发明详述

缩写

cGMP -现行良好生产过程规范

CNS -中枢神经系统

DMEM -达氏改良伊氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)

DMSO -二甲亚砜

DPBS -达氏磷酸盐缓冲盐水

EC -胚胎瘤

EC细胞 -胚胎瘤细胞；hEC细胞是人胚胎瘤细胞

ECM -胞外基质

ED细胞 -胚胎衍生细胞；hED细胞是人ED细胞

EDTA -乙二胺四乙酸

EG细胞 -胚胎生殖细胞；hEG细胞是人EG细胞

ES细胞 -胚胎干细胞；hES细胞是人ES细胞

FACS -荧光激活细胞分选

FBS -胎牛血清

GMP -良好生产管理规范

hED细胞 -人胚胎衍生细胞

hEG细胞 -人胚胎生殖细胞，是源自胎儿组织原始生殖细胞的干细胞。

hiPS细胞 -人诱导性多能干细胞，是具有hES相似性质的细胞，从接触hES特异性转录因子后的体细胞获得，这些转录因子如SOX2、KLF4、OCT4、MYC或NANOG、LIN28、OCT4和SOX2。

HSE -人皮肤等同物，是细胞与生物或合成基质的混杂物，制备用于测试目的或治疗应用以促进伤口修复。

ICM -哺乳动物胚泡阶段的内细胞团。

iPS细胞 -诱导性多能干细胞，是具有hES相似性质的细胞，从接触ES特异性转录因子后的体细胞获得，这些转录因子如SOX2、KLF4、OCT4、MYC或NANOG、LIN28、OCT4和SOX2。

iTR -诱导性组织再生

LOH -丧失杂合性

MEM -极限必需培养基(Minimal essential medium)

NT -核移植

PBS -Phosphate buffered saline

PNS -外周神经系统

PS成纤维细胞-成疤前成纤维细胞，是源自孕早期皮肤或源自ED细胞的成纤维细胞，呈现基因表达的产前模式，促进皮肤伤口的快速愈合而无疤痕形成。

RFU -相对荧光单位

SCNT -体细胞核移植

SFM -无血清培养基

TR -组织再生

定义

术语"分析重编程技术"指将体细胞的基因表达模式重编程至更多能状态的多种方法，所述状态如iPS、ES、ES、ED、EC或EG细胞的状态，其中，重编程发生于多个且离散的步骤中，并且不简单依赖于将体细胞移植入卵母细胞并激活该卵母细胞(参见：美国申请号60/332,510，申请日2001年11月26日；10/304,020，申请日2002年11月26日；PCT申请号PCT/US02/37899，申请日2003年11月26日；美国申请号60/705625，申请日2005年8月3日；美国申请号60/729173，申请日2005年8月20日；美国申请号60/818813，申请日2006年7月5日；PCT/US06/30632，申请日2006年8月3日；各文件的公开通过引用纳入本文)。

本文所用术语"抗体"指免疫球蛋白或其部分，且涵盖包含抗原结合位点而不论其来源、制备方法或其它特性的任意多肽。该术语包括例如：多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变和CDR接枝抗体。抗体的部分可包括能结合抗原的任意片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv。

术语"卵裂球/桑葚胚细胞"指哺乳动物胚胎中的卵裂球或桑葚胚或者体外培养的卵裂球或桑葚胚细胞，无论是否有此类细胞的已分化衍生物在内的其它细胞。

术语"表达基因X的细胞"，"基因X在细胞中表达"(或细胞群)，或其等同表达表示用特定测试平台分析所述细胞得到阳性结果。反之亦然(即，不表达基因X的细胞，或其等同表达意味着用特定测试平台分析所述细胞得到阴性结果)。因此，本文所述的任何基因表达结果关联到测试平台(或多个平台)就所指基因采用的一种或多种探针。

术语"细胞系"指能体外增殖和扩增的细胞的非永生或永生群体。

术语"细胞重建"指染色质核转移至细胞质以获得功能性细胞。

术语"克隆(clonal)"指从单一细胞扩增成群体所得的细胞群，群体内的细胞都源自原始的单一细胞而不含其它细胞。

术语"集落原位分化"指细胞(例如，hES、hEG、hiPS、hEC或hED)集落的原位分化而不涉及从培养容器移除或分散集落，容器内所述集落作为未分化干细胞系增殖。集落原位分化不利用形成拟胚体的中间步骤，尽管在一段时间的集落原位分化后仍可利用拟胚体形成或其它聚集技术如旋动培养。

术语"胞质泡(cytoplasmic bleb)"指由完整或经通透处理但仍完整的质膜为界但没有核的细胞的胞质。

涉及由本发明的方法从多能干细胞指导的细胞时，术语"已分化细胞"指相比母本多能干细胞分化能力有所减弱的细胞。本发明所述已分化细胞包含可进一步分化的细胞(即，并非已终末分化)。

术语"直接分化"指用本领域已知的任意方法直接分化任意下述细胞类型：卵裂球细胞、桑葚胚细胞、ICM细胞、ED细胞或重编程至未分化状态的体细胞，而无分离和或增殖分离的未分化干细胞(例如hES细胞)为未分化细胞系的中间状态。直接分化的非限制性示例是将完整的人胚泡培养成培养物并衍生ED细胞而不产生人ES细胞系，如文献所述(Bongso等，1994.Human Reproduction 9:2110)。

术语"发育的胚胎阶段"指细胞、组织或动物的发育的产前阶段，特别是与胎儿或成熟细胞相比的细胞发育的胚胎期。在人物种的情形中，从胚胎到胎儿发育的转化发生在产前发育约8周，小鼠中该转化的发生大致在16天，而大鼠物种中，则在约17.5天。

术语"胚胎干细胞"(ES细胞)指源自胚泡的内细胞团、卵裂球或桑葚胚的细胞，其作为细胞系经过系列传代而维持未分化状态(例如，表达该物种ES细胞特异性的TERT、OCT4和SSEA及TRA抗原)。ES细胞可源自用精子或DNA、核移植、雌核发育进行的卵细胞体外授精，或通过用本领域已知手段产生MHC区半合或纯合的hES细胞。尽管ES细胞在历史上被定义成能够分化成全部体细胞类型以及在植入移植前胚胎时能分化成生殖系细胞，来自很多物种包括人的候选ES培养物通常不产生生殖系分化，并因此被称为"ES样细胞"。通常认为人ES细胞实际上是"ES样"的，但是本申请中，我们采用术语ES细胞来同时指代ES和ES样细胞系。

术语"人胚胎衍生(型)"("hED")细胞指卵裂球衍生细胞，桑葚胚衍生细胞，胚泡衍生细胞包括内细胞团、胚盾或外胚层的细胞，或者早期胚胎包括原始内胚层、外胚层、中胚层和神经嵴的其它全能或多能干细胞及其衍生物，这些衍生物以分化状态关联至正常人发育最初8周的等同状态为上限，但排除已作为细胞系传代的hES细胞所衍生的细胞(参见例如Thomsom的美国专利：7,582,479；7,217,569；6,887,706；6,602,711；6,280,718和5,843,780)。hED细胞可衍生自移植前胚胎，这些胚胎是通过用精子或DNA、核转移或染色质转移使卵细胞受精，卵细胞通过孤雌发育诱导形成孤雌生殖体(parthenote)，分析重编程技术，或者具有HLA区半合性或纯合性的hES的产生方法来制得。

术语"人胚胎生殖细胞"(hEG细胞)指能分化成身体内不同组织的衍生自胎儿组织原生殖细胞或者成熟中(maturing)或成熟型(mature)生殖细胞如卵母细胞和精原细胞的多能干细胞。hEG细胞也可衍生自雌核发育或雄核发育手段所得多能干细胞，即，这些方法中所述多能细胞是衍生自仅含雄性或雌性来源DNA的卵母细胞并因此会包含全部雌源(female-derived)或雄源(male-derived)DNA(参见美国申请号60/161,987，申请日1999年10月28日；09/697,297，申请日2000年10月27日；09/995,659，申请日2001年11月29日；10/374,512，申请日2003年2月27日；PCT申请号PCT/US/00/29551，申请日2000年10月27日；这些记载通过引用全文纳入本文)。

术语"人胚胎干细胞"(hES细胞)指人的ES细胞(参见例如：Thomson的美国专利7,582,479；7,217,569；6,887,706；6,602,711；6,280,718和5,843,780)。

术语"人iPS细胞"指具有与hES细胞相似性质的细胞，这些性质包括在植入免疫削弱小鼠中时形成全部三个胚层的能力，其中所述iPS细胞自不同体细胞谱系的细胞在接触去分化因子后衍生得到，这些因子的示例有hES细胞特异性转录因子组合：KLF4、SOX2、MYC和OCT4或SOX2、OCT4、NANOG和LIN28。可用去分化因子的任意常规组合来产生iPS细胞。所述iPS细胞可通过用载体如本领域已知的逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体表达这些基因，或通过以蛋白形式引入这些因子(例如，通过通透化或其它技术)来产生。此类示例性方法的描述可参见：PCT申请号PCT/US2006/030632，申请日2006年8月3日；美国申请号11/989,988；PCT申请PCT/US2000/018063，申请日2000年6月30日；美国申请号09,736,268，申请日2000年12月15日；美国申请号10/831,599，申请日2004年4月23日；和美国申请公布号20020142397(申请号10/015,824，题为"Methods for Altering Cell Fate(改变细胞命运的方法)")；美国申请公布号20050014258(申请号10/910,156，题为"Methods forAltering Cell Fate(改变细胞命运的方法)")；美国申请公布号20030046722(申请号10/032,191，题为"Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatinor donor cells(用重编程的供体染色质或供体细胞克隆哺乳动物的方法)")；和美国申请公布号20060212952(申请号11/439,788，题为"Methods for cloning mammals usingreprogrammed donor chromatin or donor cells(用重编程的供体染色质或供体细胞克隆哺乳动物的方法)")，这些全部通过引用全文纳入本文。

术语"ICM细胞"指哺乳动物内胚胎细胞团的细胞或带或不带周围的滋养外胚层所体外培养的内细胞团的细胞。

术语"诱导性组织再生"指使用本发明的方法改变胎儿或成熟哺乳动物细胞的分子组成使得所述细胞能够在组织受伤后再生功能性组织，其中在没有下文所述人力干预的情况下原本不会发生所述再生。

术语"分离(的)"指某物质是(i)与天然情况下与其同见的至少一些其它物质相分离，通常所用过程涉及人力，(ii)人工制得的(例如，化学合成)，和/或(iii)存在于人工环境或情境(即，并非其天然情况所见的环境或情境)。

术语"iTR因子"指以将天然条件下不能TR的组织产生TR的方式改变TR激活子和TR抑制子水平的那些分子。

术语"iTR基因"指其表达的改变会在天然条件下不能再生的组织中引起诱导性组织再生的那些基因。

术语"核酸"与"多核苷酸"可互换使用，并涵盖多种实施方式，天然产生的核苷聚合物如DNA和RNA，以及非天然产生的核苷或核苷类似物的聚合物。在一些实施方式中，核酸包含标准核苷(缩写为A、G、C、T、U)。在其它实施方式中，核酸包含一种或多种非标准核苷。在一些实施方式中，一个或多个核苷是非天然产生的核苷或核苷酸类似物。核酸可含有带修饰碱基(例如，甲基化碱基)，带修饰糖(2'-氟化核糖、阿拉伯糖或己糖)，带修饰磷酸基团或者核苷或核苷类似物之间的其它连接(例如，硫代磷酸酯或5'-N-亚磷酰胺连接)，锁核酸(locked nucleic acid)或吗啉代。在一些实施方式中，核酸含有由磷酸二酯键连接的核苷，正如在DNA和RNA中。在一些实施方式中，至少一些核苷是由非磷酸二酯键连接的。核酸可以是单链、双链或部分双链的。至少部分为双链的核酸可具有一个或多个突出端，例如，5'和/或3'突出端。本领域已知可用于研究或治疗目的的RNA干扰(RNAi)、适体或基于反义的分子的核酸修饰(例如，核苷和/或主链修饰，包括非标准核苷的使用)考虑到用于本发明的不同实施方式中。参见例如：Crooke,S T编著，Antisense drug technology:principles,strategies,and applications(反义药物技术：原理、策略与应用)，博卡拉顿(Boca Raton,)：CRC出版社，2008；Kurreck,J.编著，Therapeutic oligonucleotides,RSCbiomolecular sciences.(治疗性寡核苷酸，RSC分子生物科学)，剑桥：皇家化学会，2008。在一些实施方式中，修饰使核酸(例如，在体内)的半衰期和/或稳定性相比相同长度和链型(strandedness)的RNA或DNA有提高。在一些实施方式中，修饰使核酸免疫原性相比相同长度和链型(strandedness)的RNA或DNA有提高。在一些实施方式中，核酸的一条或两条链中有5％-95％的核苷被修饰。修饰位置可以均匀或不均匀，且可选择修饰的位置(例如，靠近中部，靠近或位于末端，交替，等等)以增强所需性质。核酸可包含可检测标记，例如荧光染料、放射性原子等。

"寡核苷酸"指相对短的核酸，例如，通常长约4到约60个核苷酸。本文提及多核苷酸时，可理解为DNA、RNA，且各种情况都提供单链和双链形式(及各单链分子的互补体)。本文所用"多核苷酸序列"可指多核苷酸材料本身和/或生物化学上表征特定核酸的序列信息(即，用作碱基缩写的连续字母)。除非另有指明，本文所示多核苷酸序列以5'至3'方向表示。

术语"寡克隆(oligoclonal)"指源自小群细胞的细胞群体，所述小群通常有2-1000个细胞，看来具有相似特性如外观或分化标记的有无，这些分化标记将所述细胞与同一培养中的其它细胞相区分。寡克隆细胞是与不共有这些相同特性的细胞相分离的，并能增殖，产生基本完全衍生自相似细胞原始群的细胞群体。

术语"多能干细胞"指能够分化成超过一种已分化细胞类型的动物细胞。此类细胞包括hES细胞，卵裂球/桑葚胚细胞及其衍生的hED细胞、hiPS细胞、hEG细胞、hEC细胞，和成熟体衍生型细胞，包括间充质干细胞，神经干细胞和骨髓衍生干细胞。多能干细胞可经遗传修饰或未经遗传修饰。经遗传修饰的细胞可包括标记物如荧光蛋白来帮助在卵内识别这些细胞。

