具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

本发明提供一种烫狗脊标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，通过对烫狗脊标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及原儿茶酸含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含原儿茶酸为0.80-5.20mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及原儿茶酸含量测定均采用液相色谱法测定。

本实施例中：

制备烫狗脊标准汤剂：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3号)中的煎煮法，取15批次烫狗脊饮片加水至没过药材约4-5cm，浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得15批次烫狗脊标准汤剂干膏粉。

1.性状考察

根据15批次烫狗脊标准汤剂的实物性状特征，描述为黄棕色至棕褐色的颗粒，气微，味淡、微涩。

2.干浸膏出膏率测试

取上述15批次烫狗脊饮片，按上述制法制得15批次标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率(见表1)，并计算平均得率为17.813％，按照标准汤剂出膏率允许范围(均值70％～130％)计算，出膏率允许范围为12.47％～23.16％，故拟定本品出膏率为12.5％～23.0％。

表1：出膏率

上述结果表明，15批次标准汤剂干浸膏出膏率为15.8％～20.2％，均符合拟定限度范围12.5％～23.0％。

3.薄层鉴别

本发明的产品为单味饮片烫狗脊的干燥提取物，参考《中国药典》烫狗脊“薄层鉴别”项下的方法，用原儿茶酸对照品作对照，建立了本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点清晰，故拟定为本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点清晰，阴性对照样品无干扰，故拟定为本品鉴别项。试验方法和结果如下：

试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验

供试品溶液制备：取本品2g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液制备：取原儿茶酸对照品适量，加甲醇溶解，制得浓度为1mg/mL的对照品溶液。

薄层色谱条件：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液与对照品溶液均为1uL；展开剂：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(12：2：1：0.8)；显色剂：喷以2％三氯化铁溶液-1％铁氰化钾溶液(1：1)(临用配制)，在日光下检视。

结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。详见图1所示本实施例中，15批次标准汤剂TLC图谱。

4.浸出物测定

取15批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果详见表2。

表2：浸出物测定结果

上述结果表明，15批次标准汤剂浸出物均值为52.46％，参考标准限度允许范围(均值70％～130％)的下限，拟定本品醇溶性浸出物不得少于37.0％，15批次标准汤剂测定结果均符合拟定限度要求。

5.特征图谱测试

5.1液相色谱法

色谱条件：色谱柱：C 18(250mmx4.6mm，5um)(Waters XSelec HSS T3)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：254nm。

表3：

(1)制备参照物溶液：取烫狗脊对照药材1.0g，加25mL水煎煮1小时，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇5mL，过滤，取滤液作为参照物溶液；

(2)制备对照品溶液：取原儿茶酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为0.1mg/mL的对照品溶液；

(3)制备供试品溶液：取烫狗脊标准汤剂样品1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

5.2方法学考察

提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，包括超声30min提取、回流30min提取，按上述5.1试验方法进行测定。结果表明，如图2和表4所示，超声30min与回流30min的主峰个数一致，主峰个数一致，主峰总峰面积RSD为0.29％，故选择样品提取方式为更安全便捷的超声处理30分钟。

表4：

提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按5.1试验方法进行测定。详见表5，结果表明，如图3所示，主峰个数一致，提取溶剂为甲醇时，主峰总峰面积最大，故确定以甲醇为提取溶剂。

表5：

样品取用量考察：分别取不同样品量制备供试品溶液，按5.1试验方法进行测定。如图4所示，结果表明，样品量1.0g为佳，故确定供试品称样量为1.0g(详见表6)。

表6：不同样品取用量考察结果

提取时间的考察：分别以不同的超声提取时间制备供试品溶液，按上述5.1试验方法进行测定。结果表明，如图5所示，不同提取时间差异不大，RSD为1.42％，超声30分钟主峰总面积略大(详见表7)，故确定供试品提取时间为超声30分钟。

表7：不同提取时间对比考察结果

综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取烫狗脊标准汤剂样品约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声20min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

5.3特征图谱分析方法验证

专属性考察：取供试品用溶剂甲醇10μL，按5.1色谱条件进行测定，试验表明，如图6所示，空白溶剂无干扰。

重复性试验：取同批样品(批号T210701)约1.0g，共6份，按5.1色谱条件进行测定，结果显示，6份供试品特征图谱中有6个共有峰，相对保留时间RSD小于3％，表明该方法重现性良好(详见图7、表8、表9)。

