质纤维化；也有研究人员发现，BIX-01294可以阻断疟原虫生长周期治疗疟疾。而尚未有BIX-01294可以改善顺铂引起的AKI的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种BIX-01294的新用途，提供BIX-01294在制备治疗急性肾损伤相关病症药物中的应用。
本发明通过动物实验和体外细胞实验两个方面发现BIX-01294对于减轻顺铂诱导的AKI相关病症的药物中的应用。
本发明提供BIX-01294在制备治疗急性肾损伤相关病症药物中的应用。
进一步地，本发明提供BIX-01294在制备用于减轻顺铂诱导的急性肾损伤(AKI)相关病症药物中的应用。
进一步地，本发明提供BIX-01294在制备用于减轻顺铂诱导的AKI肾功能药物中的应用。
进一步地，本发明提供BIX-01294在制备用于减轻顺铂诱导的肾小管细胞凋亡药物中的应用。
进一步地，本发明提供BIX-01294在制备用于减轻顺铂诱导的肾脏炎症因子的表达及分泌药物中的应用。
进一步地，本发明提供BIX-01294在制备用于改善顺铂诱导的肾脏小管细胞线粒体功能药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供一种BIX-01294的新用途，本发明提出了BIX-01294可以减轻顺铂诱导的急性肾损伤相关病症，包括急性肾小管损伤、肾功能、肾小管细胞凋亡、炎症因子的表达及分泌等病症，主要是通过抑制肾小管细胞的凋亡来减轻急性肾损伤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为用顺铂造模以及用BIX-01294治疗后的肾功能及糖原染色(PAS)结果，其中A为用顺铂造模以及用BIX-01294治疗后的PAS染色结果，B为用顺铂造模以及用BIX-01294治疗后血生化的结果；
图2为QPCR法及ELISA法研究BIX-01294对顺铂诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌的影响；
图3为QPCR法、Western blot研究BIX-01294对顺铂诱导的小管细胞凋亡及肾脏损伤相关分子的影响；
图4为流式细胞及QPCR法检测BIX-01294在体外对顺铂诱导的小管细胞凋亡、活性氧及线粒体DNA拷贝数的影响，其中A、B为流式细胞法检测细胞的凋亡情况，C为流式细胞法检测细胞的线粒体活性氧水平，D为QPCR法检测细胞中线粒体DNA拷贝数的变化。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明酒精分数指的是体积分数。
本发明中Western blot、实时荧光定量PCR、PAS染色、流式细胞法的具体操作步骤如下：
实时荧光定量PCR(QPCR)：
提取肾脏组织总RNA，用分光光度法测定RNA溶液浓度和纯度。利用逆转录试剂盒(Takara,DaLian)将1μgRNA逆转录成cDNA，按照下面的反应体系检测不同基因的变化情况。
a.反应体系
b.PCR热循环参数
55℃-95℃,snap every 0.5℃,repeat 81 circles.
PAS染色：
4％多聚甲醛固定组织48h，石蜡包埋切片，脱蜡至水，蒸馏水冲洗，70％酒精冲洗3次。浸入高碘酸酒精溶液10min(此溶液温度以17-20℃为好)，70％酒精洗后，入还原液中1min(此溶液温度以17-20℃为好)，70％酒精洗后，入无色盐基性品红溶液1-1.5h，冬天室温较低时，可放入37℃温箱。流水冲洗10min，用Mayer\'s苏木素复染液复染细胞核3-5min，再用1％盐酸酒精分化，流水冲洗后，脱水透明，最后封片。
Annexin V/PI凋亡双染实验:
取对数生长期肾小管上皮细胞(RTEC)接种于6孔板中，分别给予顺铂及BIX-01294，药物作用24h后，用无EDTA胰酶消化细胞，以1000rpm转速离心5min，收集细胞，弃掉培养基。用预冷过的PBS溶液洗涤细胞两次，在其中加入400μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，细胞密度大约为1×106cells/mL。每组细胞悬液分别加入5μLAnnexin V和5μL PI，轻轻混匀后室温避光条件下孵育15min。1h内用流式细胞仪检测。
线粒体膜电位(JC-1)检测：
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。选择对数生长期的细胞接种于6孔板中，分别给予顺铂及BIX-01294，药物作用24h后，用无EDTA胰酶消化细胞，以1000rpm转速离心5min，收集细胞，弃掉培养基。用预冷过的PBS溶液洗涤细胞两次，加入1mL JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20min。在孵育期间，按照每1mL JC-1染色缓冲液(5×)加入4mL超纯水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。加入2mL细胞培养液，在1h内用流式细胞仪检测。