术语"多肽"指氨基酸的聚合物。术语"蛋白质"和"多肽"在本文中可互换使用。肽是相对短的多肽，通常长约2到60个氨基酸。本文所用多肽通常含有标准氨基酸(即，蛋白质中最常见的20种L-氨基酸)。但是，某些实施方式中，多肽可含有一种或多种本领域已知的非标准氨基酸(可以是天然产生或非天然产生的)和/或氨基酸类似物。多肽内的一个或多个氨基酸可带修饰，例如，通过添加化学实体如碳水化合物基团、磷酸基团、脂肪酸基团、接头以供偶联、官能化等。共价或非共价连接有非多肽部分的多肽仍被视为"多肽"。多肽可纯化自天然来源，用重组DNA技术生成，通过化学方法合成如常规固相肽合成等。本文所用"多肽序列"或"氨基酸序列"可指多肽材料本身和/或生物化学上表征多肽的序列信息(即，用作氨基酸名称缩写的连续字母或三字母代码)。除非另有指明，本文所示多肽序列以N-末端至C-末端方向表示。多肽可以是环状的或含有环状部分。本文讨论天然产生的多肽时，应理解本发明涵盖涉及其任何同种型(例如，从相同基因由于可变剪接或mRNA编辑而产生，或由基因的不同等位基因产生的不同蛋白质，例如，等位基因之间可相差一个或多个多核苷酸多态性，通常此类等位基因可与参比或共有序列有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性)的多种实施方式。多肽可含有将其靶向供分泌或靶向至特定胞内隔室(例如，核)的序列和/或将所述多肽靶向供翻译后修饰或降解的序列。某些多肽可合成为前体，前体经过翻译后切割或其它加工以成为成熟多肽。一些情况中，此类切割可能仅在特定激活事件后发生。相关时，本发明提供涉及前体多肽的多种实施方式和涉及多肽的成熟形式的多种实施方式。

术语"(已)合并克隆"指通过两个或多个克隆群体的组合获得的细胞群体，由此产生的细胞群体与克隆群体类似具有均一的标记物例如基因表达标记物，但该群体并非全部细胞都源自同一原始克隆。所述合并克隆系可包括单一或混杂基因型的细胞。合并克隆系在克隆系在增殖期限内较早分化或早期有不利改变的情形中特别有用。

术语"产前"指胎盘哺乳动物的胚胎发育阶段，此前动物不能脱离子宫存活。

术语"原始干细胞"指能分化成全部三种主要生殖层(外胚层、内胚层和中胚层)和神经嵴的各种细胞的多能干细胞的总称。因此，原始干细胞的示例将包括但不限于人或非人哺乳动物ES细胞或细胞系，卵裂球/桑葚胚细胞及其衍生的ED细胞，iPS和EG细胞。

术语"纯化(的)"指试剂或实体(例如，化合物)已与其天然状态或原始产生时共存的大多数组分相分离。通常，这样的纯化涉及人力的作用。纯化的试剂或实体可以是部分纯化、基本纯化或纯的。例如，这样的试剂或实体可以是至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％纯的。在一些实施方式中，核酸或多肽是纯化使其在制品中所含总核酸或多肽材料占至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。纯度可以基于(例如)干重，色谱迹线上的峰大小，分子丰度，凝胶上的条带强度，或与分子丰度关联的任何信号的强度，或者任何本领域接受的定量方法。在一些实施方式中，纯化制品中可以任选存在水、缓冲剂、离子和/或小分子(例如，前体如核苷酸或氨基酸)。纯化的分子可通过将其与其它物质(例如，其它细胞材料)相分离或通过以获得所需纯度的方式生成来制得。在一些实施方式中，纯化的分子或组合物指用任何本领域接受的纯化方法制得的分子或组合物。在一些实施方式中，"部分纯化(的)"意味着细胞生成的分子不再存在于细胞内，例如细胞已被裂解，并可任选已去除至少一些细胞材料(例如细胞壁、细胞膜、细胞器)。

术语"RNA干扰"(RNAi)用于指下述现象：双链RNA(dsRNA)引起与该dsRNA的一条链具有互补性的相应mRNA发生序列特异性降解或翻译抑制。应理解dsRNA的链与mRNA之间的互补性无需100％而是仅需足以介导基因表达的抑制(也称为"沉默"或"敲减")。例如，互补性的程度是使得链能够(i)在RNA诱导性沉默复合物(RISC)中引导该mRNA的切割；或者(ii)导致该mRNA的翻译抑制。在某些实施方式中，RNA的双链部分长度不足30个核苷酸，例如长17到29个核苷酸。在某些实施方式中，dsRNA的第一链与靶mRNA的互补性至少为80％、85％、90％、95％或100％，而dsRNA的另一链与第一链的互补性至少为80％、85％、90％、95％或100％。哺乳动物细胞中，RNAi的实现可通过将合适的双链核酸引入细胞或在细胞内表达核酸，所述核酸后续被胞内加工产生dsRNA。能介导RNAi的核酸在本文中称作"RNAi剂"。能介导RNAi的示例性核酸有短发夹RNA(shRNA)，短干扰RNA(siRNA)和小RNA(microRNA)前体。这些术语已熟知，且本文中的运用以其本领域的含义一致。siRNA通常含有两条不同的核酸链，两条链彼此杂交形成双链体。它们可体外合成，例如，采用标准核酸合成技术。siRNA通常是的双链寡核苷酸，每条链有16-30个核苷酸，例如s16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸(nt)，其中所述双链寡核苷酸含有长15-29个核苷酸的双链部分且两条链中其一或两者可含有3'突出端(例如，长1-5个核苷酸)，或者两条链中其一或两者为钝端。在一些实施方式中，siRNA所含链的长度在19到25个nt，例如常21和23和核苷酸，其中一条或两条链含有1-2个核苷酸的3'突出端。siRNA的双链部分的一条链(名为"引导链"或"反义链")与mRNA中的目标区域基本互补(例如，至少80％或更高，例如85％、90％、95％或100％)(例如，有3、2、1或0个错配核苷酸)，且其它双链部分与第一双链部分基本互补。在某些实施方式中，引导链与mRNA的目标区域100％互补，而另一随从链与第一双链部分100％互补(应理解，在不同实施方式中，引导链的3'突出端如果存在，则在引导链与mRNA杂交时该突出端可以与该mRNA互补或不互补)。在一些实施方式中，shRNA分子是含有茎环的核酸分子，其中双链的茎长16-30个核苷酸而环则长约1-10个核苷酸。siRNA可包括多种不同的带修饰核苷、核苷类似物，并可包括化学或生物修饰的碱基、带修饰主链等。不构成限制，本领域认为可用于RNAi的任意修饰均可使用。一些修饰导致稳定性、细胞摄取、效力等的提升。一些修饰导致免疫原性或清除的降低。在某些实施方式中，siRNA包括长约19-23(例如，19、20、21、22或23)个核苷酸的双链体，并可选有一或两个长1-5个核苷酸的3'突出端，其可由脱氧核糖核苷酸组成。shRNA包含单一核酸链，其含有由主要为非自体互补性的区域相隔的两个互补区域。这些互补部分杂交形成双链体结构而非自体互补区域形成环连接双链体一条链的3'端及另一链的5'端。shRNA经历胞内加工以产生siRNA。通常，环长为1-8个核苷酸，例如2-6个核苷酸。

小RNA(miRNA)是天然产生的非编码单链小型RNA，约21-25个核苷酸(在哺乳动物系统中)，其以序列特异性方式抑制基因表达。它们在胞内从前体(前体-miRNA)产生，所述前体具有含短发夹(长约70个核苷酸)的特征性二级结构，发夹含有通常包括一或多个不完全互补的区域，其继而由较大前体(前体-miRNA)所产生。天然产生的miRNA通常仅与其目标mRNA部分互补且往往通过翻译抑制起作用。本发明的某些实施方式利用在内源miRNA或miRNA前体上建模的RNAi剂。例如，siRNA可设计成使得一条链与目标mRNA杂交但有一个或多个错配或鼓起，模拟miRNA及其目标mRNA形成的双链体。此类siRNA可称作miRNA模拟物或miRNA样分子。miRNA模拟物可由前体核酸编码，这些前体核酸的结构模拟天然产生的miRNA前体。

在某些实施方式中，RNAi剂是载体(例如，质粒或病毒)，其含有模板供转录siRNA(例如，可彼此杂交的两个分开的链)、shRNA或小RNA前体。通常，如本领域所知，编码siRNA、shRNA或miRNA前体的模板被可操作地连接至表达控制序列(例如，启动子)。此类载体可用来将模板引入脊椎动物细胞，例如，哺乳动物细胞，并导致siRNA、shRNA或miRNA前体的瞬时或稳定表达.前体(shRNA或miRNA前体)被胞内加工以产生siRNA或miRNA。

通常，小的RNAi剂如siRNA可化学合成或可自DNA模板体外或体内转录得到，转录所得为两条此后杂交的分离的链或是此后被加工产生siRNA的shRNA。RNAi剂特别是含有修饰的那些往往是化学合成的。化学合成寡核苷酸的方法是本领域熟知的。

本文所用术语"小分子"是分子量低于约2KDa的有机分子。在一些实施方式中，小分子小于约1.5KDa或小于约1KDa。在一些实施方式中，小分子小于约800Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da或100Da。通常，小分子的质量至少为50Da。在一些实施方式中，小分子含有多个碳碳键并可含有一个或多个杂原子和/或对与蛋白质的结构性相互作用(例如，成氢键)很重要的一个或多个官能团，例如，胺、羰基、羟基或羧基，并且在一些实施方式中有至少两个官能团。小分子通常含有包含一个或多个环状碳或杂环结构和/或芳环或多芳环结构，任选取代有一个或多个上述官能团。在一些实施方式中，小分子是非聚合性的。在一些实施方式中，小分子不是氨基酸。在一些实施方式中，小分子不是核苷酸。在一些实施方式中，小分子不是糖。

术语"对象"可以是任何多细胞动物。对象可以是脊椎动物，例如哺乳动物或禽类。示例性的哺乳动物包括例如：人，非人灵长类，啮齿类(例如，小鼠、大鼠、兔)，有蹄类(例如，绵羊、牛、马、山羊物种)，犬和猫。对象可以是被递送化合物(例如，出于实验、诊断和/或治疗目的)的个体，或是自其获取样品或对其进行诊断过程(例如，样品或过程会被用来评估组织损伤和/或评估本发明所述化合物的效果)的个体。

本文所用术语"组织损伤"指对细胞、组织、器官或其它身体结果的任何类型的损伤或伤害。在不同实施方式中，该术语涵盖疾病造成的退化，物理性外伤或手术造成的损伤，接触有害物质造成的损伤，和细胞、组织、器官或其它身体结构的结构和/或功能性的其它破坏。

术语"组织再生"或"TR"指组织、器官或其它身体结构或其部分在损失、损伤或退化后的至少部分再生、置换、恢复，其中所述组织再生若非本发明所述方法就不会发生。组织再生的示例包括断指或断肢的再生长，包括软骨、骨、肌肉、腱和韧带的再生长，因受伤或疾病已丧失的骨、软骨、皮肤或肌肉的再生长(可以是无疤或不是无疤)，受伤或患病器官的大小和细胞数量提升使得所述组织或器官接近该组织或器官的正常大小或受伤或患病前的大小。取决于组织类型，组织再生可通过多种不同机制发生，这些机制包括(例如)：现有细胞和/或组织的重排(例如，通过细胞迁移)，成熟型体干细胞或其它祖细胞的分裂和它们后代中至少一些的分化，和/或细胞的去分化、转分化和/或增殖。

术语"TR激活(子)基因"指在胎儿或成熟细胞中没有表达但其在发育的胚胎期中的表达帮助TR的那些基因。

术语"TR抑制(子)基因"指其在胎儿和成熟动物中的表达抑制TR的那些基因。

涉及对象的术语"治疗"、"医治"、"处理"、"疗法"、"治疗性"及类似术语指提供给对象医学和/或手术治疗。处理可包括但不限于将化合物或组合物(例如，药物组合物如细胞组合物)给予对象。本发明所述的对象的处理通常致力于促进再生时作出，例如，在患有组织损伤或预期会遭受组织损伤的对象中(例如，将进行手术的对象)进行。本文所用处理包括预防性的，以及与疾病或病况相关联的一种或多种症状的减轻。处理的效果通常可包括：提高再生、减少疤痕和/或改善组织损伤后的结构或功能性结果(与不作处理的结果相比)，和/或可包括退行性疾病的逆转或严重性减弱。

用于特定多肽的术语"变体"所指的多肽与该特定多肽(有时称作"原始多肽")相差一个或多个氨基酸变化如添加、缺失和/或取代。原始多肽有时是天然产生的多肽(例如，来自人或非人动物)或与之相同的多肽。变体可以是天然产生或是使用如重组DNA技术或化学合成所产生的。添加可以是多肽内的插入或是N-或C-末端的添加。在一些实施方式中，氨基酸取代、缺失或添加的数量可以是例如约1-30个，例如约1-20个，例如约1-10个，例如约1-5个，例如1、2、3、4或5个。在一些实施方式中，变体包括其序列与原始多肽在至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸或更多、直至原始多肽全长范围具有同源性的序列(但并非与原始多肽的序列相同)，例如变体多肽的序列与原始多肽的序列在至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸或更多、直至原始多肽全长范围具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的相同性。在一些实施方式中，变体包括与原始多肽在原始序列的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高的相同性。在一些实施方式中，变体包括至少一个功能性或结构性结构域，例如在国家生物技术信息中心(www.ncbi.nih.gov)的保守结构域数据库(Conserved Domain Database，CDD)中鉴定为如此的结构域，例如，NCBI-已标记结构域(NCBI-curated domain)。

在一些实施方式中，变体或片段的一个、多个或全部生物学功能或活性与原始分子的相应生物学功能或活性疾病相似。在一些实施方式中，功能性变化保留原始多肽的活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，例如，大致相等活性。在一些实施方式中，变体的活性最多达到原始分子活性的约100％、约125％或约150％。在其它非限制性实施方式中，如果产生特定效果所需变体的量或浓度在用以产生该效果所需原始分子的两或浓度的0.5到5倍范围内，则该变体或片段的活性视为与原始分子的活性基本相似。

在一些实施方式中，变体中的氨基酸"取代"是将一个氨基酸置换为具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸的结果，即，保守性氨基酸置换。"保守(性)"氨基酸取代可根据所涉及残基的多种性质中任意性质如侧链大小、极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性来进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性(亲水)、中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在特定基团内，某些取代可能是特别感兴趣的，例如，亮氨酸置换为异亮氨酸(或反之)，丝氨酸置换为苏氨酸(或反之)，或丙氨酸置换为甘氨酸(或反之)。当然，非保守性取代往往也与保留功能相容。在一些实施方式中，取代或缺失不改变或消去对活性很重要的氨基酸。插入或缺失的尺寸可在约1-20个氨基酸的范围内，例如1-10个氨基酸。一些情况中，可去除较大结构域而不显著影响功能。在本发明的某些实施方式中，变体的序列可通过对天然产生酶的序列作总数不超过5、10、15或20个氨基酸的插入、缺失或取代来获得。在一些实施方式中，相对于原始多肽，在多肽内有不超过1％、5％、10％或20％的氨基酸插入、缺失或取代。

