法舒地尔在制备治疗发育期脑白质损伤疾病的药物中的应用
阅读说明：本技术 法舒地尔在制备治疗发育期脑白质损伤疾病的药物中的应用 (Application of fasudil in preparation of medicine for treating developmental stage white matter injury disease ) 是由 周艳 母得志 屈艺 李熙鸿 熊英 赵凤艳 黄骥翀 王炎 黄兰 肖东琼 潘玲丽 于 2020-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了法舒地尔(Fasudil)在制备治疗发育期脑白质损伤疾病的药物中的应用。实验表明,脑白质损伤(WMI)建模后0～6天,Fasudil处理组以10mg/kg/d法舒地尔腹腔内注射,经苏木素-伊红染色显示,法舒地尔使脑室周围白质坏死减少,胼胝体厚度增加。术后28天,免疫荧光显示,Fasudil处理组NG2、O4表达较WMI组减少,而MAG、MBP表达增加,定量分析显示差异具有统计学意义,提示Fasudil促进OLs分化成熟及髓鞘化。术后33天,取三组实验大鼠脑组织行透射电镜观察胼胝体区髓鞘化,结果显示,与WMI组相比,Fasudil处理组胼胝体区髓鞘纤维排列紧密,髓鞘厚度和数量明显增加。Morris水迷宫实验显示,与WMI组相比,Fasudil处理组大鼠平均潜伏期缩短,平台穿越次数增加。(The invention discloses an application of Fasudil (Fasudil) in preparing a medicament for treating a brain white matter injury disease in a development stage. Experiments show that 0-6 days after brain White Matter Injury (WMI) modeling, Fasudil treatment groups are injected in an intraperitoneal mode at a concentration of 10mg/kg/d of Fasudil, hematoxylin-eosin staining shows that the Fasudil reduces the white matter necrosis around the ventricles of the brain and increases the thickness of a corpus callosum. After 28 days, immunofluorescence shows that expressions of NG2 and O4 in the Fasudil treatment group are reduced compared with those in the WMI group, expressions of MAG and MBP are increased, quantitative analysis shows that the difference has statistical significance, and the Fasudil is prompted to promote OLs to differentiate, mature and myelinate. After 33 days, three groups of experimental rat brain tissues are taken for observing the myelination of the callus area by a transmission electron microscope, and the result shows that compared with the WMI group, the arrangement of myelin fibers of the callus area of the Faudil treatment group is compact, and the thickness and the quantity of the myelin sheaths are obviously increased. The Morris water maze experiment shows that the mean latency of the rats in the Fasudil treatment group is shortened and the number of platform crossings is increased compared with that in the WMI group.)
