具体实施方式

本发明涉及提供一种使作为疫苗材料的流感病毒在宿主中更有效增殖的方法。

本发明的发明进行了反复深入的研究，结果发现：在感染流感病毒的宿主中，当抑制已知作为凋亡促进蛋白的Bax向线粒体内膜转移而抑制了凋亡时，不同于以往报道，病毒的增殖性提高，病毒的产量增加。

根据本发明的方法，能够使流感病毒有效增殖，能够大量生产用于疫苗制备的流感病毒。

在本发明中，作为流感病毒，可以为A型、B型、C型和D型中的任一种，但可以优选示例A型及B型。

另外，流感病毒的血凝素(红细胞凝集素HA：haemagglutinin)型(HA型)和神经氨酸酶型(NA型)也没有特别限制。例如，除H1N1株、H2N2株、H3N2株、H4N2株、H4N6株、H5N1株、H5N2株、H7N7株、H7N9株、H9N2株等目前已知的亚型外，还包含未来分离并鉴定的亚型。

另外，作为对象的病毒只要是能够感染人的病毒即可，此外也可以是对猪、鸟、马、牛具有感染能力的病毒。

另外，本发明的流感病毒可以是从感染动物或患者等感染个体中分离的病毒株，也可以是采用遗传工程学方法在培养细胞中建立的重组病毒。

在本发明中，“Bax”是指属于Bcl-2家族的凋亡促进蛋白。属于Bcl-2家族的蛋白具有一个以上称为BH(Bcl-2homology：Bcl-2同源)结构域的氨基酸序列。另外，在C末端侧具有疏水性高的TM(transmembrane：跨膜)区域，因此，能够在线粒体膜上转移并控制凋亡。

Bcl-2家族蛋白的主要功能是通过调节线粒体的通透性来控制凋亡。作为抗凋亡蛋白的Bcl-2和Bcl-xL存在于线粒体的外壁，抑制细胞色素c的释放。作为凋亡促进性蛋白的Bad、Bid、Bax和Bim存在于细胞质中，通过细胞死亡的信号向线粒体内膜移动，由此促进细胞色素c的释放。据认为，向细胞外流出的细胞色素c与Apaf-1形成复合体，激活Caspase9，并进一步激活Caspase 3、6、7，从而诱导凋亡(Annu Rev Genet(2009)43:95-118)。

在本发明中，“抑制Bax向线粒体内膜转移”是指抑制从病毒感染到释放的过程中在细胞内产生的信号转导所引起的Bax从细胞质向线粒体内膜转移。

作为抑制方案，只要可以抑制存在于宿主细胞质的Bax向线粒体内膜转移，就没有特别限定。例如，可举出将与Bax相互作用而抑制Bax向线粒体转移的分子(称为“Bax抑制剂”)应用于该细胞的方案、利用遗传工程学方法降低存在于细胞质内的Bax的方案等，但优选使用Bax抑制剂。即，在本发明中，Bax抑制剂被称为用于通过宿主的培养使流感病毒增殖的流感病毒增殖促进剂，能够用于通过宿主的培养使流感病毒增殖。另外，还可以说Bax抑制剂能够用于制造流感病毒增殖促进剂。

作为Bax抑制剂，优选可举出抑制Bax向线粒体内膜转移所需的Ku70蛋白与Bax结合的肽、化合物，例如，可举出Biochem Biophys Res Commun(2004)321:961-966)和NatCell Biol(2003)5:352-357)中记载的肽。

具体而言，可以举出Val-Pro-Met-Leu-Lys(序列号1)、Pro-Met-Leu-Lys-Glu(序列号2)、Val-Pro-Thr-Leu-Lys(序列号3)和Val-Pro-Ala-Leu-Arg(序列号4)，除此以外还可举出Val-Pro-Ala-Leu-Lys(序列号5)、Pro-Ala-Leu-Lys-Asp(序列号6)、Val-Ser-Ala-Leu-Lys(序列号7)和Ser-Ala-Leu-Lys-Asp(序列号8)等。

这样的Bax抑制剂的Bax抑制效果例如能够通过测定Bax与Ku70蛋白的结合抑制活性来评价。另外，在添加了Bax抑制剂的条件中，通过诱导该细胞凋亡并评价其凋亡细胞的比例而能够进行评价。

