一种基因抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用
阅读说明：本技术 一种基因抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用 (Application of gene inhibitor in preparation of medicine for treating ischemic heart disease ) 是由 刘婧星 王颖翠 于 2021-01-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基因抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用,属于心脏医学技术领域。本发明所提供的基因抑制剂为下调基因RP11-71G12.1的基因抑制剂,该基因抑制剂能够有效的促进冠状动脉内皮细胞增殖和血管生成,因此可将该基因抑制剂用于制备治疗缺血性心脏病治疗药物,为治疗缺血性心脏病提供新的治疗方向。(The invention provides an application of a gene inhibitor in preparing a medicine for treating ischemic heart disease, belonging to the technical field of cardiac medicine. The gene inhibitor provided by the invention is a gene inhibitor for down-regulating the gene RP11-71G12.1, and the gene inhibitor can effectively promote the proliferation and angiogenesis of endothelial cells of coronary arteries, so that the gene inhibitor can be used for preparing a therapeutic drug for treating ischemic heart diseases, and provides a new therapeutic direction for treating the ischemic heart diseases.)
本案为分案申请，原申请的发明名称为：一种冠状动脉内皮细胞血管生成促进剂，原申请的申请日为： 2021-01-15，原申请的申请号为：CN202110052771.5。
技术领域
本发明属于心脏医学技术领域，尤其涉及一种基因抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用。
背景技术
缺血性心脏病也被称为冠心病，是指由于冠状动脉粥样硬化使官腔狭窄或梗阻导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病，包括无症状性心肌缺血、心绞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭和心脏骤停。随着生活水平的不断提高，缺血性心脏病已经成为全球死亡的首要原因。缺血性心脏病患者主要通过建立心脏侧支循环来进行补充与代偿。在患者的急性血管闭塞时，可以通过血管原位膨大或延长生长与官腔扩张的方式进行治疗。而，当患者的慢性冠状动脉闭塞时，可以通过促进血管新生因子生成毛细血管的方式进行治疗。
尽管。目前临床上治疗缺血性心脏病的药物众多，但是由于缺血性心脏病的病理和生理机制十分复杂，因此单靶点药物治疗的效果并不理想。在这种情况下，血管新生成为了新的极具潜力的研究方向。通过治疗性血管新生能够有效的促进缺血心肌周围的血管生长，建立侧支循环，改善患者的缺血缺氧症状。因此，研究冠状动脉的血管生成有助于进一步治疗缺血性心脏病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冠状动脉内皮细胞血管生成促进剂。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种RP11-71G12.1基因作为靶点分子在促进血管生成中的应用，所述RP11-71G12.1基因的External Transcript ID为ENST00000457239.1，所述ENST00000457239.1的序列如SEQ ID NO.1所示。
此外，本发明提供了一种治疗缺血性心脏病的siRNA，所述siRNA为基因RP11-71G12.1的siRNA,所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.2所示，所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.3所示。
此外，本发明提供了基因RP11-71G12.1的抑制剂在制备治疗缺血性心脏病药物中的应用。