表8：重复性试验特征图谱相对峰面积

表9：重复性试验特征图谱相对保留时间

精密度试验：取同批样品约1.0g，按5.1色谱条件进行测定，连续进样6针测定，峰形、峰数基本一致，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的6个共有特征峰进行相似度的评价，相对保留时间RSD小于3％(详见图8、表10、表11)，表明仪器精密度良好。

表10：精密度试验特征图谱相对峰面积

表11：精密度试验特征图谱相对保留时间

稳定性试验：取同批样品约1.0g，按5.1色谱条件进行测定，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，特征图谱的峰形、峰数基本稳定，相对保留时间RSD小于3％，表明供试品溶液在24小时内较稳定。(详见表12、表13及图9)，表明供试品溶液在24小时内较稳定。

表12：稳定性试验特征图谱相对峰面积

表13：稳定性试验特征图谱相对保留时间

5.4标准汤剂特征图谱表征分析

标准汤剂特征图谱测定

按照5.3拟定的特征图谱分析方法，测定15批烫狗脊饮片标准汤剂及其制备使用的15批次药材特征图谱，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有6个共有峰，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中与原儿茶酸对照品溶液相对应的峰为峰6，共有峰特征图谱详见图10至图14。

特征色谱图相似度评价

采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对选定的6个共有特征峰进行相似度的评价，结果显示，15批烫狗脊饮片标准汤剂特征色谱图相似度均在0.9以上，表明本标准汤剂质量相对稳定。以原儿茶酸参照物峰相对应的峰(4)为S峰，计算共有峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围见表14。

表14：15批标准汤剂共有峰相对保留时间

综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性验证，均符合要求。标定了6个共有特征峰，其中峰6为原儿茶酸。以原儿茶酸参照物相对应的峰为S峰，计算另5个特征峰相对保留时间，以15批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：0.53(峰1)、0.71(峰2)、0.78(峰3)、1.11(峰5)、1.47(峰6)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差，其相对保留时间允许范围拟定为±10％。

6.含量测定

6.1试验方法

根据药典烫狗脊含量检测项，故以原儿茶酸作为含量指标成份。

试验方法如上述特征图谱测试中的液相色谱法。

色谱条件为：C 18(250mmx4.6mm，5um)(Waters XSelec HSS T3)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表15中的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟1.0ml；柱温：35℃；检测波长：254nm。

表15：

制备对照品溶液：取原儿茶酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成含原儿茶酸的浓度为0.1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

制备供试品溶液：取烫狗脊标准汤剂样品约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

6.2方法学考察

提取方法的考察：分别以样品回流、超声的提取方法制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，样品回流30min与超声30min差异性不大(功率250W,频率25KHZ)，且RSD为0.80％。(详见表16)，故选择样品更为便捷及安全提取方式为超声处理30分钟。

表16：不同提取方法原儿茶酸含量对比

提取时间的考察：分别以不同的提取时间制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，样品超声20min与超声30min及40min差异性不大(功率250W,频率25KHZ)，超声30min略高，且RSD为0.76％(详见表17)，故选择样品更为便捷及安全提取方式为超声处理30分钟。

表17：不同提取时间原儿茶酸含量对比

提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，提取溶剂为甲醇时，原儿茶酸含量最高，且RSD为0.76％(详见表18)，故确定以甲醇为提取溶剂。

表18：不同提取溶剂原儿茶酸含量对比

样品量考察：分别取不同样品量制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，供试品取样量为1.0g时最佳，原儿茶酸含量相对较高(详见表19)，故确定供试品称样量为1.0g。

表19：不同样品量原儿茶酸含量对比

6.2含量测定方法学验证

重复性试验：取同批次标准汤剂样品约1.0g，共6份，按上述6.1试验方法进行测定，计算样品中原儿茶酸含量的平均值为3.72mg/g，RSD值为054％，试验表明该方法重现性良好(详见表20)。

表20：

精密度试验：取6.1所示原儿茶酸对照品溶液，连续进样6针，照上述9.1试验方法测定其峰面积，计算原儿茶酸峰面积的RSD值为0.89％，表明仪器精密度良好(详见表21)。

表21：

稳定性试验：取一批标准汤剂样品约1.0g，按上述9.1试验方法，分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h进样，测定其峰面积，计算其峰面积的RSD值为0.33％，试验表明供试品溶液在24小时内较稳定(详见表22)。