相对于用于使流感病毒(A型、B型、C型、D型)增殖的宿主，Bax抑制剂的浓度在1μM以上、优选在5μM以上、更优选在10μM以上，并且在1000μM以下、优选在500μM以下、更优选在200μM以下，另外，在1～1000μM、优选在5～500μM、更优选在10～200μM下使用。

流感病毒的增殖具体而言通过在宿主中使流感病毒感染的工序、以及在病毒可复制的条件下培养该感染宿主的工序来进行，但在本发明中，抑制Bax向线粒体内膜转移的工序例如在病毒感染前、病毒感染后、或与病毒感染同时进行。优选可举出将Bax抑制剂在病毒感染前、病毒感染后、或与病毒感染同时添加到宿主中。

作为用于流感病毒的增殖的宿主，可以为培养细胞或鸡胚中的任一种，但从供给稳定性的方面考虑，优选使用培养细胞。

作为培养细胞，可以使用对流感病毒具有敏感性的任何细胞。作为这种细胞，例如，可举出MDCK细胞(源自犬肾脏的株化细胞)、Vero细胞(源自非洲绿猴肾脏的株化细胞)、PER.C6(源自人视网膜细胞的株化细胞)、SK-NEP-1细胞(源自人肾脏的株化细胞)、A549(人肺泡基底上皮腺癌细胞)、Duck embryo细胞(鸭胚细胞)。这些细胞分别作为CCL-34、CCL-81、CCL-107、HTB-48、CCL-185、CCL-141等在ATCC(American Type Culture Collection：美国模式培养物保藏所)中注册，还能够从市场上购买。另外，作为对流感病毒显示敏感性的源自鸡的细胞，能够使用CEF细胞(Chicken embryonic fibroblast cell：源自鸡胚的成纤维细胞)。此外，CEF细胞中，除分离的细胞以外，还包含存在于鸡胚中的细胞。另外，流感病毒的增殖中也能够使用为了使流感病毒有效增殖而开发的细胞株。作为这样的细胞株，例如可举出EB66(注册商标)、DuckCelt-T17(注册商标)、EBx(注册商标)等，但不限定于这些细胞株。

在使用培养细胞作为宿主的情况下，作为用于培养细胞的培养基，可举出通常用于细胞培养的培养基，例如含有胎牛血清(FBS)的MEM培养基(Wako公司制)、无血清培养基(Serum-Free Medium)(Thermo Fisher公司制)等，可以使用任何一种。

为了提高细胞的增殖效率，可以在该培养基中添加非必需氨基酸和L-谷氨酰胺。另外，在流感病毒的培养中，可以添加胰蛋白酶或乙酰化胰蛋白酶等蛋白酶，以促进血凝素的裂解。另外，为了避免微生物的污染，也可以添加青霉素、链霉素、庆大霉素等在细胞培养中通常使用的抗生素。培养基的pH通过适当的缓冲液(例如，碳酸氢钠、HEPES)调整为适于动物细胞增殖的6.5～8，优选调整为6.8～7.3。

作为细胞培养的方法，可举出使细胞附着于培养器底部的静止培养、使细胞悬浮在培养基中而进行培养的悬浮培养，但以工业生产水平进行时，优选悬浮培养。作为悬浮培养的方法，可举出使细胞附着于微载体等载体并使其悬浮而进行培养的方法、或不使用载体而使细胞悬浮来进行培养的方法等，但也可以使用任何的方法。

细胞培养物(培养的细胞和培养基的混液)能够原样用于流感病毒的接种，但优选在流感病毒接种时通过新鲜的培养基或适当的缓冲液例如PBS、Tris缓冲液进行细胞的清洗。

具体而言，将在转瓶等中培养增殖的细胞进行低速离心或膜过滤，分离成细胞和培养上清，在离心沉渣或膜过滤浓缩液的细胞中添加新鲜培养基，使细胞悬浮，由此进行培养基更换。

在这样得到的细胞培养物中添加流感病毒液，并在一定条件下进行培养。病毒培养开始时的初期细胞密度能够使用0.001～100×10⁶cells/mL，但优选为0.01～10×10⁶cells/mL，更优选为0.1～10×10⁶cells/mL。此外，细胞密度的测定根据使用血球计等的通常的方法进行即可。细胞培养物中添加的流感病毒液能够以使感染滴度MOI(Multiplicity of infection：感染复数)成为0.00001～10的方式来添加，但能够优选以0.0001～0.1添加，更优选以0.0001～0.01添加。