技术领域
本发明涉及法舒地尔(Fasudil)的用途，尤其是在制药中的用途。
背景技术
脑白质损伤(White Matter Injury，简称WMI)是早产儿常见的神经系统疾病，可造成运动、认知、行为等多种神经功能缺陷。由于尚无有效治疗方法，目前临床上仍以对症治疗为主。WMI及其造成的神经系统后遗症给家庭及社会造成极大的负担，因此积极探寻WMI的干预措施具有重要的临床意义。
大脑白质主要由神经元轴索和少突胶质细胞(Oligodendrocytes,OLs)及其形成的髓鞘构成。OLs根据其分化过程中的形态、增殖、迁移及髓鞘形成的特性，可分为少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Progenitor/Precursor Cells,OPCs)、髓鞘化前少突胶质细胞(Pre-myelinating Oligodendrocytes,Pre-OLs)及髓鞘化少突胶质细胞(MyelinatingOligodendrocytes)。研究显示，中枢神经系统白质髓鞘化障碍是WMI的主要表现，而WMI后OPCs发育停滞在Pre-OLs阶段，不能进一步分化为成熟OLs是造成髓鞘化不足的主要原因。
法舒地尔[Fasudil，六氢-1-(5-磺酰基异喹啉)-1-(H)-1,4-二氮杂卓，C14H17N3O2，HA1077]，是一种新型磺酰基异喹啉衍生物，化学结构式如下：
法舒地尔由日本旭化成株式会社和名古屋大学药理学研究室合作开发，做为脑血管扩张剂，于1995年六月在日本上市，临床上用于改善和预防蛛网膜下腔出血术后脑血管痉挛及其引起的脑缺血症状，未见明显副作用。
发明内容
本发明的目的在于证明法舒地尔的新用途，即在制药中的新用途，为治疗发育期脑白质损伤疾病提供新的药品。
下述描述中，以“Fasudil”表示“法舒地尔”。
本发明通过实验证明：新生2日龄(Postnatal Day 2,简写为P2)SD大鼠，WMI建模后0～6天，Fasudil处理组以10mg/kg/d Fasudil腹腔内注射，经苏木素-伊红(hematoxylinand eosin，HE)染色显示，Fasudil使脑室周围白质坏死减少，胼胝体厚度增加。采用NG2标记OPCs，O4标记pre-OLs，MAG、MBP标记成熟OLs，术后28d(P30)，免疫荧光显示Fasudil处理组大鼠胼胝体区NG2、O4表达较脑白质损伤组(WMI组)减少，而MAG、MBP表达增加，定量分析显示差异具有统计学意义，提示Fasudil促进OLs分化成熟及髓鞘化。术后33d(P35)，取三组大鼠脑组织行透射电镜观察胼胝体区髓鞘化，结果显示，与脑白质损伤组(WMI组)相比，Fasudil处理组胼胝体区髓鞘纤维排列紧密，髓鞘厚度和数量明显增加。Morris水迷宫实验显示，与脑白质损伤组(WMI组)相比，Fasudil处理组大鼠平均潜伏期缩短，平台穿越次数增加，差异均具有统计学意义。以上研究结果说明，Fasudil能够改善WMI大鼠的病理改变；促进髓鞘形成与发育；改善学习与记忆能力。因此，可将Fasudil作为治疗发育期缺氧缺血脑白质损伤疾病的药品。
本发明具有以下有益结果：
1、本发明对已知的药物Fasudil发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
2、本发明为早产儿脑白质损伤疾病的治疗提供一种有效的新药品，具有明显的社会效益和经济效益。
附图说明
图1是HE染色观察实验大鼠脑组织病理改变的照片；图中，Sham为假手术组，WMI为脑白质损伤组，Fasudil为Fasudil处理组，7d表示术后7天(P9)，28d表示术后28天(P30)。