对于确定哪些氨基酸残基可被取代、添加或缺失而不消除或显著减弱感兴趣活性的指导，可通过将特定多肽的序列与同源多肽(例如，来自其它生物)的序列进行比较并使高度同源区域(保守区域)内的氨基酸序列改变数量最小，或者通过将氨基酸置换成同源序列中所见氨基酸来获得，因为不同物种间保守的氨基酸残基比非保守的氨基酸更有可能对活性有重要性。

在一些实施方式中，多肽的变体包含异源多肽部分。所述异源部分往往具有原始多肽中没有或者与原始多肽不同源的序列。异源部分可为(例如)5到约5000个氨基酸或者更长。在一些实施方式中，其长度在5到约1000个氨基酸。在一些实施方式中，异源部分含有在不同的多肽中所见的序列，例如，功能性结构域。在一些实施方式中，异源部分含有有益于纯化、表达、溶解和/或检测该多肽的序列。在一些实施方式中，异源部分含有多肽"标签(tag)"，例如亲合标签或表位标签。例如，所述标签可以是亲合标签(例如，HA、TAP、Myc、6XHis、Flag、GST)，荧光或萤光蛋白(例如，EGFP、ECFP、EYFP、Cerulean、DsRed、mCherry)，增溶标签(例如，SUMO标签、NUS A标签、SNUT标签，或噬菌体T7的Ocr蛋白的单体性突变体)。参见例如，Esposito D和Chatterjee D K.Curr Opin BiotechnoL；17(4):353-8(2006)。在一些实施方式中，标签可有多种功能。标签往往相对较小，例如，长度在数个氨基酸到最多约100个氨基酸。在一些实施方式中，标签长度超过100个氨基酸，例如，最多达约500个氨基酸或更长。在一些实施方式中，多肽具有位于N-或C-末端的标签，例如，作为N-或C-末端融合子。多肽可含有多个标签。在一些实施方式中，存在6×His标签和NUS标签，例如，在N-末端。在一些实施方式中，标签可切割，例如被蛋白酶切割，使得可从所述多肽去除该标签。在一些实施方式中，这可以通过在编码与原始多肽同源部分的序列和标签之间纳入编码蛋白酶切割位点的序列来实现。示例性的蛋白酶包括，例如，凝血酶、TEV蛋白酶、Xa因子、PreScission蛋白酶等。在一些实施方式中，采用"自切割"标签。参见例如，PCT/US05/05763。编码标签的序列可相对编码多肽的多核苷酸位于5'或3'(或两者)。在一些实施方式中，标签或其它异源序列经多肽接头与该多肽的其余部分隔开。例如，接头可以是短肽(例如，15-25个氨基酸)。接头往往由小氨基酸残基如丝氨酸、甘氨酸和/或丙氨酸组成。异源结构域可含有跨膜结构域，分泌信号结构域等。

在本发明的某些实施方式中，片段或变体(可选排除异源部分)如果存在，则与原始多肽具有充分的结构相似性，使得在将其三维结构(实际或预测的结构)叠置于原始多肽结构上时，重叠的体积为原始多肽结构的总体积的至少70％，优选至少80％，更优选至少90％。片段或变体的部分或全部三维结构可通过蛋白质结晶来确定，所述结晶可采用标准方法完成。或者，可产生NMR解析结构，也是采用标准方法完成。建模程序如MODELER(Sali,A.和Blundell,T L,J.Mol.Biol.,234,779-815,1993)或任何其它建模程序可用来产生预测结构。若可得到相隔多肽的结构或预测结构，则建模可基于该结构。可采用PROSPECT-PSPP程序套件(Guo,J T,等，Nucleic Acids Res.32(网络版):W522-5，2004年7月1日)。对于本发明涉及多肽变体的实施方式，应理解提供了编码所述变体的多核苷酸。

术语"载体"用于指能够介导核酸分子进入(例如，转移、转运等)相比的核酸或病毒或其部分(例如，病毒衣壳或基因组)。载体是核酸时，待转移的核酸分子一般连接于(例如插入)载体核酸分子。核酸载体可包括指导自主复制的序列(例如，复制起点)，或可包括足以使所述核酸部分或全部整合入宿主细胞DNA的序列。有用的核酸载体包括，例如，DNA或RNA质粒，粘粒，和天然产生或经修饰的病毒基因组或其部分，或可包装入病毒衣壳的核酸(DNA或RNA)。质粒载体通常包括复制起点和一个或多个选择性标记。质粒可包括病毒基因组的部分或全部(例如病毒启动子，增强子，加工或包装信号等)。可用来将核酸分子引入细胞的病毒或其部分被称作病毒载体。可用的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒和其它痘病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)和其它病毒。病毒载体可含有充足的遗传信息用以在引入宿主细胞时产生感染性病毒，或可不含有这些充足的信息，即，病毒载体可以是复制缺陷型，并且此类复制缺陷型病毒载体对治疗性应用而言可以是优选的。在缺乏充足的信息时，可以(但非必需)由宿主细胞或引入细胞的其它载体来提供。待转移的核酸可被纳入天然产生或经修饰的病毒基因组或其部分内，或可作为单独的核酸分子存在于病毒或病毒衣壳内。应理解，包括部分或全部病毒基因组的某些质粒载体通常包括的病毒遗传信息足以指导能包装入病毒衣壳的核酸的转录和/或足以产生能整合入宿主细胞基因组的核酸和/或足以产生感染性病毒，这些载体有时在本领域也称作病毒载体。载体可含有编码标记物的一个或多个核酸，所述标记物用于鉴定和/或选择细胞是否转化或转染有所述载体。标记物包括(例如)：提高或降低对抗生素的耐受性或灵敏度的蛋白质(例如，抗生素抗性基因，其编码的蛋白质提供对抗生素如嘌呤霉素，潮霉素或杀稻瘟菌素的抗性)或其它化合物，活性可用本领域已知试验检测的酶(例如，β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)，和对已转化或转染的细胞的表型有可检测影响的蛋白质或RNA(例如，荧光蛋白)。表达载体是包括足以指导转录可操作连接的核酸的调节序列的载体，调节序列的示例有表达控制序列如启动子。调节序列还可包括增强子序列或上游活化序列。载体可任选包括5'前导或信号序列。载体可任选包括切割和/或多聚腺苷酸化信号和/或3'非翻译区。载体往往包括适当定位的一个或多个限制性酶位点，已帮助将待表达的核酸引入载体。表达载体含有充足的顺式作用元件用于表达，表达所需或有助表达的其它元件可由宿主细胞或体外表达系统提供。

可用不同技术来将核酸分子引入细胞。此类技术包括采用化合物如磷酸钙、阳离子脂质、阳离子聚合物的化学辅助转染，脂质体介导的转染，非化学法如电穿孔，离子轰击或微注射，以及用含有感兴趣核酸分子的病毒来感染(有时称作"转导")。标记物可用于鉴定和/或选择已获取载体并通常表达所述核酸的细胞。细胞可培养在合适介质中以选择此类细胞，并可选建立稳定细胞系。

在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于所述的

具体实施方式

，因为它们当然可能变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不用来构成限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

应理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，该范围上下限之间、到下限单位的十分之一的各中间值，以及所述范围的任何其它标注或中间值均包括在本发明范围内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，受到所述范围明确排除的限值制约。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。

本文提出的某些范围的数值前面存在术语“约”。术语“约”为其后准确数字以及该术语后面数字附近或逼近的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或逼近特定提及数字时，接近或者逼近的未提及数字可能是在其所代表的内容中提供了特定提及数字的大致等同的数字。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但以下描述代表性的说明性方法和材料。

应注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式一个摂、一种摂和所述摂包括复数含义，除非上下文另有明确说明。还应注意到，权利要求书可撰写成排除任何任选要素。同样，这种说明应用作引用权利要求元素相关地使用这类排除性术语，如“只有”、“仅仅”等，或使用“负/否”限制的前提基础。

正如本领域技术人员在阅读本公开后所能显见的，本文描述和说明的每个单独的实施方式具有离散的组成和特征，这些组成和特征可方便地分离或与任何其余多个实施方式的特征结合而不偏离本发明的范围和精神。任意提及的方法可以所提及的事件顺序进行或以逻辑上可行的任意其它序列进行。

发明详述

本发明提供可用于在哺乳动物物种(例如，人)发育的胎儿、新生儿、婴儿或成熟时期进行体细胞iTR的化合物、组合物和方法，在胚胎时期赋予TR能力的基因表达模式在这些时期已经丧失。一方面，本发明提供在哺乳动物物种中(包括灵长类，更具体为人物种中)鉴别TR调节基因的方法，其中通过编码mRNA和非编码RNA或所述RNA的剪接变体的基因表达比较出在发育的胚胎期相比发育的胎儿和成熟期有差异表达的基因来鉴别所述基因。更具体地，所述方法鉴别下述基因，其编码的mRNA和非编码RNA在发育产前期(特别是发育的胚胎期，在从胚胎向胎儿发育的转化点之前)的多种不同体细胞类型中相比胎儿和成熟细胞(在从胚胎向胎儿发育的转化点之后)有差异表达。在人物种的情形中，从胚胎到胎儿发育的转化发生在产前发育约8周，小鼠中该转化的发生大致在16天，而大鼠物种中，则在约17.5天。

本发明的另一方面中，利用呈现哺乳动物发育胚胎期的特异性基因表达模式的多能干细胞衍生性克隆、寡克隆、合并克隆或合并寡克隆胚胎祖细胞系作为编码和非编码RNA的来源，并与来自胎儿或成熟衍生来源的细胞和组织中的编码和非编码RNA比较，以鉴定编码mRNA和非编码RNA或剪接变体的基因中相比发育胚胎期中的细胞在胎儿和成熟组织中调节TR和抑制TR的基因。

本发明的另一方面中，将发育胚胎期中不同类型体细胞中有差异表达的转录调节基因与胚胎期后发育时期的不同类型体细胞如不能参与TR的成熟细胞类型进行比较，来鉴定剪接变体改变的表达变化会导致成熟哺乳动物中组织再生能力抑制的那些基因。在一些实施方式中，基因的表达或抑制能导致iTR的那些基因的鉴别方法包括：比较克隆、寡克隆、合并克隆或合并寡克隆hPS细胞衍生的胚胎祖细胞的转录组和不同类型成熟体衍生型细胞或组织的转录组，以鉴别在胚胎祖细胞中普遍表达或在胚胎祖细胞中有RNA剪接变体、但在成熟体衍生型细胞中不表达或者表达水平显著较低的基因，或者鉴别在成熟体衍生型细胞中表达或有剪接变体的RNA、但在克隆、寡克隆、合并克隆或合并寡克隆hPS细胞衍生的胚胎祖细胞系中不表达或表达水平显著较低的基因。在另一种实施方式中，对于候选iTR基因，在胚胎祖细胞中相比成熟体衍生细胞中有更高表达并且被认为与癌发生有关的基因，或是在胚胎祖细胞中相比成熟体衍生细胞中有较低表达并且被认为与肿瘤抑制有关的基因，两者都被鉴别为候选iTR基因。

另一方面，本发明提供在不同细胞和组织类型中筛选iTR基因组合的方法，用以鉴别针对特定细胞或组织类型的再生已优化的因子和/或抑制子的组合。

另一方面，本发明提供改变培养中细胞的iTR基因表达的方法，以使这些细胞恢复到在植入组织时能参与iTR的状态，而该组织原本不能进行充分的TR。

在本发明的另一方面，端粒酶催化组分，包括但不限于人基因TERT，在待诱导TR的目标细胞和组织中被瞬时表达以扩展体细胞的增殖能力由此促进TR。在本发明的另一方面，端粒酶催化组分，包括人基因TERT，在目标细胞和组织中被瞬时表达(而非组成型表达)以扩展体细胞的增殖能力但不使细胞永生化。

另一方面，本发明提供改变体内细胞中的iTR基因表达的方法，以使这些细胞恢复到能参与iTR的状态。在一些实施方式中，iTR基因表达被体外改变。

另一方面，本发明提供候选具有TR活性的调控子的鉴别方法，其包括：(i)提供包含以下组分的组合物：(a)纯化状态或在含其它分子的混合物中的具有TR活性的候选调控子；(b)不能进行TR的体细胞，所述细胞表达胎儿或成熟模式的基因表达而非胚胎模式的基因表达；(c)报道子构建物，其存在于所述体细胞内或者不能进行TR的所述细胞的提取物中，其中在发育胚胎期的体细胞中相比胎儿或成熟期有差异调节的基因启动子推动报道基因的表达；和(ii)确定候选调控子是否影响报道基因的表达，其中报道基因的表达相比该基因在没有候选调控子时的表达有所改变指示该化合物调节iTR活性。

在一些实施方式中，候选TR调控子的鉴别方法还包括将被鉴别为TR调控子的候选化合物给予对象。合适的对象包括任何动物，包括例如：哺乳动物如人、非人灵长类，有蹄类和其它家畜例如，牛、绵羊、马、山羊、猪，家养哺乳动物如猫或狗以及啮齿类如小鼠、大鼠、兔、豚鼠。

在一些实施方式中，化合物的鉴别方法还包括将所述化合物给予对象。在一些实施方式中，所述对象是非人动物，例如用作TR或伤口愈合模型的非人动物。在一些实施方式中，该对象是人。

另一方面，本发明提供药物组合物，其包含：(a)iTR调控子；和(b)药学上可接受的载体。

细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组核酸(例如，DNA)技术、免疫学等的某些常规技术可用于本发明的某些方面。这些技术的某些非限制性描述可参见以下文献：Ausubel,F.等编著，Current Protocols in Molecular Biology(新编分子生物学实验),Current Protocols in Immunology(新编免疫学实验),Current Protocols inProtein Science(新编蛋白科学实验)和Current Protocols in Cell Biology(新编细胞生物学实验)，均为纽约约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)的2008版；Sambrook,Russell和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，2001；Harlow,E.和Lane,D.，Antibodies—A Laboratory Manual(抗体－实验手册)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，1988；Burns,R.，Immunochemical Protocols(Methods in MolecularBiology)(免疫化学实验(分子生物学方法))，胡马纳出版社(Humana Press)，第3版，2005，Monoclonal antibodies:a practical approach(单克隆抗体：实用方法)(P.Shepherd和CDean编著，牛津大学出版社，2000)；Freshney,R.L，"Culture of Animal Cells,A Manualof Basic Technique"(动物细胞培养：基本技术手册)，第5版，约翰韦利父子公司，新泽西州霍波肯，2005)。