另外，在使用鸡胚作为宿主的情况下，能够使用在33℃～38℃下、优选35～37℃，湿度条件为40～60％、优选45～55％的条件下孵蛋，通过1天进行1～24次、优选进行4～12次的转蛋而发育的鸡蛋。能够使用发育第8-13天的鸡蛋感染流感病毒，但优选感染第10-12天的鸡蛋。感染的病毒量以50％鸡蛋感染用量(50％Egg Infection Dose；EID₅₀)计，能够感染1～1×10⁶EID₅₀/Egg，但可以优选感染1×10²～1×10⁵EID₅₀/Egg，更优选感染1×10³～1×10⁴EID₅₀/Egg。感染部位期望在鸡蛋的绒毛尿囊膜内(尿囊液中)，但可以在羊膜内(羊水中)，只要是流感病毒在鸡蛋中增殖的部位，就没有限定。

培养条件可以是流感病毒在宿主内能够增殖的任何条件。可以根据细胞的种类、病毒接种量及培养规模和方法等的组合而适当地调节。例如，在使用培养细胞作为宿主的情况下，培养温度使用33℃～39℃，优选使用34～38℃，培养期间使用1～10天，优选使用3～7天，二氧化碳气体浓度使用3～8％，优选使用4～5％，氧浓度使用17～25％，优选使用20～22％。

另外，在使用鸡胚作为宿主的情况下，感染后在33℃～38℃、优选为34～36℃，培养期间为1～5天、优选为2～4天，湿度条件为40～60％、优选为45～55％的条件下培养，但由于增殖性最高的条件因病毒株而不同，所以能够适当组合培养期间、培养温度、湿度等。

根据本发明的方法，能够使流感病毒有效增殖。此外，宿主中的病毒含量能够通过使用豚鼠等的红细胞的红细胞凝集法(稀释倍数)、使用针对血凝素的抗体的ELISA法(μg/mL)、测定病毒感染滴度的噬斑测定法及TCID₅₀、能够测定病毒RNA量的实时PCR等进行测定。

在宿主为鸡胚的情况下，流感病毒包含于尿囊腔液(尿囊液)或羊水中，在宿主为培养细胞的情况下，流感病毒包含于培养上清中。在培养结束后，从宿主中的病毒悬浮液中回收病毒颗粒，通过浓缩、精制和灭活，能够制备灭活全颗粒疫苗、灭活裂解疫苗用的病毒颗粒。当用作活疫苗、减毒活疫苗时，在浓缩和精制后能够作为流感疫苗用的病毒颗粒进行制备。

病毒颗粒的回收通过将病毒悬浮液进行澄清化，具体而言通过进行离心分离或过滤来进行，接着，为了浓缩而进行超滤。病毒的精制能够使用蔗糖密度梯度离心分离等超离心分离和液相色谱法等方法进行。在灭活全颗粒疫苗和灭活裂解疫苗的情况下，精制病毒液通过福尔马林处理、紫外线照射、β-丙内酯、二乙烯亚胺(binary ethylenimine)等进行灭活处理。在用作活疫苗和减毒活疫苗的情况下，上述精制病毒液作为流感疫苗用的病毒颗粒进行制备。

在这样的流感病毒颗粒中可以适当添加作为医药可接受的载体(缓冲剂、乳化剂、保存剂(例如硫柳汞)、等渗剂、pH调整剂、佐剂(例如氢氧化铝凝胶)等，制备各种剂型的疫苗。