图2是实验大鼠术后28天(P30)，免疫荧光检测胼胝体区NG2、O4、MAG、MBP表达的照片；图中，Sham为假手术组，WMI为脑白质损伤组，Fasudil组为Fasudil处理组。
图3是实验大鼠术后28天(P30)胼胝体区NG2荧光表达定量分析图，图中，Sham为假手术组，WMI为脑白质损伤组，Fasudil为Fasudil处理组，结果显示为均数±标准差(n＝6)。
图4是实验大鼠术后28天(P30)胼胝体区O4荧光表达定量分析图，图中，Sham为假手术组，WMI为脑白质损伤组，Fasudil为Fasudil处理组，结果显示为均数±标准差(n＝6)。
图5是实验大鼠术后28天(P30)胼胝体区MAG荧光表达定量分析图，图中，Sham为假手术组，WMI为脑白质损伤组，Fasudil为Fasudil处理组，结果显示为均数±标准差(n＝6)。
图6是实验大鼠术后28天(P30)胝体区MBP荧光表达定量分析图，图中，Sham为假手术组，WMI为脑白质损伤组，Fasudil为Fasudil处理组，结果显示为均数±标准差(n＝6)。
图7是假手术组(Sham)实验大鼠术后33天(P35)，透射电镜检测其胼胝体区髓鞘化情况图。
图8是脑白质损伤组(WMI)实验大鼠术后33天(P35)，透射电镜检测其胼胝体区髓鞘化情况图。
图9是Fasudil处理组实验大鼠术后33天(P35)，透射电镜检测其胼胝体区髓鞘化情况图。
图10是Morris水迷宫实验检测实验大鼠1-5天潜伏期图，其中，图A为三组大鼠每日潜伏期变化曲线，图B为三组大鼠平均潜伏期图，图中，Sham为假手术组，WMI为脑白质损伤组，Fasudil为Fasudil处理组。
图11是Morris水迷宫实验检测实验大鼠平台穿越次数图，图中，Sham为假手术组，WMI为脑白质损伤组，Fasudil为Fasudil处理组。
具体实施方式
1.实验材料与试剂
1.1实验动物
健康清洁级2日龄新生SD大鼠，体重7～10克，雌雄不限，购自成都达硕实验动物有限公司。实验动物随机分为假手术组(Sham组)、脑白质损伤组(WMI组)及Fasudil处理组(Fasudil组)，每组30只。WMI组及Fasudil组采用小剂量脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)腹腔内注射+缺氧缺血方法建立脑白质损伤(White matter injury,简写为WMI)模型。建模完成后0-6天，Fasudil组给予生理盐水稀释的Fasudil 10mg/kg/d腹腔内注射，共7天；WMI组每日腹腔内注入等量生理盐水。术后观察三组大鼠行为及体重变化。术后7天(P9)及28天(P30)，取脑组织进行HE染色，观察脑组织病理变化。术后28天(P30)，取两组大鼠的脑组织，用于免疫荧光检测胼胝体区不同分化阶段OLs标志物NG2、O4、MBP、MAG的表达。术后27天(P29)取三组大鼠进行Morris水迷宫实验，为期6天。术后33天(P35)，取三组大鼠的脑组织，送透射电镜检测胼胝体区髓鞘化情况。
1.2主要试剂
Fasudil(Selleck，美国)，小鼠抗大鼠NG2单抗(Abcam，ab50009)，小鼠抗大鼠O4单抗(R&D，MAB1326)，兔抗大鼠MAG单抗(CST，D4G3)，小鼠抗大鼠MBP单抗(Millipore，MBP101)，Cy3标记驴抗兔二抗(Jackson)，Cy3标记驴抗小鼠IgM二抗(Jackson)，DAPI染液(Beyotime)，叠氮钠(Solarbio)，琼脂糖(OXOID)，抗荧光淬灭封片剂(Solarbio)，牛血清白蛋白(Gibco)，新鲜胎牛血清(Gibco)，Triton-x-100(Solarbio)，质量浓度3％戊二醛电镜固定液(Solarbio)。
2.实验方法
2.1实验动物模型建立
2.1.1SD大鼠WMI模型构建
(1)LPS腹腔注射。取2日龄新生SD大鼠，无菌生理盐水稀释LPS至0.05μg/μl，使用微量注射器(Hamilton)将稀释后LPS以1μl/g，即0.05mg/kg自大鼠左下腹注入腹腔。注入后将新生大鼠置于母鼠旁休息2小时。