TR调控和iTR调控子

本发明提供iTR调控子及其实用方法。本发明还提供可用于鉴别iTR调控子的组合物和方法。在一些方面，本发明提供增强再生的方法，包括将改变所述iTR调控子浓度的试剂给予有需要的多细胞生物。

呈现显著TR潜能(例如蝾螈的断肢再生或涡虫的全身段再生)的原始动物是通过简单重现正常胚胎发育来实现TR的。哺乳动物如小鼠和人中所述TR-抗性的无能是由于某些胚胎基因转录的改变使其对抗从胎儿发育转换回胚胎状态。本文提供在TR-抗性动物中恢复某些此类胚胎特异性基因而由此在任何组织中诱导再生能力，包括对组织中心因子的响应性，导致复合组织再生且同时减少疤痕形成。

在这些物种中已发现某些基因在正常和再生组织中有差异表达，且有些基因已被鉴别为这类组织再生所必需，尚无基因被报道为(无论分离的或与其它基因组合)足以将动物组织内原本不能TR的细胞重编程回到组织能够自体再生的状态。因此，本领域需要鉴别如下基因，其表达或者抑制足以导致哺乳动物细胞和组织的诱导性组织再生(iTR)，还需要在哺乳动物物种特别是智人(Homo sapiens)物种体内诱导或抑制此类再生的组合物和方法。

在胎儿和成熟动物中的表达会抑制TR的基因在本文中称作"TR抑制子"，而在胎儿和成熟细胞中不表达但在发育胚胎期的表达促进TR的基因在本文中称作"TR激活子"。TR抑制子基因和TR激活子基因统称为iTR基因。使TR激活子和TR抑制子以导致TR的方式发生改变的分子在本文称作"iTR因子"。iTR基因和iTR基因的蛋白产物在从海葵到哺乳动物的各种动物中往往是保守的。本领域抑制来自数种不同动物的iTR基因所编码的蛋白质序列，和编码iTR基因的核酸(例如，mRNA)序列，且这些序列可从公众可得的数据库寻得，例如国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)可得的数据库。

观察到正常组织中TR抑制基因COX7A1主要在基质中表达，上皮细胞则不然。但在肿瘤的情形中，观察到该基因在大多数基质肿瘤如骨肉瘤和软骨肉瘤中被下调。这与癌症中观察到的糖酵解增强(称作Warburg现象)相一致。由于从胚胎到胎儿发育的转变中TR基因被改变(部分是为了避免成熟体中的癌症)，在基质肿瘤中抑制COX7A1会使基质细胞逆转回胚胎状态，这会有助于癌发生。因而基质肿瘤中COX7A1的外源表达会具有治疗效果。

本发明提供调控iTR基因的数种不同方法，和可用于调控iTR基因的多种不同化合物。通常，iTR因子可以是(例如)小分子、核酸、寡核苷酸、多肽、肽、脂质、碳水化合物等。在本发明的一些实施方式中，iTR因子通过降低细胞产生的TR抑制子RNA的量和/或降低TR抑制子基因的活性水平来抑制。在针对TR抑制子的情形中，因子可被鉴别并用于研究和治疗来降低TR抑制子基因的产物水平。所述TR抑制子基因可以是图1A所列TR抑制子基因的任意一种组合。TR抑制子基因RNA的量可通过抑制细胞的TR抑制子RNA合成来降低(也称作"抑制TR抑制子基因表达")，例如，通过减少编码TR抑制子基因的mRNA的量或通过降低编码TR抑制子基因的mRNA的翻译。所述因子的非限制性示例有：靶向图1A所列TR抑制子基因内序列的RNAi。

在本发明的一些实施方式中，TR抑制子基因表达被RNA感染(RNAi)抑制。如本领域已知，RNAi是如下过程：细胞内存在双链RNA，其具有对应于基因的序列而导致序列特异性抑制该基因的表达，这种抑制通常是转录自该基因的mRNA的切割或翻译抑制所造成。可用于通过RNAi导致表达抑制的化合物("RNAi剂")包括短干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)小RNA(miRNA)和miRNA样分子。

实施例中提供了能抑制人和鼠TR抑制子基因表达的示例性序列。一旦鉴别出TR抑制子基因，本领域技术人员能方便地为RNAi剂(例如siRNA)设计序列，这些RNAi剂可用于抑制哺乳动物TR抑制子基因如人TR抑制子基因的表达。在一些实施方式中，此类序列选为使"脱靶(off-target)"效应最小。例如，可使用如下序列：其互补的序列存在于TR抑制子基因mRNA中但不存在于感兴趣物种中表达的其它mRNA中(或不存在于感兴趣物种的基因组中)。位置特异性化学修饰可用来降低脱靶效应的可能。在一些实施方式中，联合使用靶向TR抑制剂基因mRNA的至少两种RNAi剂如siRNA。在一些实施方式中，小RNA(可以是人工设计的小RNA)被用来抑制TR抑制子基因表达。

在本发明的一些实施方式中，使用反义分子抑制TR抑制子基因表达，所述反义分子含有与编码TR抑制子基因的mRNA完全或基本互补的单链寡核苷酸。所述寡核苷酸杂交TR抑制子基因mRNA导致(例如)mRNA被RNA酶H降解或通过空间位阻阻断其翻译。在本发明的其它实施方式中，使用核酶或三链体核酸抑制TR抑制子基因表达。

在本发明的一些实施方式中，TR抑制子抑制TR抑制子蛋白的至少一种活性。可通过使TR抑制子蛋白接触与该TR抑制子蛋白物理接触的化合物来降低TR抑制子活性。此类化合物可以(例如)改变TR抑制子蛋白的结构(例如，通过共价修饰该蛋白)和/或阻断该TR抑制子蛋白与一种或多种其它分子如辅因子或底物的相互作用。在一些实施方式中，抑制或减少可以是降低参比水平(例如，对照水平)的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。对照水平可以是TR抑制剂在没有该因子时发生的水平。例如，TR因子可使TR抑制剂蛋白的水平降低至测试条件下没有该因子时所得水平的不超过95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、40％、30％、25％、20％、10％或5％。在一些实施方式中，TR抑制子的水平降低至测试条件下没有该因子时所得水平的75％或更低。在一些实施方式中，TR抑制子的水平降低至测试条件下没有该TR因子时所得水平的50％或更低。在一些实施方式中，TR抑制子的水平降低至测试条件下没有该iTR因子时所得水平的25％或更低。在一些实施方式中，TR抑制子的水平降低至测试条件下没有该iTR因子时所得水平的10％或更低。一些情况中，调控(例如，抑制或降低)的水平相比对照水平是统计学显著性的。如本文所用，"统计学显著(性)"指p值低于0.05，例如p值低于0.025或p值低于0.01，采用适当的统计学检验(例如，ANOVA,t-检验等)。

在本发明的一些实施方式中，化合物直接抑制TR抑制子蛋白，即，该化合物抑制TR抑制子蛋白的机理涉及该TR抑制子和iTR因子的物理性相互作用(结合)。例如，TR抑制子与iTR因子的结合能干扰TR抑制子催化反应的能力和/或能封堵TR抑制子活性位点。多种化合物可用来直接抑制TR抑制子。直接抑制TR抑制子的示例性化合物可以是(例如)小分子、抗体或适体。

在本发明的一些实施方式中，iTR因子共价结合TR抑制子。例如，该化合物可修饰酶促活性所需的氨基酸残基。在一些实施方式中iTR因子含有与TR抑制子的氨基酸侧链反应的一个或多个活性官能团，例如，醛，卤代烷，烯，氟代膦酸盐(例如，烷基氟代膦酸盐)，迈克尔受体，苯基磺酸酯，甲基酮例如卤代甲基酮或重氮甲基酮，氟代膦酸盐，乙烯基酯，乙烯基砜，或乙烯基磺酰胺。在一些实施方式中，iTR因子抑制剂含有与TR抑制子发生物理相互作用的化合物，所述化合物含有活性官能团。在一些实施方式中，与TR抑制子发生物理相互作用的化合物的结构被修饰以纳入活性官能团。在一些实施方式中，该化合物含有TR抑制子底物类似物或过渡态类似物。在一些实施方式中，化合物在TR抑制子活性位点内或其邻近处与TR抑制子相互作用。

在其它实施方式中，iTR因子非共价结合于TR抑制子和/或非共价结合于含TR抑制子和TR抑制子底物的复合体。在一些实施方式中，iTR因子非共价结合至TR抑制子的活性位点和/或与底物竞争与TR抑制子活性位点的接触。在一些实施方式中，在测试条件如在生理可接受溶液如磷酸缓冲盐水中，iTR因子结合TR抑制子的K_d约10^-3M或更低，例如10^-4M或更低，例如10^-5M或更低，例如10^-6M或更低，10^-7M或更低，10^-8M或更低，10^-9M或更低。结合亲合性可以测得，例如使用表面等离振子共振(例如，采用Biacore系统)、等温滴定量热法、或竞争性结合试验，正如本领域所已知。在一些实施方式中，抑制剂含有TR抑制子底物类似物或过渡态类似物。

在提高TR激活子活性的情形中，可用图1B所列TR激活子基因的任意一种组合。这些基因的产物的水平可用本文所述载体引入。

基于报道子的iTR因子筛选试验

本发明提供采用(a)报道分子鉴别iTR因子的方法，报道分子含有标记物如GFP，其表达受本文所述的一种TR激活子如COX7A1推动。本发明提供筛选试验，其包括确定测试化合物是否影响TR激活子基因的表达和/或抑制TR抑制基因的表达。本发明还提供可用于实施这些方法的报道分子和组合物。一般来说，用本发明的方法鉴别的化合物可通过导致TR激活子或抑制子基因分别增强或减弱的任何机制来起作用。

报道分子、细胞和膜

一般来说，可用于本发明所述报道分子的可检测部分包括发光或吸光化合物，其产生或淬灭可检测的荧光、化学发光或生物发光信号。在一些实施方式中，TR激活子基因的激活或TR抑制基因的抑制导致可检测部分释放入液体基质，且基质(或其样品)中存在的已释放可检测部分所产生或淬灭的信号被测定。在一些实施方式中，产生的信号使可检测部分的性质发生改变，这种改变可测得，例如作为光学信号来测得。例如，所述信号可改变该可检测部分所发射或吸收的电磁辐射(例如，波长在光谱的近红外、可见或UV部分的辐射)。在一些实施方式中，报道分子含有荧光或发光部分，且第二分子起淬灭剂作用来淬灭该荧光或发光部分。这种改变可采用本领域已知的装置和方法来测定。

在本发明的一些实施方式中，报道分子是可由细胞表达的可遗传编码的分子，且所述可检测部分包含(例如)可检测多肽。因此，在一些实施方式中，报道分子是多肽，其含有荧光多肽如绿色、蓝色、青玉色、黄色、红色、橙色、青色荧光蛋白及其衍生物(例如，强化GFP)；单体红色荧光蛋白及其衍生物如称为"mFruit(单体水果色)"的那些，例如，mCherry、mStrawberry、mTomato等，和发光蛋白如水母发光蛋白。(应理解，在一些实施方式中，荧光或发光发生于一种或多种额外分子(例如，离子如钙离子和/或人工基团如腔肠荧光素)存在时。在一些实施方式中，可检测部分含有酶，酶对底物起作用产生荧光、发光、显色或另行可检测的产物。可用作可检测部分的酶的示例包括荧光素酶；β-半乳糖苷酶；辣根过氧化物酶；碱性磷酸酶等。(应理解酶是通过检测反应产物来测定。)在一些实施方式中，可检测部分含有多肽标签，其可采用第二试剂如带标记(例如，带荧光标记)的抗体来方便的测定。例如，带荧光标记的抗体结合可得的HA、Myc或多种其它肽标签。因此，本发明涵盖可检测部分可被直接测定(即，它产生可检测信号而无需与第二试剂反应)的实施方式，以及可检测部分与第二试剂相互作用(例如，结合和/或反应)并且该相互作用使所述可检测部分可被测得的实施方式，例如通过造成可检测信号的产生或是因为第二试剂是直接可测的。在可检测部分与第二试剂相互作用来产生可检测信号的实施方式中，可以与该第二试剂反应的所述可检测部分被第二试剂激活来产生可检测信号。在很多实施方式中，信号的强度给出可检测部分存在量的指示，例如，在被评估的样品中或在所成像的区域内。在一些实施方式中，可检测部分的量可选基于信号强度被定量，例如，相对或绝对的定量。

本发明提供如下核酸，其含有编码本发明所述报道多肽的序列。在一些实施方式中，核酸编码本发明所述报道多肽的前体多肽。在一些实施方式中，编码多肽的序列可操作连接至适于指导转录该多肽的编码mRNA的表达控制元件(例如，启动子或启动子/增强子序列)。本发明还提供含有所述核酸的表达载体。合适表达控制元件的选择可以基于(例如)待表达所述合适的细胞类型和物种。本领域普通技术人员能方便地选择合适的表达控制元件和/或表达载体。在一些实施方式中，表达控制元件是可调的，例如，可诱导或可阻抑的。施用于细菌细胞的示例性启动子包括(例如)Lac、Trp、Tac、araBAD(例如，在pBAD载体中)，噬菌体启动子如T7或T3。可用于指导哺乳动物细胞中表达的示例性表达控制序列包括(例如)SV40的早期和晚期启动子，腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子，或病毒启动子/增强子序列，逆转录病毒LTR，哺乳动物基因(例如，肌动蛋白，EF-1α，磷酸甘油酸激酶)的启动子或启动子/增强子，等等。可调(例如，可诱导或可阻抑)表达系统如Tet-On和Tet-Off系统(可由四环素及其类似物如多西环素调节)和可由小分子如激素受体配体(例如，类固醇受体配体，可以是或不使类固醇)的其它系统，金属调节系统(例如，金属硫蛋白启动子)等等。