关于上述的实施方式，在本发明中还公开了以下方式。

＜1＞一种在宿主中增殖流感病毒的方法，其中，包括抑制宿主细胞的Bax向线粒体内膜转移的工序。

＜2＞根据＜1＞的方法，其中，抑制Bax向线粒体内膜转移的工序为将Bax抑制剂添加到上述细胞中的工序。

＜3＞根据＜2＞的方法，其中，Bax抑制剂为选自Val-Pro-Met-Leu-Lys(序列号1)、Pro-Met-Leu-Lys-Glu(序列号2)、Val-Pro-Thr-Leu-Lys(序列号3)、Val-Pro-Ala-Leu-Arg(序列号4)、Val-Pro-Ala-Leu-Lys(序列号5)、Pro-Ala-Leu-Lys-Asp(序列号6)、Val-Ser-Ala-Leu-Lys(序列号7)和Ser-Ala-Leu-Lys-Asp(序列号8)中的肽。

＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项的方法，其中，宿主为培养细胞或鸡胚。

＜5＞根据＜4＞的方法，其中，细胞为MDCK细胞(源自犬肾脏的株化细胞)、Vero细胞(源自非洲绿猴肾脏的株化细胞)、PER.C6(源自人视网膜细胞的株化细胞)、SK-NEP-1细胞(源自人肾脏的株化细胞)、A549(人肺泡基底上皮腺癌细胞)、Duck embryo细胞(鸭胚细胞)或源自鸡胚的成纤维细胞。

＜6＞根据＜2＞～＜5＞中任一项的方法，其中，对于用于使流感病毒(A型、B型、C型、D型)增殖的宿主，使用浓度1μM以上的Bax抑制剂，优选为5μM以上，更优选为10μM以上，并且，为1000μM以下，优选为500μM以下，更优选为200μM以下，另外，为1～1000μM，优选为5～500μM，更优选为10～200μM。

＜7＞一种流感病毒颗粒的制备方法，其通过＜1＞～＜5＞中任一项的方法使流感病毒增殖，并从宿主中回收病毒颗粒。

＜8＞根据＜7＞的方法，其中，所述病毒颗粒用于流感疫苗制备。

＜9＞一种以Bax抑制剂为有效成分的流感病毒增殖促进剂。

＜10＞Bax抑制剂用于促进流感病毒增殖的应用。

＜11＞Bax抑制剂在用于制造流感病毒增殖促进剂中的应用。

＜12＞根据＜9＞的促进剂或＜10＞或＜11＞的应用，其中，Bax抑制剂为选自Val-Pro-Met-Leu-Lys(序列号1)、Pro-Met-Leu-Lys-Glu(序列号2)、Val-Pro-Thr-Leu-Lys(序列号3)、Val-Pro-Ala-Leu-Arg(序列号4)、Val-Pro-Ala-Leu-Lys(序列号5)、Pro-Ala-Leu-Lys-Asp(序列号6)、Val-Ser-Ala-Leu-Lys(序列号7)和Ser-Ala-Leu-Lys-Asp(序列号8)中的肽。

实施例

实施例1使用源自犬肾小管上皮细胞的细胞株(MDCK细胞)的病毒增殖性评价试验

(1)将MDCK细胞(源自犬肾小管上皮细胞的细胞株，从DS Pharma BiomedicalCo.,Ltd.购入)在含有5％胎牛血清(FBS)的MEM培养基(Wako公司制)中，在37℃、5％CO₂存在下进行培养。将上述MDCK细胞接种到24孔板中，在融合的状态下用于试验。将上述接种到24孔板的MDCK细胞以PBS清洗后，以400μL/孔添加无血清培养基(Serum free medium，SFM；Gibco公司制)，并驯化1小时。

(2)以使感染滴度MOI(Multiplicity of infection：感染复数)＝0.001的方式使上述细胞感染作为A型流感病毒的H3N2流感病毒株(A/Memphis/1/1971)和H1N1pdm流感病毒株(A/Shizuoka/830/2009)，并孵育1小时。然后，以SFM进行清洗操作，以500μL/孔的量添加SFM培养基并培养23小时，其中，该SFM培养基以0-200μM浓度添加了Bax抑制剂(Baxinhibitor peptide(V5)(Val-Pro-Met-Leu-Lys(序列号1)；TOCRIS bioscience公司制))，并含有2.0μg/mL-乙酰化胰蛋白酶(Sigma公司制)。在感染24小时后回收培养上清，通过后述的HA测定法测定流感病毒的HA滴度(图1)。此外，在以后的实验中，在评价流感病毒增殖性的试验中，将含有2.0μg/mL-乙酰化胰蛋白酶的SFM培养培养基用于流感病毒的培养。