优选地，所述基因RP11-71G12.1的抑制剂为RP11-71G12.1的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.2所示，所述siRNA的反义链如SEQ ID NO.3所示。
此外，本发明提供了基因RP11-71G12.1的抑制剂在制备人冠状动脉内皮细胞增殖促进剂中的应用。
优选地，所述基因RP11-71G12.1的抑制剂为RP11-71G12.1的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.2所示，所述siRNA的反义链如SEQ ID NO.3所示。
此外，基因RP11-71G12.1的促进剂在制备人冠状动脉内皮细胞血管生成促进剂中的应用。
优选地，所述基因RP11-71G12.1的抑制剂为RP11-71G12.1的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.2所示，所述siRNA的反义链如SEQ ID NO.3所示。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种能够有效抑制基因RP11-71G12.1的siRNA；其次，本发明首次发现下调RP11-71G12.1能够有效的促进冠状动脉血管内皮细胞增殖和血管生成，因此可将RP11-71G12.1的siRNA用于制备治疗缺血性心脏病的药物，为治疗缺血性心脏病提供新的治疗方向。
附图说明
图1 si-RP11-71G12.1的敲减效果检测图；
图2下调si-RP11-71G12.1对于HCAEC细胞的细胞增殖的影响；
图3 下调si-RP11-71G12.1对于HCAEC细胞血管形成的影响；
图4 下调si-RP11-71G12.1对于血管内皮生长因子A表达的影响。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
设计和验证RP11-71G12.1的siRNA
（A）设计RP11-71G12.1 siRNA
根据RP11-71G12.1基因序列所设计的siRNA如下：
正义链：5’-UUCUUCUUCUUCUUCUUCCCA-3，SEQ ID NO.2；
反义链：5’-GGAAGAAGAAGAAGAAGAAAG-3’，SEQ ID NO.3；
（B）验证si- RP11-71G12.1的抑制效果
1.提取转染si-NC和si-RP11-71G12.1的人冠状动脉内皮细胞（HCAEC细胞）的RNA
（1）将HCAEC细胞接种于细胞培养板中，按照lip2000说明书转染si-NC和si-RP11-71G12.1，每组设置3个重复；
（2）转染48h后，去除培养基，使用PBS洗涤细胞3次，每孔加入1ml Trizol，吹打混匀之后，室温静置5min；
（3）将细胞转移至EP管中，加入200μl的氯仿，混匀后，室温静置5min；
（4）调整离心机参数为4℃，12000rpm/min，离心15min；
（5）离心之后，小心的吸取上层的水相至新的EP管中；
（6）加入等体积预冷的异丙醇，混匀后，室温静置10min，4℃ 12000rpm/min 离心10min；
（7）弃去上清，加入DEPC水配置的75%乙醇洗涤沉淀；
（8）调整离心机参数为4℃，8000rpm/min，离心5min；
（9）弃去上清，置于超净工作台中干燥至乙醇完全蒸发，加入30μl DEPC水。
2.逆转录得到cDNA
（1）去除基因组DNA
反应体系如下：
试剂
添加量
5×gDNA Eraser Buffer
2.0 μl
gDNA Eraser
1μl
Total RNA
1μg
RNase Free dH2O
up to 10 μl
反应条件如下：42℃ 2分钟，4℃保存。
（2）逆转录反应
反应体系如下：
试剂
添加量
步骤（1）的反应液
10μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I
1.0μl
RT Primer Mix
1.0 μl
5×PrimeScript Buffer 2
4.0 μl
RNase Free dH2O
4.0 μl
Total
20 μl
反应条件如下：37℃ 15min；85℃ 5s；4℃保存。
3.进行RT-PCR检测抑制效果
（1）设计RP11-71G12.1引物,引物序列如下：
上游引物：5’-AGCCTGTGTCAAGGTTCATGT-3’，SEQ ID NO.4；
下游引物：5’-TCATACCATGCATTGCTGTTCA-3’, SEQ ID NO.5；
（2）以GAPDH为内参，进行PCR反应，PCR反应体系如下：
试剂
添加量
cDNA
1μl
TaKaRa Ex Taq
0.5μl
10×Ex Taq buffer
5μl
dNTP mixture
4μl
Primer F
2μl
Primer R
2μl
ddH2O
35.5μl
PCR反应程序：
Step 1 94℃ 3min
Step 2 94℃ 1min， 60℃ 1min， 72℃ 1min， 35 Cycles
Step 3 72℃ 5 min
Step 4 4℃ forever；