本发明还提供含有此类核酸和/或载体的细胞和细胞系。在一些实施方式中，这些细胞是真核细胞，例如真菌、植物或动物细胞。在一些实施方式中，所述细胞是脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞、非人细胞或啮齿类细胞。所述细胞可以是上文所述的任何细胞。在某些实施方式中，所述细胞可以是克隆细胞或寡克隆细胞。在一些实施方式中，所述细胞可以是从多能干细胞如ES细胞或iPS细胞获得的祖细胞。在一些实施方式中，细胞是细胞系的成员，例如已建立或永生化的细胞系，其已获得培养中无限增殖的能力(例如，是突变或遗传操作如端粒酶的催化组分的组成型表达的结果)。大量细胞系为本领域已知且可用于本发明。哺乳动物细胞系包括(例如)HEK-293(如HEK-293T)、CHO、NIH-3T3、COS和HeLa细胞系。在一些实施方式中，细胞系是肿瘤细胞系。在其它实施方式中，细胞是非致瘤性和/或并非源自肿瘤的。在一些实施方式中，所述细胞是贴壁细胞。在一些实施方式中，使用非贴壁细胞。在一些实施方式中，细胞是已显示天然有TR激活子基因子集的表达或不表达TR抑制子基因的细胞类型或细胞系的细胞。若细胞缺失一个或多个TR激活子或抑制子基因，所述细胞可被遗传改造成表达该(些)蛋白。在一些实施方式中，本发明的细胞系源自单一细胞。例如，细胞群体可转染以编码报道多肽的核酸，且可选择源自单一细胞的集落并培养扩增。在一些实施方式中，细胞被瞬时转染以编码报道分子的表达载体。细胞可共转染以对照质粒，其可选表达不同的可检测多肽，用以控制转染效率(例如，覆盖试验的多轮运行)。

TR激活子和TR抑制子多肽与核酸

TR激活子和TR抑制子基因列于图1。可用于本发明方法的TR激活子和TR抑制子多肽可用多种方法获得。在一些实施方式中，所述多肽用重组DNA技术产生。可采用重组蛋白表达的标准方法。编码TR激活子或TR抑制子基因的核酸可方便地得到，例如获自表达该基因的细胞(例如，通过PCR或其它扩增方法或通过克隆)，或通过化学合成或基于cDNA序列多肽序列的体外转录。本领域普通技术人员会知晓：由于遗传编码的简并性，基因可由很多不同的核酸序列编码。可选的，序列针对所选宿主细胞内的表达经过密码子优化。基因可在细菌、真菌、动物、植物细胞或生物中表达。基因可分离自天然表达这些基因的细胞，或分离自瞬时或稳定引入有所述蛋白的编码核酸的细胞，例如，含有编码所述基因的表达载体的细胞。在一些实施方式中，所述基因由培养中的细胞分泌并从培养基质中分离。

在本发明的一些实施方式中TR激活子或TR抑制子多肽的序列用于本发明所述筛选方法。天然产生的TR激活子或TR抑制子多肽可来自基因组编码TR激活子或TR抑制子多肽的任意物种，例如，人、非人灵长类、啮齿类等。序列与天然产生的TR激活子或TR抑制子相同的多肽有时在本文中称作"天然TR激活子/抑制子"。本发明可用的TR激活子或TR抑制子多肽可以含有或不含分泌信号序列或其部分。例如，可采用含有人TR激活子或TR抑制子的20-496氨基酸(或其它物种的TR激活子或TR抑制子的相应氨基酸)或由这些氨基酸组成的成熟型TR激活子或TR抑制子。

在一些实施方式中，使用含有TR激活子或TR抑制子的变体或片段或由所述变体或片段组成的多肽。TR激活子或TR抑制子变体包括相对TR激活子或TR抑制子相差一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的多肽。在一些实施方式中，TR激活子或TR抑制子变体包含如下多肽，其与TR激活子或TR抑制子(例如，来自人或小鼠)的至少20-496氨基酸在人TR激活子或TR抑制子的至少20-496氨基酸或小鼠TR激活子或TR抑制子的至少20-503氨基酸的50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的相同性。在一些实施方式中，TR激活子或TR抑制子变体多肽包含与人TR激活子或TR抑制子的至少20-496氨基酸或小鼠TR激活子或TR抑制子的至少20-503氨基酸具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性的多肽。在一些实施方式中，TR激活子或TR抑制子多肽包含与人TR激活子或TR抑制子的至少20-496氨基酸或小鼠TR激活子或TR抑制子的至少20-503氨基酸具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性的多肽。编码TR激活子或TR抑制子变体或片段的核酸可以方便地产生，例如通过利用定点突变或其他标准方法修饰编码天然TR激活子或TR抑制子的DNA，且所述核酸可用于生成TR激活子或TR抑制子变体或片段。例如，可通过将编码TR激活子或TR抑制子的序列克隆入提供异源部分编码序列的载体来产生融合蛋白。在一些实施方式中，使用带标签的TR激活子或TR抑制子。例如，在一些实施方式中，使用的TR激活子或TR抑制子多肽含有6XHis标签，例如在其C末端。

测试化合物

本发明所述方法可用多种不同的测试化合物来鉴别iTR因子。例如，测试化合物可以是(例如)小分子、多肽、肽、核酸、寡核苷酸、脂质、碳水化合物、抗体或杂合分子。化合物可获自天然来源或合成产生。化合物可以是至少部分纯的，或可存在于提取物或其它类型的混合物中，混合物的组成至少部分未知或未经鉴定。提取物或其部分可由(例如)植物、动物、微生物、海洋生物、发酵液(例如，土壤、细菌或真菌发酵液)等产生。在一些实施方式中，测试化合物的集合("库")。库可含有(例如)100到500,000个化合物或更多。化合物往往阵列在多孔板内(例如384孔板，1596孔板等)。它们可溶入溶剂(例如，DMSO)或以干燥形式提供，例如，作为粉末或固体。可测试合成、半合成和/或天然产生化合物的集合。化合物库可含有结构相关、结构多样或结构无关的化合物。化合物可以是人工(具有人为创设而自然未见的结构)或天然产生的。在一些实施方式中，库含有至少一些已在其它药物开发程序被鉴别为"命中(hit)"或"前导(lead)"的化合物和/或其衍生物。化合物库可含有天然产物和/或用非导向或导向合成有机化学产生的化合物。化合物库往往是小分子库。其它感兴趣的库包括肽或类肽库，cDNA库，抗体库和寡核苷酸库。库可有着重点(例如，主要由具有相同核心结构、源自相同前体或具有至少一种共同的生化活性的化合物组成)。

化合物库可从多个商业供应商如Tocris Bioscience、Nanosyn、BioFocus和政府部门获得。例如，美国国立卫生研究院(NIH)分子库项目的一项MLSMR(MolecularLibraries Small Molecule Repository)是设计为鉴别、获取、保有和分发>300,000种化学上多样的具有已知和未知生物活性的化合物，以用于高通量筛选(HTS)试验(残基https://mli.nih.gov/mli/)。NIH临床库(NCC)是约450个具有人体临床试验史的小分子的板式阵列。这些化合物是药物样的，具有已知的安全性。在一些实施方式中，测试包含“已批准人用药物”的化合物的集合。"已批准的人用药物"是已由负责在治疗试剂上市前至少评价其安全性的政府监管机关如美国FDA、欧洲药物管理局或类似机关批准用于治疗人的化合物。测试化合物可以是(例如)抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗真菌、抗原生动物、抗寄生物、抗抑郁剂、抗精神病药、麻醉剂、抗心绞痛、抗高血压、抗心律不齐、抗炎、镇痛、抗血栓形成、止吐、免疫调节剂、抗糖尿病、脂质或降胆固醇(例如、他汀类)、抗惊厥、抗凝、抗焦虑、催眠(睡眠诱导)、激素或抗激素药物。在一些实施方式中，化合物是已进行至少一些临产前或临床开发或已确定或预期具有"药物样"性质的化合物。例如，测试化合物可已完成I期试验或至少完成非人动物中的临床前研究并显示安全性和耐受性的证据。

在一些实施方式中，在所用浓度，或者在一些实施方式中在所用浓度的最多10倍、最多100倍或最多1000倍的浓度下，测试化合物对于待给予的生物体的细胞和/或对可测试该化合物的细胞基本无毒。例如，对细胞活力和/或增殖没有统计学限制性影响，或者在各种实施方式中，活力或增殖的降低可以不超过1％、5％或10％。细胞毒性和/或对细胞增殖的影响可用多种试验中的任何方法来评估。例如，可使用细胞代谢试验如AlamarBlue、MTT、MTS、XTT和CellTitre Glo试验，细胞膜完整性试验、基于ATP的细胞活力试验、线粒体还原酶活性试验、BrdU、EdU或H3-胸苷掺入试验。在一些实施方式中，测试化合物并非本领域已知或使用的细胞培养基(例如，施用于培养脊椎动物如哺乳动物细胞的培养基)中所见的化合物，或者，若测试化合物是本领域已知或使用的细胞培养基中所见的化合物，则所述测试化合物在用于本发明所述方法是采用不同浓度，例如，更高浓度。

试验实施的方面与对照

上面记载了多种创造性的筛选试验，涉及确定测试化合物是否已知活性TR抑制子的水平或提供活性TR激活子的水平。上文记载了适于表达报道分子的细胞。

在本发明所述试验的进行中，试验组成(例如，细胞，TR激活子或TR抑制子多肽和测试化合物)通常分配入多个容器或其它盛器。可使用能够容纳细胞的任何类型容器或物件。在本发明的很多实施方式中，所述容器是多孔板(也称“微孔板”，“微量滴定板等)的孔。出于说明目的，术语“孔”会被用来指可用来进行本发明所述筛选的任何类型容器或物件，例如可容纳试验组成的任何容器或物件。应理解，本发明不限于使用孔或使用多孔板。在一些实施方式中，可使用其内或基材上有多个物理分隔的空穴(或其它限定结构)的任何制品。例如，试验组成可被限定成液滴，其可选被排列在表面上，并可选用防水(water-resistant)物质间隔将这些液滴限定在离散位置，在微流体装置的通道内等等。

通常，试验组成可以任意顺序加入孔。例如，可首先向孔添加细胞并保持培养选定的时间段(例如，6到48小时)，然后添加测试化合物和目标TR激活子或TR抑制子多肽或具有表达构建体的细胞。在一些实施方式中，先向孔添加化合物然后添加细胞的多肽。在一些实施方式中，在向孔接种细胞后，可选在添加测试化合物后，诱导报道多肽的表达。在一些实施方式中，通过使所述细胞转染以编码报道多肽的表达载体来实现报道分子的表达。在一些实施方式中，细胞先被遗传改造以表达报道多肽。在一些实施方式中，报道分子的表达受可调表达控制元件的控制，且通过使细胞接触诱导(或去阻抑)表达的试剂来实现该报道分子表达的诱导。

含有细胞、测试化合物或多肽的试验组合物保持适当的时间段，期间测试化合物可(在没有某测试化合物抑制其活性时)，导致目标TR激活子或TR抑制子活性水平的提高或降低。细胞数量，TR激活子或TR抑制子多肽的量，和所加测试化合物的量可取决于多种因素如容器大小、细胞类型，并可由本领域普通技术人员确定。在一些实施方式中，TR激活子或TR抑制子多肽对测试化合物的摩尔浓度之比在1:10到10:1之间。在一些实施方式中，细胞数量、测试化合物的量，和组合物的保持时间可选为在没有测试化合物一段选定时间后能有方便可检测水平的信号。在一些实施方式中，在添加化合物时细胞的汇合度约25％-75％，例如约50％。在一些实施方式中，96孔板中每孔在约100μl培养基中接种1,000到100,000个细胞/孔(例如，约5,000细胞/孔)。在其它示例性实施方式中，细胞接种在30μ1-50μl培养基中以每孔500到2,000(例如，约1000)细胞接种入384孔板。在一些实施方式中，化合物以多种浓度(例如，2-10个不同浓度)和/或多个重复样(例如，2-10个重复样)来测试。

可进行一些或全部不同浓度的重复样。在一些实施方式中，候选TR因子以0.1μg/ml到100μg/ml的浓度使用，例如，1μg/ml和10μg/ml。在一些实施方式中，候选TR因子以多个浓度使用。在一些实施方式中，在接种后6小时到1天(24小时)之间添加化合物。

在本发明的化合物筛选和/或鉴定方法的任意的一些方面，向试验组合物添加的测试化合物的量足以得到预定的浓度。在一些实施方式中，所述浓度最高达约1nM。在一些实施方式中，所述浓度在约1nM到约100nM之间。在一些实施方式中，所述浓度在约100nM到约10μM之间。在一些实施方式中，所述浓度为至少10μΜ，例如10μΜ到100μΜ之间。试验组合物可在添加其最后成份后保持不同时间段。在某些实施方式中，试验组合物在添加全部成份后保持约10分钟到约4天，例如1小时到3天，例如2小时到2天，或任意间插范围或特定值，例如约4-8小时。可测试多个不同时间点。在这样的时间段内，可将测试化合物的额外等份加至试验组合物。在一些实施方式中，细胞保持在适于培养该类细胞的细胞培养基中。在一些实施方式中，采用无血清培养基。在一些实施方式中，试验组合物含有能配合保持细胞膜完整性及(可选的)细胞活力的生理上可接受的液体，取代细胞培养基。可用任意合适液体，只要该液体具有适当的渗透压，且在其它方面能配合使细胞膜完整性及(可选的)细胞活力保持至少试验进行的充分时间段。指示活性TR激活子水平提高或TR抑制子降低的一种或多种测定可在孵育期间或孵育期后作出。

在一些实施方式中，通常身份(例如，结构和/或序列)已知的个体化合物各自被加至多个孔的各孔。在一些实施方式中，可向一个或多个孔加入两个或更多化合物。在一些实施方式中，可测试一个或多个未知身份的化合物。所述身份随后可以采用本领域已知的那些方法来确定。

在各种实施方式中，本发明的前述试验方法适于高通量筛选(HTS)实施。在一些实施方式中，本发明的筛选方法是高通量或超高通量的(参见例如，Fernandes,P.B.,CurrOpin Chem.Biol.1998,2:597；Sundberg,S A,Curr Opin Biotechnol.2000,11:47)。高通量筛选往往涉及高效测试大量化合物，例如并行测试。例如，数万或数十万化合物可在短时间内常规筛选，例如，数小时到数天。在一些实施方式中，HTS指每天测试1,000到100,000化合物。在一些实施方式中，超高通量指每天筛选超过100,000个化合物，例如最多到每天一百万或更多的化合物。本发明的筛选试验可以多孔形式进行，例如96孔，384孔形式，1536孔形式或3,456孔形式，且适于自动化。在一些实施方式中，微孔板的各孔可用来针对不同的测试化合物运行单独的试验，或者如果要观察浓度或孵育时间的影响，可有多个孔含有单一化合物的测试样品，至少一些孔可选留空或用作对照或重复样。通常，本文所述试验的HTS实施方式涉及自动化的应用。在一些实施方式中，包括一个或多个自动机的集成式自动机系统将试验微孔板在多个试验站间运输，用以添加化合物、细胞和/或试剂，混合，孵育以及读取或检测。在一些方面，本发明的HTS系统可同时对多个板进行备样、孵育和分析。可采用合适的数据处理和控制软件。高通量筛选实施方式是本领域熟知的。不以任何方式限制本发明，本发明所述HTS的实施方式中可采用的某些一般原理和技术在文献中有所记载：Macarron R和Hertzberg R P.Design and implementation of high-throughputscreening assays(高通量筛选试验的设计与实施)，Methods Mol Biol.,565:1-32,2009和/或An W F和Tolliday N J.,Introduction:cell-based assays for high-throughputscreening(高通量筛选用细胞试验的简介)，Methods Mol Biol.486:1-12,2009，和/或它们所引用的文献。示例性方法的公开还有：High Throughput Screening:Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology)(高通量筛选：方法与方案(分子生物学方法))，William P.Janzen(2002)；和High-Throughput Screening in Drug Discovery(Methods and Principles in Medicinal Chemistry)(药物发现中的高通量筛选(医药化学方法和原理))(2006)。