(3)HA测定法

使用U底96孔板，将50μL流感病毒培养上清以每次2倍的方式倍增至2-1024倍，以制备稀释系列。向其中添加50μL含有0.7％豚鼠红细胞的PBS，在4℃下静置2小时。然后，确认红细胞的凝集，将未观察到凝集的稀释浓度设为HA滴度。

(4)本研究的结果表明，Bax抑制剂的添加使H3N2和H1N1流感病毒株的HA滴度增加。

实施例2不同时间点添加Bax抑制剂促进流感病毒增殖效果的研究

(1)与实施例1相同，在SFM中将MDCK细胞驯化1小时后，以使感染滴度MOI＝0.001的方式感染H3N2和H1N1pdm流感病毒株，孵育1小时后，以SFM进行清洗操作，以100μM的浓度添加Bax抑制剂(Bax inhibitor peptide(V5))，培养20-47小时。在感染后21小时、24小时、48小时回收培养上清，通过HA测定法测定流感病毒的HA滴度(图2)。

本研究的结果表明，从培养早期阶段起，Bax抑制剂的添加就可使流感病毒株的HA滴度增加。

(2)另外，使用感染后21或24小时的培养上清，通过后述的焦点测定法对培养液中的流感病毒量进行定量(图3)。

1)焦点测定法

在12孔板中培养MDCK细胞，使细胞融合，以PBS清洗后，在SFM中驯化1小时。将在感染后21或24小时回收的流感病毒培养上清稀释成100-100000倍，以1mL/孔添加至上述12孔板中培养的MDCK细胞中，并孵育1小时，由此感染流感病毒。本试验通过三份样本的测定来进行。在感染后，以SFM进行清洗操作，以2.0mL/孔添加含有1.2％-Ceolus(旭化成化学，RC591)和2.0μg/mL-乙酰化胰蛋白酶(Sigma公司制)的SFM，培养30小时。在培养后，以冷却至4℃的PBS清洗孔3次之后，添加冷却至-20℃的100％甲醇(Wako公司制)，使细胞固定。使固定的细胞与一次抗体：Anti-NP antibody(小鼠杂交瘤细胞(4E6)细胞培养上清：Journalof Virology(2008)82:5940-5950)和二次抗体：HRP linked goat Anti-mouse IgG+IgM抗体(Jackson Immuno Research Laboratries公司制)反应，使用DEPDA反应与HRP反应，对被染色的焦点数进行计数。焦点测定法在独立的三份样本中进行测定，统计学分析使用Student’s t-test(图3和图5)或单因素方差分析(随后的Tukey-test，图7)，将风险率5％设为显著性水平(＊；p＜0.05、＊＊；p＜0.01、＊＊＊；p＜0.001)。

2)本研究的结果表明，Bax抑制剂的添加表现出H3N2和H1N1流感病毒株的病毒增殖性亢进效果。

实施例3 Bax抑制剂(2种类)低浓度条件下促进流感病毒增殖效果的研究

(1)与实施例1同样，在SFM中将MDCK细胞驯化1小时后，以使感染滴度Moi＝0.001的方式感染H3N2和H1N1pdm、H1N1(实验株)流感病毒株，孵育1小时后，以SFM进行清洗操作，以1.0μM的浓度添加Bax抑制剂(Bax inhibitor peptide(V5)(Val-Pro-Met-Leu-Lys(序列号1)和(P5)(Pro-Met-Leu-Lys-Glu(序列号2)；TOCRIS bioscience公司制))，培养23小时。在感染后24小时回收培养上清，通过HA测定法测定流感病毒的HA滴度(图4)。

本研究的结果表明，与实施例2比较，Bax抑制剂的添加即使在低浓度条件下，也能够使H3N2和H1N1pdm、H1N1(实验株)流感病毒株的HA滴度增加。而且，在使用序列号2时也观察到了流感病毒的HA滴度的增加。