（3）PCR结束后，进行电泳检测抑制效果，结果如图1所示，从图中可以看出，下调RP11-71G12.1能够有效的抑制RP11-71G12.1的表达。
实施例2
下调RP11-71G12.1促进人冠状动脉内皮细胞增殖
（1）将HCAEC细胞接种于96孔板中，分别转染si-NC和si-RP11-71G12.1，每组设置3个重复；
（2）转染48h后，使用CCK-8检测细胞的增殖情况并统计，统计结果如图2所示。
结果显示，下调RP11-71G12.1能够有效的促进人冠状动脉内皮细胞增殖(si-RP11-71G12.1组细胞的相对增殖率为1.381±0.046，显著高于si-NC组且差异具有统计学意义)。
实施例3
下调RP11-71G12.1促进人冠状动脉内皮细胞血管生成
（1）在96孔板中加入50μl Matrigel胶，轻轻的晃动96孔板使Matrigel胶铺平于孔内，37℃放置2h；
（2）将HCAEC细胞接种于6孔板中，分别转染si-NC和si-RP11-71G12.1，转染48h后，收集细胞；
（3）将细胞制备为单细胞悬液，加入至添加有Matrigel胶的96孔板中，每孔加入1×104个细胞；
（4）将96孔板放入细胞培养箱中，培养24h后，倒置显微镜下观察血管腔形成情况，图片结果如图3所示。
结果显示，下调RP11-71G12.1能够显著的增加HCARC细胞形成管腔的数目，说明下调RP11-71G12.1能够有效的促进人冠状动脉内皮细胞血管生成。
实施例4
下调RP11-71G12.1促进血管内皮生长因子A（VEGFA）的蛋白表达
（1）将HCAEC细胞接种于6孔板中，转染si-NC和si-RP11-71G12.1，每组设置三个重复；
（2）转染48h后，使用PBS洗涤细胞，每孔中加入100μl RIPA细胞裂解液，使用细胞刮刀将细胞刮下转移至EP管中；
（3）细胞裂解30min后，置于离心机中1200rpm/min，离心10min，取上清至新的EP管中；
（4）使用BCA法进行蛋白定量，加入5×上样缓冲液，沸水煮5min，得到蛋白样品；
（5）配置5%上层胶和12%下层胶，组装电泳槽，加入20µg蛋白样品和Marker指示剂，添加电泳液进行电泳；
（6）电泳结束后，组装电转夹，200mA转膜1.5h；
（7）电转结束后，将PVDF膜转移至5%的脱脂奶粉中，室温封闭1h；
（8）洗膜后，孵育VEGFA和GAPDH一抗，4℃孵育过夜；
（9）洗膜后，孵育相应的二抗，室温摇床孵育1h；
（10）暗室中，进行显影曝光，实验结果如图4所示。
结果显示，下调RP11-71G12.1促进血管内皮生长因子A的蛋白表达，该结果进一步验证了下调RP11-71G12.1能够有效的促进人冠状动脉内皮细胞血管生成。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛市第九人民医院
<120> 一种基因抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 471
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
cttaccttgg ggaagcctgt gtcaaggttc atgtagactg gacacggctc tccttcgcga 60
gatattcttg gagtcattgc atttgtgctg ttgatcctgg gagctgggct atacctctgg 120
aagaaatgtg ggaagaagaa gaagaagaaa gatgaagagg aagaagagga agaggagcag 180
aaggaggagg aggagcggga ggagacagga ataggcaggt tgcatttctc catcgaggcc 240
cagatatctc ccctccccca ctagaatctg ggttctcttt ctcctgaaag aatgtcattg 300
tttagctata tgaataaccc tagatatagc atcgagttaa catgtccaag atatttgtta 360
ctggaaaaaa ctgaacagca atgcatggta tgatttaatt tttgtaaaag tgtatagata 420
ggtagataga aagataagca cagaataaaa tctatactac atgacagatt a 471
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uucuucuucu ucuucuuccc a 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaagaagaa gaagaagaaa g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcctgtgtc aaggttcatg t 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcataccatg cattgctgtt ca 22