额外的化合物可能相比初始命中具有一种或多种改进的药代动力学和/或药效学性质或是仅仅具有不同的结构。"改进的性质"可以是(例如)使某化合物更有效或更适于本文所述的一种或多种目的。在一些实施方式中，举例而言，化合物对感兴趣的分子目标(例如，TR激活子或TR抑制子基因产物)的亲合性可更高，对非目标分子的亲合性更低，溶解度更高(例如，水溶性提高)，稳定性提高(例如，在血液、血浆和/或胃肠道内)，体内半衰期提高，生物利用度提高和/或副作用减轻，等等。可通过对命中结构按经验修饰(例如，合成具有相关结构的化合物并在无细胞和基于细胞的试验或在非人动物中进行测试)和/或采用计算方法来实现优化。在一些实施方式中，此类修饰可利用医药化学中已确立的原理来可预测地改变一种或多种性质。在一些实施方式中，鉴别出作为“命中”的一个或多个化合物，并进行系统性结构改变来产生与所述命中在结构上关联的化合物二级库(例如，精修前导化合物)。所述二级库随后可用本文所述的任何方法来筛选。

在一些实施方式中，iTR因子被修饰或纳入某部分来增强稳定性(例如，血清中)，提高半衰期，降低毒性和免疫原性，或者另行赋予所述化合物某种需要的性质。

iTR因子的应用

药物组合物

iTR因子有多种不同应用。本文描述了此类应用的非限制性示例。在一些实施方式中，iTR因子被用来增强器官或组织的再生。

适于增殖再生的示例性器官或组织包括肢，指(趾)、软骨、心脏、血管、骨、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肠、直肠、肛门、内分泌腺(例如甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、胰腺的内分泌部分)、皮肤、毛囊、胸腺、脾脏、骨骼肌、局部受损心肌、平滑肌、脑、脊髓、外周神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、肾、输尿管、膀胱、尿道、眼(例如视网膜、角膜)、或耳(例如螺旋器)。在一些实施方式中，iTR因子用以增强基质层(例如支撑组织实质的结缔组织)的再生。在一些实施方式中，iTR因子用以增强术后再生，例如手术需要去除至少部分患病或受损组织、器官或其它结构如肢、指(趾)等。例如，此类手术可能去除至少部分肝、肾、胃、胰腺、肠、乳腺、卵巢、睾丸、骨、肢、指(趾)、肌肉、皮肤等。在一些实施方式中，手术是去除肿瘤。在一些实施方式中，iTR因子是用来促进外伤、手术、疾病和烫伤后皮肤的无痕再生。

在各种实施方式中，增强再生可包括下述一种或多种：(a)提高再生速率；(b)提高再生程度；(c)促进再生组织或器官或其它身体结构中建立合适结构(例如，外形、模式、组织构造、组织极性)；(d)促进新组织以保留和/或恢复功能的方式生长。尽管对iTR因子增强再生的用途特别感兴趣，本发明还涵盖iTR因子增强修复或伤口愈合的一般用途，而非必需产生可检测的再生增强。因此，本发明提供增强修复或伤口愈合的方法，根据本文所述的任意方法，其中iTR因子被给予有需要的对象。在一些实施方式中，iTR因子被用以愈合伤口或增强对象的自然伤口愈合能力。例如，iTR因子可用来使伤口较快愈合或可用来使伤口愈合而无疤形成。

在一些实施方式中，本发明提供增强有需要对象内再生的方法，所述方法包括将有效量的iTR因子给予对象。在一些实施方式中，化合物(例如，iTR因子)的有效量是导致受损组织的再生速率或程度相比参比值(例如合适的对照值)有所提高的量。在一些实施方式中，参比值是没有该化合物(可选给予安慰剂)时预期(例如，平均或典型)的再生速率或程度。在一些实施方式中，iTR因子的有效量是导致结构性和/或功能性结果相比没有该化合物时预期(例如，平均或典型)的结构性和/或功能性结果有所改善的量。在一些实施方式中，化合物如iTR因子的有效量导致原基形成增强和/或疤痕减少。再生的程度或速率可基于(例如)再生组织的维度或体积来评估。可基于(例如)目视检查(可选包括利用显微镜或成像计算如X光、CT扫描、MRI扫描、PET扫描)和/或通过评估组织、器官或其它身体部分进行该组织、器官或其它身体部分常规进行的一种或多种生理过程或任务来评估结构性和/或功能性结构。通常，改善的结构性结果所指结果相比没有用iTR因子治疗时的预期结果(例如，平均或典型结果)更贴切近似正常结构(例如，组织受损前的结构或正常、健康个体中的结构)。本领域普通技术人员可选择合适的功能试验或测试。在一些实施方式中，再生速率或程度相比对照值的提高是统计学显著性(例如，p值<0.05或p值<0.01)和/或临床上显著的。在一些实施方式中，结构性和/或功能性结果相比对照值的改善是是统计学显著性和/或临床上显著的。"临床上显著(的/性)改善"指按医学或外科从业人员的合理判断，该改善给患者带来有意义的益处(例如，使该治疗值得进行的益处)。应理解，很多实施方式中，给予特定物质对象(例如，用于治疗目的的)iTR调控子是调控(例如，抑制)该物种的对象内内源TR基因表达的化合物。例如，若对象为人，则通常给予能抑制人TR抑制子基因产物的活性和激活人TR激活子基因产物的活性的化合物。

在一些实施方式中，iTR因子用来增强皮肤再生，例如，用于烫伤(温度或化学性)、刮伤或涉及皮肤损失的其它情况例如感染如坏死性筋膜炎或暴发性紫癜之后。在一些实施方式中，烫伤是二级或三级烫伤。在一些实施方式中，皮肤损失区域的面积为至少10cm²。在一方面，iTR因子增强植皮的再生。在一方面，iTR因子减少过度和/或病理性伤口收缩或成疤。

在一些实施方式中，iTR因子用来增强骨再生，例如，在不愈合骨折、植入物固定、牙周或者牙槽嵴增高、颅面外科的情况中，或新骨生成被视为恰当的其它情形。在一些实施方式中，iTR因子应用至需要骨再生的位点。在一些实施方式中，iTR因子被纳入骨移植材料或与其联用。骨移植材料包括多种陶瓷和蛋白性材料。骨移植材料包括自体骨(例如，采自髂骨、腓骨、肋骨等的骨)，来自尸体的异体骨和异种骨。合成性骨移植材料包括多种陶瓷，例如磷酸钙(例如，羟基磷灰石和磷酸三钙)，生物玻璃，和硫酸钙，以及蛋白质材料如脱钙骨基质(DBM)。DBM可通过碾磨皮质骨组织(通常至100-500μm的已筛分颗粒大小)，然后用盐酸(通常0.5到1N)处理经碾磨组织。在一些实施方式中，iTR因子与一种或多种骨移植材料一同给予对象。iTR因子可与骨移植材料混合(在含有iTR因子和骨移植材料的组合物中)或分别给予，例如在放置移植物后。在一些实施方式中，本发明提供含有iTR因子的骨膏。骨膏是具有合适稠度和组成的产品，从而它们可被引入骨缺陷，如孔隙、缺口、空腔、裂缝等，并被用来修补或填充这样的缺陷，或应用于现有的骨结构。骨膏通常具有充足展性以允许其被用户操作并塑造成不同的形状。此类处理需要的结果是会发生骨形成来置换该膏料，例如，保持膏料应用时的形状。骨膏为新骨形成提供了支持结构，并可含有促进骨形成的物质。在前述的一种或多种陶瓷或蛋白性骨移植材料(例如，DBM、羟基磷灰石)外，骨膏往往含有赋予材料膏样或油灰样稠度的一种或多种成份，例如透明质酸、脱乙酰壳多糖、淀粉成分如支链淀粉。

在一些实施方式中，iTR因子增强骨祖细胞自未分化间质细胞的募集和/或形成和/或增强骨祖细胞分化成形成新骨的细胞(成骨细胞)。

在一些实施方式中，iTR因子被给予患有骨量减少或骨质疏松的对象，例如，用来增强该对象中的骨再生。

在一些实施方式中，用iTR因子增强关节(例如纤维、软骨或滑膜关节)的再生。在一些实施方式中，所述关节是椎间盘。在一些实施方式中，关节是髋、膝、肘或肩关节。在一些实施方式中，iTR因子被用来增强牙和/或牙周组织或结构(例如，牙髓、牙周韧带、牙齿、牙周骨)的再生。

在一些实施方式中，将iTR因子与细胞联合给予对象。iTR因子和细胞可分别给予或在同一组合物中给予。若分别给予，则它们可给予至相同或不同位置。在各种实施方式中，细胞可与是自体、异体或异种的。细胞可包含祖细胞或干细胞，例如成熟干细胞。如本文所用，干细胞是具有至少以下性质的细胞：(i)自我更新，即，能进行多轮细胞分裂而仍保持未分化状态；(ii)多能性或多分化潜能，即，能产生多种不同细胞类型的后代(例如，特定组织或器官的不同细胞类型中的多种、大多数或全部)。成熟干细胞是源自非胚胎组织(例如，胎儿、产后或成熟组织)的干细胞。如本文所用，"祖细胞"涵盖多能的细胞和比多能干细胞更为分化但尚未完全分化的细胞。这些更为分化的细胞(可由胚胎祖细胞产生)具有的自体更新能力相比胚胎祖细胞有所减弱。在一些实施方式中，iTR因子的给予联合有：间充质祖细胞、神经祖细胞、内皮祖细胞、毛囊祖细胞、神经嵴祖细胞、乳腺干细胞、肺祖细胞(如支气管肺泡干细胞)、肌祖细胞(如卫星细胞)、脂肪来源的祖细胞、上皮祖细胞(如角质细胞干细胞)和/或造血祖细胞(如造血干细胞)。在一些实施方式中，细胞含有诱导型多能干细胞(iPS细胞)或已从iPS细胞至少部分分化的细胞。在一些实施方式中，祖细胞含有成熟干细胞。在一些实施方式中，至少一些细胞是已分化细胞，例如,软骨细胞、成骨细胞、角化细胞、肝细胞。在一些实施方式中，细胞含有成肌细胞。

在一些实施方式中，iTR因子在组合物(如溶液中)给予，所述组合物含有在给予对象后原位发生聚合或成为交联或进行转换的一种或多种化合物，通常形成水凝胶。所述组合物可含有单体、聚合物、引发剂、交联剂等。组合物可应用(例如，用注射器)至需要再生的区域，在该处原位成胶，iTR因子自此随时间释放。胶化的引发可通过(例如)接触体液中的离子或者温度或pH的改变，或者通过混合活性前体(例如，使用多管注射器)。参见例如，美国专利号6,129,761；Yu L,Ding J.Injectable水凝胶s as unique biomedicalmaterials.(可注射水凝胶作为独特的生物医学材料)Chem Soc Rev.37(8):1473-81(2008))。在一些实施方式中，水凝胶是含透明质酸或透明质酸和胶原I的水凝胶如本文所述的HyStem-C。在一些实施方式中，组合物还包含细胞。

在一些实施方式中，将iTR因子与表达端粒酶催化组分的载体联合给予对象。所述载体可分开给予或在同一组合物中给予。若分别给予，则它们可给予至相同或不同位置。所述载体可表达来自所治疗组织的相同物种或来自不同物种的端粒酶催化组分。iTR因子与端粒酶催化组分的共同给予在目标组织是来自年老对象且对象是人时特别有用。

其它创造性方法包括iTR因子在离体产生活的功能性组织、器官或含细胞组合物的应用，以修复或置换因伤所失组织或器官。例如，取自个体(无论是预期的受体、同一物种的个体还是不同物种的个体)的细胞或组织可体外培养，任选带有基质、支架(例如三维支架)或模具(例如，含有生物相容性(可选生物可降解)材料，例如聚合物如HyStem-C)，并且它们向功能性组织或器官的发育可通过接触iTR因子得到促进。所述支架、基质或模具可至少部分由天然产生的蛋白质如胶原蛋白、透明质酸或藻酸盐(或其中任意的化学修饰衍生物)，或乳酸、己内酯、乙醇酸等的合成聚合物或共聚物，或自组装肽，或从组织如心脏瓣膜、肠粘膜、血管和气管所盐酸的脱细胞基质。在一些实施方式中，支架含有水凝胶。在某些实施方式中，支架可涂有或浸渍有iTR因子，所述因子可随时间扩散出该支架。在离体产生后，组织或器官被移植至对象内或对象上。例如，在某些组织如皮肤的情形中，所述组织或器官可置于机体表面。所述组织或器官可在体内继续发育。在一些实施方式中，待至少部分离体产生的组织或器官可以是膀胱、血管、骨、筋膜、肝、肌肉、皮肤片等。例如，合适的支架可模拟胞外基质(ECM)。可选地，iTR因子被给予对象是在离体产生的组织或器官移植之前、期间和/或之后。在一些方面，生物相容性材料是在体外于所用浓度下对细胞基本无毒的材料，或者在材料被给予活体对象的情形中，是在所用的量和使用位置对所述对象的细胞基本无毒而且不会引发或导致对对象有害或不良的作用，例如免疫或炎性反应、不可接受的疤痕组织形成等。应理解，某些生物相容性材料可在小百分比的对象中引起此类不良反应，通常低于约5％、1％、0.5％或0.1％。

在一些实施方式中，涂覆或浸渍有iTR因子的基质或支架被植入需要再生的对象，可选与细胞联合植入。所述基质或支架可以是需要再生的组织或器官的形状。所述细胞可以是上文所述的任意细胞，例如能产生此类组织或器官的一种或多种类型干细胞和/或此类组织或器官中所见的类型。