(2)另外，使用添加了序列号2的感染后24小时的培养上清，与实施例2(2)同样，通过焦点测定法对流感病毒量进行定量(图5)。

本研究的结果表明，通过添加序列号2的Bax抑制剂，H3N2和H1N1pdm、H1N1(实验株)流感病毒株的病毒增殖性亢进。

实施例4 Bax抑制剂(2种类)促进B型流感病毒增殖效果的研究

(1)与实施例3同样，将使用的病毒株变更为B型流感病毒株(B/Lee/1940)，并对病毒的增殖性进行评价。以使Moi＝0.01的方式感染B型流感病毒，孵育了1小时后，以SFM进行清洗操作，以0～100μM的浓度添加Bax抑制剂(Bax inhibitor peptide(V5)(Val-Pro-Met-Leu-Lys(序列号1)和(P5)(Pro-Met-Leu-Lys-Glu(序列号2)；TOCRIS bioscience公司制))，培养47小时。在感染后48小时回收培养上清，通过HA测定法测定了流感病毒的HA滴度(图6)。

本研究的结果表明，Bax抑制剂的添加使B型流感病毒株的HA滴度增加。

(2)另外，使用感染后48小时的培养上清，通过下述的噬斑测定法定量培养液中的流感病毒量(图7)。

1)噬斑测定法

在12孔板中培养MDCK细胞，使细胞融合，以PBS清洗后，在SFM中驯化1小时。将在感染后48小时回收的B型流感病毒培养上清稀释成100-100000倍，以1mL/孔添加至上述12孔板中培养的MDCK细胞中，并孵育1小时，由此，感染B型流感病毒。通过三份样本的测定进行本试验。在感染后，以SFM进行清洗操作，以2.0mL/孔添加含有0.8％-琼脂糖(Lonza Japan株式会社，SeaKem(注册商标)Gold Agalose)和2.0μg/mL-乙酰化胰蛋白酶(Sigma公司制)的SFM，培养47小时。在培养后，在各孔中添加1mL的以乙醇:醋酸＝5:1混合的溶液，在4℃下静置一晩以上，由此使细胞固定。将固定的细胞用1％(w/v)浓度的结晶紫溶液染色，用PBS清洗后，对细胞随着病毒感染而脱落的部分(噬斑)的数量进行计数。

2)本研究的结果表明，序列号1和序列号2的Bax抑制剂对于B型流感病毒株也显示病毒增殖性亢进效果。

实施例5 Bax抑制剂在鸡胚中促进流感病毒增殖效果的研究

(1)使用发育第11天的鸡胚对H1N1流感病毒株(A/PuertoRico/8/1934)的增殖性进行了评价。对照组中，以使50％鸡蛋感染用量(50％Egg Infection Dose；EID₅₀)成为5×10²EID₅₀/鸡蛋的方式感染H1N1流感病毒，在对照-10倍量组中，以5×10³EID₅₀/鸡蛋的方式感染。Bax抑制剂组(添加Val-Ser-Ala-Leu-Lys(序列号7)的组)中，以使将鸡蛋的尿囊液量设为5mL时Bax抑制剂的最终浓度成为10μM的方式，将上述肽添加到病毒溶液中进行感染操作。感染液量在所有组中均设为200μL/鸡蛋。在感染后48小时从鸡胚中回收尿囊液，与实施例2(2)同样，通过焦点测定法对流感病毒量进行了定量(图8)。误差条表示标准误差。

(2)本研究的结果表明，Bax抑制剂的添加使H1N1流感病毒株的病毒滴度增加至1.27倍。而且，通过添加Bax抑制剂，与感染10倍量病毒的鸡胚相比，得到的病毒滴度提高。

序列表

<110> 花王株式会社

静冈县公立大学法人

<120> 增殖方法

<130> KS1650

<150> JP 2019-024777

<151> 2019-02-14

<150> JP 2019-226747

<151> 2019-12-16

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

Val Pro Met Leu Lys

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Pro Met Leu Lys Glu

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Val Pro Thr Leu Lys

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Val Pro Ala Leu Arg

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Val Pro Ala Leu Lys

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Pro Ala Leu Lys Asp

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Val Ser Ala Leu Lys

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

Ser Ala Leu Lys Asp

1 5