(2)缺氧缺血。2日龄新生SD大鼠经异氟烷麻醉后，仰卧位固定在加热垫上。颈正稍偏右侧切口约1cm，暴露并结扎右侧颈总动脉上下端，并剪断双节之间，缝合皮肤切口。术后将新生大鼠置于37℃恒温水浴箱中恢复1小时。然后将大鼠放入体积浓度6.5％氧气和体积浓度93.5％氮气的低氧舱内低氧通气90分钟制作WMI模型。
假手术组大鼠腹腔内注入1μl/g无菌生理盐水，仅分离右侧颈总动脉，不进行结扎及低氧处理。
2.1.2构建WMI实验动物的处理组
在WMI模型建立后0～6天，生理盐水稀释Fasudil，Fasudil组大鼠以10mg/kg/d腹腔内注射，共7d。WMI组每日腹腔内注入等量生理盐水。
2.2 HE染色
2.2.1标本制备及取材
新生大鼠经异氟烷麻醉后仰卧位固定，剪开胸腔暴露心脏。将连接生理盐水注射器的头皮针刺入左心室，推注生理盐水，待心脏膨胀后剪开右心耳；继续匀速心脏灌注生理盐水冲洗血污，推注至流出液清亮；质量浓度4％多聚甲醛缓慢心脏灌注内固定至肝脏变白，大鼠四肢、鼠尾完全僵直后开颅取脑，将脑组织固定于质量浓度4％的多聚甲醛中，放置于4℃冰箱约36～48h。根据大鼠脑立体定位图谱，将固定好的鼠脑以前囟视交叉连线前2mm为起点，冠状切除前面的脑组织，向后约6mm冠状位切除后面的脑组织，保留中间部位脑组织并置于水中15min，中间换水3-4次。
2.2.2石蜡包埋脑组织
脱水：质量浓度75％乙醇(1h)；质量浓度85％乙醇(1h)
质量浓度95％乙醇(3h)；质量浓度95％乙醇(3h)
质量浓度100％乙醇(1h)；质量浓度100％乙醇(12h)
透明：二甲苯(1h)；二甲苯(1h)
包埋：60℃浸蜡1.5h×2次，石蜡包埋。
2.2.3石蜡切片制备
将标本蜡块从视交叉开始连续冠状切片(厚度5μm)，切片包括胼胝体区和海马，贴于防脱载玻片上，于60℃烤箱烤片6h。
脱蜡：二甲苯(15min×2次)；质量浓度100％乙醇(5min×2次)
质量浓度95％乙醇(5min×1次)；质量浓度85％乙醇(2min×1次)
质量浓度70％乙醇(2min×1次)；蒸馏水洗(5min×2次)
染色：苏木素染色(5min)后倒掉苏木素，流水冲洗(5s)
质量浓度1％盐酸酒精分化(20～30s)，流水冲洗(5s)
质量浓度0.1～0.5％伊红染色(1min)，流水冲洗(2min)
脱水：质量浓度70％乙醇(2min)；质量浓度85％乙醇(2min)
质量浓度95％乙醇(5min)；质量浓度100％乙醇(5min)
质量浓度100％乙醇(5min)
透明：二甲苯透明(10min×2次)
2.2.4滴加中性树胶，加盖玻片封片，镜检。
2.3免疫荧光测定NG2/O4/MAG/MBP
2.3.1震荡切片制备
(1)取已固定的脑组织，固定方法及标本修理方法同2.2.1；
(2)埋模框中注入完全溶解的质量浓度5％琼脂糖；
(3)将脑组织放入包埋模框，琼脂糖需完全没过组织，调整脑组织位置，待琼脂糖完全凝固；
(4)修理琼脂糖模块后放入质量浓度0.04％叠氮钠PBS溶液中，4℃保存备用；
(5)安装固定振动切片机刀架及刀片；
(6)胶水固定组织块至托盘表面；
(7)切片槽中加PBS液，没过组织块即可，切片槽周围加冰；
(8)从视交叉前2mm开始，连续冠状切片，片厚40μm；
(9)挑选切片，置于质量浓度0.04％叠氮钠PBS溶液的6孔板中，4℃保存备用。
2.3.2免疫荧光染色
(1)挑选保存的振动切片，置于24孔板中，PBS洗5min×3次；
(2)质量浓度0.3％Triton-x-100的PBS溶液穿膜30min；
(3)封闭液室温封闭1小时；
(4)滴加封闭液稀释一抗：NG2(Abcam，1:200)；O4(R&D，1:200)，MAG(CST，1:100)，MBP抗体(Millipore，1:500)，4℃过夜；
(5)吸出一抗，PBS洗5min×3次；
(6)滴加Cy3/488标记的驴抗小鼠/兔二抗(1:500)，置于湿盒内，室温避光孵育2小时；
(7)吸出二抗，PBS洗5min×3次；
(8)DAPI(1:500)染核5min；
(9)PBS洗5min×2次；
(10)挑片平铺于粘附载玻片上，滴加抗荧光淬灭剂，封片；
(11)激光共聚焦显微镜观察结果。
2.4电镜检测胼胝体区髓鞘化情况