在一些实施方式中，iTR因子被直接施用到组织损伤位点或其附近。"直接……到组织损伤位点"涵盖将化合物或组合物注射入组织损伤位点或使损伤化合物或组合物散播、倾倒至组织损伤位点或另行直接接触。在一些实施方式中，如果在距离组织损伤位点的可见或另行显见的边缘或者至少部分位于所述受损组织或器官内的血管(例如动脉)最远约10cm处进行施用/给予，则视为在"组织损伤位点附近"施用/给予"。在"组织损伤位点附近"施用有时是施用在受损器官内但无显见损伤的位置处。在一些实施方式中，组织、器官或其它结构损伤或损失后，iTR因子被应用至组织、器官或其它结构的残余部分。在一些实施方式中，iTR因子被应用至截指或截肢仍与机体相连的余部以增强已缺失部分的再生。在一些实施方式中，截下的部分经手术重连，且iTR因子被应用至伤口的任一或两面。在一些实施方式中，施用iTR因子以增强所移植器官或其部分的植入或修复或再生。在一些实施方式中，iTR因子被用来增强神经再生。例如，iTR因子可输注入截断的神经，例如，靠近其近和/或远端。在一些实施方式中，iTR因子位于人工神经导管内，该导管是由生物或合成材料构成的在其中封入神经末端和居间间隙的管。

在一些实施方式中，iTR因子被用来促进毛囊产生和/或毛发生长。在一些实施方式中，iTR因子引发从通常不形成毛发的上皮细胞再生毛囊。在一些实施方式中，iTR因子被用来治疗男性或女性中的脱发、头发稀疏和部分或完全秃发。在一些实施方式中，秃发是在毛发经常生长的地方如头的顶部、背面和/或侧面没有或实质性没有毛发或缺少毛发的状态。在一些实施方式中，头发稀疏是头发少于正常或平均的状态，或者在一些实施方式中，头发少于个体过去曾有头发的状态，或者在一些实施方式中，头发少于个体认为所需要的状态。在一些实施方式中，iTR因子被用来增强眉毛或睫毛的生长。在一些实施方式中，iTR因子被用来治疗雄激素性脱发或"男性型秃发"(其可影响男性和女性)。在一些实施方式中iTR因子被用来治疗涉及头皮上斑状脱发的斑秃，涉及所有头发的全秃，或涉及所有头发和体毛的普秃。在一些实施方式中，iTR因子应用至需要毛发生长的位点，例如头皮或眉区。在一些实施方式中，iTR因子应用到眼睑边缘以促进睫毛生长。在一些实施方式中，iTR因子以液体制剂应用。在一些实施方式中，iTR因子以霜、油膏、软膏或凝胶形式应用。在一些实施方式中，iTR因子被用来在烫伤、手术、化疗或导致毛发或长毛皮肤损失的其它事件后增强毛发生长。

在一些实施方式中，一个或多个iTR因子被给予到受年龄相关性退行性变化的组织以再生年轻态功能。所述年龄相关性退行性变化的非限制性示例包括：年龄相关性黄斑变性，冠状动脉疾病，骨质疏松症，骨坏死，心脏衰竭，肺气肿，末梢动脉疾病，声带萎缩，听力丧失，阿尔茨海默氏症，帕金森氏病，皮肤溃疡，和其它与年龄相关的退行性疾病。在一些实施方式中，所述iTR因子是与载体联合给予，所述载体表达端粒酶催化组分以延长细胞寿命。

在一些实施方式中，给予一个或多个iTR因子来增强对由于伤害如化疗、放疗或毒素而损失或损伤的细胞的置换。在一些实施方式中，此类细胞是实体器官和组织的基质细胞。

本发明的治疗方法可包括如下步骤：鉴别或提供患有或有风险罹患某种疾病或病症的对象，其中增强再生会使所述对象得益。在一些实施方式中，所述对象经历组织或器官的损伤或外伤(例如，物理创伤)。在一些实施方式中，所述损伤是肢或指(趾)的损伤。在一些实施方式中，对象所患疾病影响心脑血管、消化、内分泌、肌肉骨骼、胃肠、肝、外皮、神经、呼吸或泌尿系统。在一些实施方式中，组织损伤是对下述组织、器官或结构的损伤：软骨、骨、心脏、血管、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肠、直肠、肛门、内分泌腺、皮肤、毛囊、牙齿、齿龈、唇、鼻、口、胸腺、脾脏、骨骼肌、平滑肌、关节、脑、脊髓、外周神经、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺、阴茎、咽、喉、气管、支气管、肺、肾、输尿管、膀胱、尿道、眼(例如视网膜、角膜)、或耳(例如螺旋器)。

在一些实施方式中，在对象遭受组织损伤(例如，外伤或急性病相关事件如心肌梗死或中风)后约2、4、8、12、24、48、72或96小时内至少给予一次化合物或组合物，并可选此后给予至少一次。在一些实施方式中，在对象遭受组织损伤后约1-2周、2-6周、6-12周内至少给予一次化合物或组合物，并可选此后给予至少一次。

在本发明的一些实施方式中，刺激或促进缺失或发育不全的组织、器官或结构的再生或从头发育可能是有利的，例如，通过除去皮肤，除去需要再生或从头发育的位置处的至少一些组织，研磨需要再生或从头发育的关节或骨骼表面，和/或造成对象上的其他类型伤口。在组织损伤后再生的情形中，可能需要去除(例如，通过手术切除或清创)至少一些受损组织。在一些实施方式中，iTR因子被给予到此类去除或磨去的位点处或其邻近。

在一些实施方式中，iTR因子被用来增强对象内组织或器官的再生，受损对象中的该组织或器官由于先天病症如遗传疾病而至少部分缺失。很多先天性畸形导致各种组织、器官、或身体结构如肢或指(趾)的发育不全或不存在。在其它情形中，导致组织、器官或其它身体结构发育不全的发育病症在出生后显现。在一些实施方式中，iTR因子被给予患有组织、器官或其它身体结构的发育不全或缺失的对象，目的是刺激此类组织、器官或其它身体结构的生长和发育。在一些方面，本发明提供在患有组织、器官或其它身体结构的发育不全或缺失的对象中，增强该组织、器官或其它身体结构的产生的方法，所述方法包括给予所述对象iTR因子。在一些实施方式中，iTR因子被给予出生前的对象，即，子宫内给予。本文所述涉及再生的本发明的各种方面和实施方式可应用于此类组织、器官或其它身体结构的从头产生，并涵盖在本发明内。

在一些方面，iTR因子被用来在多种情况中增强组织产生，这些情况中新组织生长在此前不存在此类组织的位置是有用的。例如，在关节间产生骨组织在脊柱或其它关节的融合的情境中往往是有用的。

iTR因子可在再生的多种动物模型中测试。在一方面，iTR调控子在鼠物种中测试。例如，小鼠可带伤(例如，通过切口、截肢、横切或移除组织片段造成)。应用iTR因子至伤口和/或被去除组织片段的位点，并评估其对再生的效果。调控子对脊椎动物TR的影响可在用于组织或器官再生的多种脊椎动物模型中测试。例如，鳍再生可以在斑马鱼中进行评估，例如文献所述(马修K,Unraveling tissue regeneration pathways using chemicalgenetics(使用化学遗传学解析组织再生途径).J Biol Chem.282(48):35202-10(2007))，并可用作肢再生的模型。可用于测试治疗对组织和器官如心脏、肺、四肢、骨骼肌、骨等的再生的效果的啮齿动物、犬、马、山羊、鱼、两栖动物以及其它动物模型是广泛可得的。例如，用于骨骼肌再生的多种动物模型在Tissue Eng Part B Rev.16(1)(2010)有所讨论。用于研究肝再生的一种常用动物模式包括手术切去啮齿类肝脏的很大部分。用于肝再生的其它模型包括急性或慢性肝损伤或毒素如四氯化碳导致的肝衰竭。在一些实施方式中，毛发再生或皮肤伤口愈合模型包括切除一块皮肤，例如从小鼠切除。

可评估毛囊再生、头发生长、再上皮化、腺形成等。

本文所公开的和/或使用本文所述的方法和/或试验鉴别的化合物和组合物的给予可以通过任何适合方式如口服、鼻内、皮下、肌内、静脉内、动脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内、气管内、经眼、舌下、阴道、直肠、经皮或通过吸入，例如，作为气溶胶。当然，所选的特定模式会取决于所选的特定化合物，待处理的特定病症和治疗功效所需的剂量。一般来说，本发明的方法可用医学或兽医学上可接受的任何给予模式来实施，这是指产生可接受的功效水平而不导致临床上不可接受(例如，医学或兽医学上不可接受)的副作用。一种或多种化合物的合适制品，例如，基本上纯的制品，可以与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂等联用，以产生适于给予对象的合适药物组合物。此类药学上可接受的组合物是本发明的一个方面。术语"药学上可接受的载体或赋形剂"是指对组合物的一个或多个活性成分的生物活性或效力没有显著干扰且在所用或所给予的浓度下对宿主不会有过度毒性的载体(该术语涵盖载体、介质、稀释剂、溶剂、载剂等)或赋形剂。其它药学上可接受的成分也可以存在于该组合物。用于药物活性化合物制剂的合适物质及其用途是本领域熟知的(参见例如，"Remington's Pharmaceutical Sciences"(雷明顿制药科学)，E.W.Martin，第19版，1995，Mack出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，及其更新版本，如Remington:The Science andPractice of Pharmacy(雷明顿药学科学和实践，第21版，宾夕法尼亚州费城，LWW出版社，2005年，可见对药学上可接受物质和各类药物组合物的制备方法的其它讨论)。此外，本发明的化合物和组合物可与本领域中用于治疗感兴趣的特定疾病或病症的任何化合物或组合物联用。

药物组合物通常配制为与其预期的给药途径相容。例如，胃肠道外给药的制品包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。水性载体包括水，醇/水溶液，乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质，例如，氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏。非水性溶剂的示例是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；防腐剂，例如，抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，和张力调节剂诸如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱调节，如用盐酸或氢氧化钠。此类胃肠道外制品可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

就口服给药而言，所述化合物可通过组合所述活性化合物和本领域熟知的药学上可接受载体能容易地配制。此类载体使本发明的化合物可以配制为片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆、浆液、混悬剂等。用于口服急性的合适赋形剂包括填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

就吸入给药而言，本发明的组合物可以气雾剂喷雾形式递送自含合适推进剂(例如，气体如二氧化碳或碳氟聚合物)的加压容器或喷雾器。可使用液体或干气雾剂(例如，干燥粉末，大的多孔颗粒等)。本发明还考虑使用鼻喷雾或其他形式的经鼻给药来递送组合物。

对于局部应用，药物组合物可以配制在将活性组分悬浮或溶解在适于此类组合物的一种或多种药学上可接受载体中的合适的油膏、洗剂、凝胶剂或乳膏内。

对于局部递送至眼睛，药学上可接受的组合物可以配制成等渗、pH值经调整的无菌盐水中的溶液或微米化混悬剂，例如，用于眼用滴剂、或油膏、或用于眼内给药，例如通过注射。

药物组合物可配制用于经粘膜或透皮给药。对于经粘膜或透皮给药，在制剂中可采用适合待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域公知的。本发明的药物组合物可配置为栓剂(例如，使用常规的栓剂基料，如可可油或其他甘油酯)或滞留灌肠剂以用于直肠递送。

在一些实施方式中，组合物包括用于保护活性剂免于从体内快速消除的一种或多种试剂，如控释制剂、植入物、微囊化递送系统等。组合物可以纳入试剂来改善稳定性(例如，在胃肠道或血流中)和/或增强吸收。化合物可以被包封或纳入颗粒，例如，微粒和纳米粒子。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、PLGA、胶原、聚原酸酯、聚醚和聚乳酸。制备这类制剂的方法是本领域技术人员显而易见的。举例且不作限制的，本领域已知多种粒子、脂质和/或基于聚合物的递送系统用于递送siRNA。本发明考虑采用此类组合物。脂质体或气体基于脂质的粒子也可用作药学上可接受的载体

用于此类组合物的药物组合物和化合物可在符合管理机构规定的标准、规则或准则的条件下制得。例如，这样的组合物和化合物可以按照良好生产规范(GMP)和/或遵照适于人用药剂的质量控制程序来制得，并且可以提供有经负责监管药物、手术或其它治疗上有用的产品的政府管理机构批准的标签。

本发明的药物组合物在出于治疗目的给予对象时，优选给予的时间和量足以治疗其给予所针对的疾病或病症。活性药剂的治疗功效和毒性可通过标准的药学过程在细胞培养或实验动物中评估。获自细胞培养实验和动物研究的数据可用于配制适用于人或其它对象的一定范围的剂量。人体给予的不同剂量可在临床试验中更进一步测试，如本领域已知。所用剂量可以是最大耐受剂量或较低剂量。药物组合物中活性药剂的治疗有效剂量可以在以下范围内：约0.001mg/kg到约100mg/kg体重，约0.01到约25mg/kg体重，0.1到约20mg/kg体重，1到约10mg/kg。其它示例性剂量包括(例如)约1μg/kg到约500mg/kg、约100μg/kg到约5mg/kg。在一些实施方式中给予单一剂量，而其它实施方式则给予多个剂量。本领域的普通技术人员会理解，在任何特定情况下的适当剂量取决于所用药剂的效力，并且可以任选地针对特定受体调整。针对对象的具体剂量水平可能取决于多种因素，包括所用特定药剂的活性，特定的疾病或病症及其严重性，对象的年龄、体重、总体健康等。可能希望以单位剂量形式配制药物组合物，特别是用于口服或肠胃外的组合物，以易于给药和剂量均匀。本文所用的术语“单位剂量形式”指作为单一剂量用于待治疗对象的物理离散单位，每个单位包含预定量的活性药剂与适当的药学上可接受载体，该预定量经计算能够产生所需治疗效果。应该理解，治疗方案可以包括在一段时间内施用多个剂量，例如，多个单位剂量形式，这段时间可延续超过几天、几周、几个月或几年。对象可能在治疗期内一天接收一个或多个剂量，或可隔天接收剂量或频率更低。例如，施用可以是每两周，每周等。给药可以继续，例如，直至组织或器官的合适结构和/或功能已经至少部分恢复和/或直至所述化合物的持续给药未见能促进进一步再生或改进。在一些实施方式中，对象本人进行一个或多个剂量的本发明组合物的给药。