活性氧(ROS)检测：
选择对数生长期的细胞接种于6孔板中，分别给予顺铂及BIX-01294，药物作用24h后，用无EDTA胰酶消化细胞，以1000rpm转速离心5min，收集细胞，弃掉培养基。用预冷过的PBS溶液洗涤细胞一次，加入500μL mitoSOX染色工作液(1X)，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20min。37℃孵育结束后，离心吸除上清，PBS溶液洗涤细胞两次，加入500μL细胞培养液，在1小时内用流式细胞仪检测。
下面通过具体的实施案例详细说明本发明。
实施例1 BIX-01294对顺铂诱导的急性肾损伤肾功能的影响
取体重18～22g的雄性C57BL/6小鼠，分为3组，即对照组，顺铂模型组以及BIX-01294治疗组(n＝8)。
对照组：每日1次腹腔注射等体积介质，共4天；
顺铂模型组：腹腔注射，20mg/kg，单次给药；
BIX-01294治疗组：BIX-01294提前给药1天(腹腔注射，1.5μg/μL)，随后单次给药顺铂(腹腔注射，20mg/kg)，BIX-01294再治疗3天，顺铂注射72h后取血，留取肾组织。
图1A为用顺铂造模以及用BIX-01294治疗后的PAS染色结果。根据PAS染色结果，顺铂组肾小管结构破坏，蛋白管型形成，BIX-01294能够显著改善顺铂诱导的肾脏损伤。
将血标本离心(20min，3000r/min),用肌酐试剂盒(Creatinine Assay Kit(cat:K625-100,biomars))、尿素氮试剂盒(QuantiChrom Urea Assay kit(cat:DIUR-500,Hayward,CA))测定血肌酐、尿素氮。图1B为用顺铂造模以及用BIX-01294治疗后的血生化结果，从结果中可以看出，给予顺铂后造模成功，血肌酐、尿素氮显著升高，提示肾脏受到损伤。而使用BIX-01294治疗后，可以明显改善肾功能，肌酐、尿素氮水平与模型组相比模型降低，p<0.05。。
实施例2 BIX-01294对顺铂诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌的影响
利用QPCR法及ELISA法研究BIX-01294对顺铂诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌的影响。
如图2所示，利用QPCR法研究BIX-01294对顺铂诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌的影响。在顺铂诱导的AKI模型中，顺铂模型组的炎症因子MCP-1、IL-18及ICAM-1表达水平与对照组相比明显升高，p<0.05。而BIX-01294治疗组能够显著降低MCP-1、IL-18及ICAM-1表达水平，p<0.0001。
结果表明，BIX-01294能够明显降低顺铂诱导的AKI模型中MCP-1、IL-18及ICAM-1表达水平。
实施例3 BIX-01294对顺铂诱导的小管细胞凋亡及肾脏损伤相关分子的影响
利用QPCR法检测肾脏凋亡、肾小管损伤相关分子及G9α的表达水平来测定BIX-01294对顺铂诱导的AKI的改善情况，结果如图3所示，顺铂模型组的G9α及凋亡相关分子Bax表达明显升高；损伤相关分子KIM-1、NGAL表达明显升高。而BIX-01294治疗组能够显著降低G9α、Bax、KIM-1和NGAL的表达水平。
结果表明，BIX-01294能够明显降低顺铂诱导的肾脏凋亡及损失相关分子的表达水平。
实施例4 BIX-01294在体外对顺铂诱导的肾小管细胞凋亡、活性氧及线粒体DNA拷贝数的影响
体外应用RTEC细胞(小鼠肾小管上皮细胞系)，选择对数生长期的细胞接种于6孔板中，分别给予顺铂(5μg/mL)及BIX-01294(2μM)，药物作用24h后，利用流式细胞仪检测小管细胞的凋亡发生率。结果如图4A-B所示，顺铂模型组细胞发生凋亡的比率明显升高，可以观察到约38％的凋亡率，BIX-01294治疗组与顺铂模型组相比，发生凋亡的比率明显降低，观察到约20％的凋亡率。如图4C所示，顺铂模型组细胞内的活性氧水平与对照组相比明显升高，P<0.001。BIX-01294治疗组与顺铂模型组相比能够明显降低细胞内的活性氧水平，P<0.001。如图4D所示，顺铂模型组细胞线粒体DNA拷贝数与对照组相比明显降低，P<0.0001。BIX-01294治疗组与顺铂模型组相比能够明显升高细胞线粒体DNA拷贝数，P<0.05。
结果表明，顺铂刺激RTEC细胞24h，可以明显诱导细胞凋亡的发生，并能导致细胞内ROS水平升高、线粒体DNA拷贝数的减少。给予BIX-01294治疗后，能够明显减少顺铂诱导的细胞凋亡的发生，并能降低细胞内ROS水平、增加线粒体DNA拷贝数，提示BIX-01294有可能改善顺铂诱导的线粒体功能损伤。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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