SD大鼠于术后33天(P35)行灌注固定后开颅取脑，方法同前，经前囟与视交叉连线前2mm与连线间冠状切开脑组织，修成包含胼胝体在内的约2mm x 1mm x 1mm组织块，置于电镜固定液中室温固定48小时。固定后标本送四川大学华西基础医学院电镜室，经质量浓度3％戊二醛预固定，质量浓度1％四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。
2.5 Morris水迷宫
三组大鼠各取10只，于术后27天(P 29)开始进行Morris水迷宫试验，试验期6d。
(1)实验要求
水迷宫水深32cm，水温保持在25±1℃。池壁上标有东南西北4个等距离点，将水池分为I、II、III、IV四个象限，在第I象限正中距离池壁25cm处放置平台，平台顶低于水面2cm。将食用增白剂(钛白粉)放入水中混匀以掩盖平台位置。每次实验时实验人员、实验环境、实验平台位置及水池周围参照物均保持不变。实验前用苦味酸标记大鼠头部以便于摄像头追踪大鼠。
(2)定位航行试验(Place Navigation Test)
此为训练阶段，每日上午训练每只大鼠1次，连续5d。操作者将大鼠面向池壁，从第I象限开始，依次从4个象限固定放置点轻柔放置大鼠入水。每次大鼠入水后在水中游泳2min，如2min内成功找到平台，则让其在平台上休息30s，逃避潜伏期时间为大鼠找到平台的时间；如2min内不能找到平台，则帮助其找到平台，并在平台上休息30s，此时逃避潜伏期时间记录为120s。每一象限训练完成后大鼠休息1min进入下一象限训练。记录大鼠找到平台的时间，4个象限潜伏期时间的平均值作为每日最终成绩进入统计。5天潜伏期成绩的平均值即平均逃避潜伏期，用于检测大鼠空间学习及记忆能力。
(3)空间探索试验(Spatial Probe Test)
完成定位航行试验后，在第6d进行测试。撤去平台，电脑软件于原平台位置设置虚拟平台，大鼠从第3象限入水，计算机机追踪系统记录整个实验过程，应用系统软件进行视频记录及数据分析，观察60s内大鼠穿越虚拟平台的次数，检测大鼠空间记忆能力。
3.实验结果
3.1 HE染色
术后7天(P9)及28天(P30)，HE染色检测Sham组、WMI组和Fasudil组的病理变化。结果显示，术后7d，WMI组大鼠脑室周围白质疏松、水肿，可见灶性坏死，Fasudil组大鼠脑室周围白质疏松、水肿减轻，未见明显坏死灶(见图1)；术后28d，WMI组大鼠胼胝体变薄，组织稀疏，Fasudil组与WMI组相比，胼胝体厚度及组织稀疏程度明显好转(见图1)。
实验结果表明，Fasudil可改善脑白质损伤病理改变。
3.2实验动物状态及体重变化
WMI组动物表现为反复刻板运动，有强直性抽搐，震颤，反应低下等表现。Fasudil组动物活动能力强，无抽搐，未见刻板运动。在术后28天即生后30天(P30)测量各组动物体重。结果表明，WMI组动物皮毛稀疏，体重减轻明显，Fasudil组动物毛色顺滑，体重增长可，较WMI组有明显改善，差异有统计学意义。
表1术后28天体重
P<0.01，*ONE-WAY ANOVA，与WMI组相比有统计学差异
3.3免疫荧光检测胼胝体区NG2、O4、MAG、MBP表达
术后28天(P30)，采用NG2标记OPCs，O4标记pre-OLs，MAG、MBP标记成熟OLs，免疫荧光检测胼胝体区NG2、O4、MAG、MBP的表达情况。结果显示，WMI组大鼠胼胝体区大量表达NG2、O4，髓鞘标记物MAG、MBP表达减少。与WMI组相比，Fasudil组大鼠胼胝体区NG2、O4表达减少，MBP、MAG表达增加(见图2)，对荧光强度进行定量分析显示，NG2、O4、MBP、MAG两组间的表达差异有统计学意义(图3-6)，表明Fasudil可显著促进OLs从pre-OLs向成熟OLs分化，促进胼胝体区髓鞘化。
3.4电镜显示胼胝体区髓鞘化情况
术后33天(P35)，使用透射电镜观察三组大鼠胼胝体区髓鞘化情况。结果显示，WMI组大鼠胼胝体区髓鞘化轴索较减少，髓鞘厚度变薄。与WMI组相比的，Fasudil处理组的髓鞘排列较紧密，髓鞘化轴索明显增加(图7-9)。表明Fasudil可促进胼胝体区髓鞘化。
3.5 Morris水迷宫结果
与WMI组相比，Fasudil组的大鼠在训练第5天潜伏期及平均潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义(图10)；在第6天时，Fasudil组的大鼠在游泳过程中平台穿越次数增加，差异有统计学意义(图11)。