表22：

线性范围试验：取原儿茶酸对照品溶液(浓度为0.105mg/ml)，分别以1ul、5ul、10ul、15ul、20ul、25ul。按6.1项下色谱条件进行测定。以原儿茶酸峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，其回归方程为：y＝3E+06x+34842，R²＝0.9998，可知原儿茶酸在0.2625mg～6.5625mg范围内与其峰面积具有良好的线性关系(见表23、图15)。

表23：原儿茶酸线性关系考察结果

加样回收率试验：精密称取样品(原儿茶酸含量为3.72mg/g)约0.5g，共6份，在6份样品中各加入已知浓度的原儿茶酸对照品溶液(0.105mg/ml)10ml，按6.1项下方法制备供试品溶液，并按6.1项下色谱条件进行测定，计算原儿茶酸平均加样回收率为94.08％，RSD为0.73％(详见表24)。

表24：原儿茶酸加样回收率试验结果

6.3标准汤剂及中药材含量测定

烫狗脊药材经产地初加工成约1cm段片，经净制后加工成烫狗脊饮片，净制过程中未经水洗、烘烤，只通过筛选，其原儿茶酸含量不会发生变化，因此烫狗脊饮片特征色谱图及原儿茶酸含量参考其药材数据。

按照上述拟定的含量分析方法，测定15批烫狗脊标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮片原儿茶酸含量，结果详见表25和表26。

表25：15批烫狗脊中药饮片原儿茶酸测定结果

表26：15批烫狗脊标准汤剂原儿茶酸测定结果

原儿茶酸含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对15批标准汤剂及其制备使用的中药饮片测定结果，计算原儿茶酸含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。烫狗脊饮片标准汤剂由烫狗脊饮片加水煎煮2次，滤液浓缩、冷冻干燥制得。其原儿茶酸含量转移率详见表27。

表27：15批烫狗脊标准汤剂原儿茶酸含量转移率

由以上数据可知，烫狗脊饮片依方案煎煮制得烫狗脊标准汤剂，本品原儿茶酸平均含量为1.92mg/g，测定含量值范围为1.10-4.00mg/g，SD：1.12。按均值70％～130％计算，原儿茶酸含量允许范围为1.35-2.50mg/g，按照低限取﹣SD，高限取﹢3SD来算，本标准汤剂原儿茶酸含量允许范围为0.80～5.28mg/g。

由以上数据可知，烫狗脊饮片依方案煎煮制得烫狗脊饮片标准汤剂，原儿茶酸平均转移率为64.02％，转移率测定值范围为37.8-87.8％，SD：19.43依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，按均值70％～130％计算，原儿茶酸含量转移率允许范围为44.81-83.23％。按照±2SD来算，原儿茶酸含量转移率允许范围为25.16～102.88％。结果表明，15批次标准汤剂中原儿茶酸含量及其转移率均在允许范围之内，可为烫狗脊配方颗粒质量研究提供参考依据。

本发明提供的烫狗脊标准汤剂质量检测方法，通过对烫狗脊标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及原儿茶酸含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定烫狗脊标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立烫狗脊汤剂可行的质量标准，实现烫狗脊标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。烫狗脊饮片依煎煮法制得烫狗脊饮片标准汤剂，原儿茶酸平均含量为1.92mg/g，测得含量范围为1.10-4.00mg/g，SD(标准差)为1.12，按均值70％～130％计算，原儿茶酸含量允许范围为1.35-2.50mg/g，按照低限取﹣SD，高限取﹢3SD来算，本标准汤剂的原儿茶酸含量允许范围为0.80～5.28mg/g。原儿茶酸平均转移率为64.02％，转移率范围为37.8％-87.8％，SD为19.43，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，原儿茶酸含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，原儿茶酸含量转移率允许范围为44.81-83.23％。按照±2SD来算，原儿茶酸含量转移率允许范围为25.16～102.88％。根据以上数据，拟定标准汤剂原儿茶酸含量测定限度为：0.80mg/g～5.20mg/g，含量转移率允许范围为25.0％～100.0％。结果表明，本发明多个批次标准汤剂中原儿茶酸含量及其转移率均在允许范围之内，因此本发明可为烫狗脊配方颗粒质量标准研究提供参考依据。

所述领域技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。