在一些实施方式中，联合给予两种或更多种化合物或组合物，例如，出于增强再生的目的。联合给予的化合物或组合物可以在同一组合物中合并给予或可分开给予。在一些实施方式中，"联合/合并"给予意味着，就第一和第二化合物或组合物的给予而言，给药的进行使得(i)在第一药剂最近给予的剂量中超过90％被代谢成非活性形式或被机体分泌之前给予第二化合物的剂量；或(ii)第一和第二化合物的剂量给予彼此相隔在48、72、96、120或168小时内，或(iii)这些试剂在相重合的时间段内给予(例如，通过持续或间歇输注)；或(iv)前述的任意组合。在一些实施方式中，给予两个或多个iTR因子，或者表达端粒酶催化组分的载体以及iTR因子。在一些实施方式中，iTR因子的给予联合有一个或多个生长因子、生长因子受体配体(例如，激动剂)、激素(例如，类固醇或肽激素)或者信号分子，有助于促进再生和极化。特别有用的是有助于组织再生能力细胞(如采用本发明所述方法产生的那些)的组织中心(organizing center)分子。在一些实施方式中，生长因子是表皮生长因子家族成员(例如，表皮生长因子、神经调节蛋白)，成纤维细胞生长因子(例如，任何FGF1-FGF23)，肝细胞生长因子(HGF)，神经生长因子，骨形态发生蛋白(例如，任何BMP1-BMP7)，血管内皮生长因子(VEGF)，Wnt配体，Wnt拮抗剂，视黄酸，NOTUM，卵泡抑素，音猬蛋白(sonichedgehog)或其它组织中心因子。

本领域技术人员应了解或能够确定采用常规实验即可获得本文所述的本发明具体实施方式的许多等同形式。本发明的范围不旨在局限于说明书或或其中阐述的细节。冠词如“一”，“一个”和“所述”可以表示一个或多于一个，除非另有明示，或者从上下文显见另有所指。本发明方法中的某些往往采用细胞群体来实施，例如，体外或体内实施。因此，所提“细胞”应被理解为包括所述细胞是细胞群体的实施方式，例如，群体包含基本上遗传相同多个细胞或由这些细胞组成。然而，本发明涵盖本发明的方法是应用到个体细胞的实施方式。因此，所提"细胞"应理解为包括适用于细胞群体内个体细胞的实施方式和适用于个体已分离细胞的实施方式。

除非另有明示或者从上下文显见另有所指，在组内的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明在组成员中其一、多个或全部存在于、用于或另行相关于给定产物或过程时被认为是满足的。本发明包括恰好一个组成员存在于、用于或另行相关于给定产物或过程的实施方式。本发明也包括多个或全部组成员存在于、用于或另行相关于给定产物或过程的实施方式。考虑到本文所描述的所有实施方式适用于本发明的所有不同方面。还考虑到，任何实施方式可以在适当时与一个或多个其它此类实施方式自由组合。此外，应理解，本发明涵盖所有变化、组合和替换，其中将来自一个或多个权利要求(不论是原始或后续加入的权利要求)的一个或更多的限制、要素、条款、说明性术语等引入另一权利要求(不论是正本或原始或后续加入)。例如，从属于另一权利要求的任何权利要求可以被修改以包括从属于同一基础权利要求的任何其它权利要求中所见的一个或多个要素或限定，并且所提要素存在于不同权利要求的任意权利要求可以修改为纳入与所述权利要求从属于同一基础权利要求的任何其它权利要求中所见的一个或多个要素或限定。此外，当权利要求书涉及组合物时，本发明提供了制备该组合物的方法，例如，按本文公开的方法，以及使用该组合物的方法，例如，出于本文公开的目的。在权利要求涉及方法时，本发明提供适于执行该方法的组合物，和制备所述组合物的方法。另外，当权利要求书涉及制备组合物的方法时，本发明提供根据本发明的方法制备的组合物和使用该组合物的方法，除非另有说明或除非本领域普通技术人员认识到会出现矛盾或不一致。要素以列表如以马库什组的形式表示时，这些要素中的每一子组也被公开，也可从该组中去除任何要素。为了简明，仅明确提及这些实施方式中的一些，但本发明涵盖所有此类实施方式。还应理解，在一般情况下，当本发明或本发明的各方面是/被提及包含特定要素、特征等时，本发明的某些实施方式或本发明的方面由或基本由这样的要素、特征等组成。

本文提及数值范围时，本发明包括包含端点的实施方式，两个端点被排除的实施方式，和包含其中一个端点而另一被排除的实施方式。除非另有指明，应假定包含两个端点。此外，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解另有显见，表达为范围的数值可以在本发明的不同实施方案中假定为所述范围内的任意特定值或子范围，到范围下限的十分位，除非上下文另有明确说明。使用短语如“小于X”，“大于X”或“至少X”(其中X是一个数目或百分数)时，应理解任何合理的值可以被选择作为该范围的下限或上限。还应理解，在本文中给出一列数值(无论是否前置有“至少”)时，本发明包括涉及所列的任何两个数值限定的任何中间值或范围的实施方式，并且最低值可以作为最小值而最高的值可以作为最大值。此外，在一列数字如百分数前置有“至少”时，该术语适用于该列中的每个数字。对于数值前置有“约”或“近似”的本发明的任何实施方式，本发明包括提及该精确值的实施方式。对于数值无前置“约”或“近似”的本发明的任何实施方式，本发明包括该值前置有“约”或“近似”的实施方式。“近似”或“约”通常包括在数值的任一方向(大于或小于所述数字)的1％或在一些实施方式中5％或在一些实施方式中10％的范围内的数字，除非另有说明或从上下文另行显见(例如，当此类数目无法超过100％d的可能值时)。如本文所用的“组合物”可包括一个或一个以上的组成，除非另有说明。例如，“包含激活子或TR激活子的组合物”可以由或基本由TR激活子组成或可含有一种或多种附加组分。应理解，除非另有说明，在本发明的任何实施方式中抑制剂或TR抑制子(或本文提及的其它化合物)可以在组合物中使用或施用，所述组合物包含一种或多种附加组分包括存在TR激活子的激活子。

试剂盒

本发明的某些实施方式提供试剂盒，其含有图1中的一个或多个基因或由图1中的基因编码的一种或多种基因产物。在一些实施方式中，试剂盒包含由选自PCDHHB2、PCDHB17、Nbla10527、RAB3IP、DLX1、DRD11P、FOXD1、LOC728755、AFF3、F2RL2、MN1、CBCAQH03 5、LOC791120、SIX1、OXTR和WSB1的一个或多个基因编码的基因或基因产物。在另一些实施方式中，试剂盒包含基因或基因产物，其由选自如下的一个或多个基因编码：COMT、TRIM4、CAT、PSMD、SHMT、LOC205251、ZNF280D、S100A6、MGMT、ZNF280D、DYNLT3、NAALADL1、COX7A1、TSPYL5、IAH1、C18orf56、RPS7,FDPS、ELOVL6、INSIG1、ACAT2和MAOA。在又一些实施方式中，试剂盒包含由选自PCDHHB2、PCDHB17、Nbla10527、RAB3IP、DLX1、DRD11P、FOXD1、LOC728755、AFF3、F2RL2、MN1、CBCAQH03 5、LOC791120、SIX1、OXTR和WSB1的多个基因编码的基因产物或基因。在另一些实施方式中，试剂盒包含基因或基因产物，其由选自如下的多个基因编码：COMT、TRIM4、CAT、PSMD、SHMT、LOC205251、ZNF280D、S100A6、MGMT、ZNF280D、DYNLT3、NAALADL1、COX7A1、TSPYL5、IAH1、C18orf56、RPS7,FDPS、ELOVL6、INSIG1、ACAT2和MAOA。

在一些实施方式中，试剂盒可包含一种或多种试剂，其抑制选自PCDHHB2、PCDHB17、Nbla10527、RAB3IP、DLX1、DRD11P、FOXD1、LOC728755、AFF3、F2RL2、MN1、CBCAQH03 5、LOC791120、SIX1、OXTR和WSB1的一个或多个基因的表达。在另一些实施方式中，试剂盒包含一种或多种试剂，其抑制选自如下的一个或多个基因的表达：COMT、TRIM4、CAT、PSMD、SHMT、LOC205251、ZNF280D、S100A6、MGMT、ZNF280D、DYNLT3、NAALADLl、COX7A1、TSPYL5、IAH1、C18orf56、RPS7,FDPS、ELOVL6、INSIG1、ACAT2和MAOA。在又一些实施方式中，试剂盒可包含多种试剂，其抑制选自PCDHHB2、PCDHB 17、Nbla10527、RAB3IP、DLX1、DRD11P、FOXD1、LOC728755、AFF3、F2RL2、MN1、CBCAQH03 5、LOC791120、SIX1、OXTR和WSB1的多个基因的表达。在另一些实施方式中，试剂盒包含多种试剂，其抑制选自：COMT、TRIM4、CAT、PSMD、SHMT、LOC205251、ZNF280D、S100A6、MGMT、ZNF280D、DYNLT3、NAALADLl、COX7A1、TSPYL5、IAH1、C18orf56、RPS7,FDPS、ELOVL6、INSIG1、ACAT2和MAOA的多个基因的表达。

在一些实施方式中，试剂盒提供试剂，其结合选自PCDHHB2、PCDHB 17、Nbla10527、RAB3IP、DLX1、DRD11P、FOXD1、LOC728755、AFF3、F2RL2、MN1、CBCAQH03 5、LOC791120、SIX1、OXTR和WSB1的一个或多个基因编码的一个或多个基因或基因产物。在另一些实施方式中，试剂盒提供试剂，其结合选自COMT、TRIM4、CAT、PSMD、SHMT、LOC205251、ZNF280D、S100A6、MGMT、ZNF280D、DYNLT3、NAALADLl、COX7A1、TSPYL5、IAH1、C18orf56、RPS7、FDPS、ELOVL6、INSIG1、ACAT2和MAOA的一个或多个基因编码的一个或多个基因或基因产物。结合一个或多个基因的试剂可抑制该基因的表达或该基因编码的基因产物。.所述试剂可以是蛋白质，例如抗体。所述试剂可以是核酸如DNA分子，RNA分子如mRNA分子、siRNA分子、dsRNA分子。

试剂盒的内容物可提供在一个或多个容器内。试剂盒的内容物可提供在溶液中，例如在合适缓冲剂如PBS或去离子水内。或者，试剂盒的内容物可以干燥如冻干形式提供。

方法

在下文所述方法以外，用于产生和利用对应于无疤再生潜能具有胚胎模式基因表达的细胞的方法在以下文献中有所描述：PCT申请号PCT/US2006/013519，申请日2006年4月11日11，题为"Novel Uses of Cells With Prenatal Patterns of Gene Expression(具备产前基因表达模式的细胞的新用途)"；第11/604号美国专利申请，申请日2006年11月21日，题为"Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains fromPluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby(从多能干细胞分离新型细胞株的加快方法和由此得到的细胞)"；和第12/504,630号美国专利申请，申请日2009年7月16日，题为"Methods to Accelerate the Isolation of Novel Cell Strains fromPluripotent Stem Cells and Cells Obtained Thereby(从多能干细胞分离新型细胞株的加快方法和由此得到的细胞)"，各自通过引用纳入本文。

透明质酸和胶原水凝胶的制备

HyStem-C(生物时代股份有限公司(BioTime)，美国加州阿拉米达(Alameda))按生产商的说明重溶。简单来说，HyStem成份(巯基修饰的透明质酸，10mg)被溶解在1.0ml除气去离子水中约20分钟以制备1％w/v溶液。Gelin-S成份(巯基修饰的明胶，10mg)被溶解在1.0ml除气去离子水中以制备1％w/v溶液，而PEGDA(PEG二丙烯酸酯，10mg)被溶解在0.5ml除气去离子水中以制备2％w/v溶液。然后，HyStem(1ml,1％w/v)与Gelin-S(1ml,1％w/v)在临用前混合。沉淀的细胞悬浮在如上所述新近制备的HyStem:Gelin-S(1:1v/v)混合物内。加入交联剂PEGDA、终浓度2.0x 10⁷细胞/ml的细胞悬浮液后，将细胞/基质组合注射入靶组织。

RNAi

作为非限制性实施例，dsRNA采用PCR产生的模板经体外转录反应(Promega)制得，侧接有T7启动子，通过苯酚提取和乙醇沉淀来纯化，并在再悬浮于水中后退火。完整的实验动物在诱导组织损伤后连续3天注射以4次30nL的dsRNA，以术后2小时的第一次注射开始.

实施例

实施例1.通过比较hES、iPS和克隆EP细胞系与不同胎儿和成熟体衍生型体细胞类型的基因表达鉴定iTR基因。

在不同成熟和胚胎细胞类型中进行Illumina基因表达微阵列分析，细胞类型包括14种不同血细胞类型，来自全部三种胚层的115种不同的胎儿和成熟体衍生型体细胞类型，545中不同的克隆hES衍生性和iPS衍生型EP细胞系，12种hES细胞系和17种人iPS细胞系胎儿/成熟体衍生型细胞中各探针的平均RFU值和克隆EP细胞系中相应的平均进行比较，鉴别出在两组中其一内具有相对均匀的较高表达的探针。如图1和图2-15所示，这些基因代表在细胞内在氧化磷酸化中具有已知作用的因子(COX7A1)、转录因子有SIX1和DLX1，以及其它不同活性的因子。低于100的RFU值被视为背景信号(即，没有可检测的表达).

实施例2.转基因小鼠中iTR基因的修饰和成熟动物中的iTR试验。分别或联合诱导基因：CAT、COMT、COX7A1、DLX1、DRD1IP、LOC205251NAALADL1、PCDHB2、PCDHB17、原发神经母细胞瘤cDNA克隆:Nbla10527、RAB3IP、SIX1、TRIM4和ZNF280D的表达的胚胎模式，以记录切割的耳垂和其它体细胞组织中这些基因对提高组织再生的影响。

实施例3.体外试验通过调控iTR基因的人基质组织再生上调iTR诱导基因或下调iTR抑制基因的再生潜能可采用本文所述的体外伤口修复试验来测试。简单来说，利用(Nature Protocols 2,329-333(2007)Liang CC等，"In vitro scratch assay:aconvenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro(体外划痕试验：分析体外细胞迁移的便捷低廉方法)")中所述划痕测试。该试验利用新生人包皮成纤维细胞(Xgene公司，加州索萨利托(Sausalito))，其表达COX7A1的水平与本文所述的其它胎儿和成熟体衍生型基质细胞相当。成纤维细胞在6孔板内用补充有10％FBS的DMEM培养基生长至汇合，板先行涂覆有0.1％明胶，再在湿培养箱内以5％O₂和10％CO₂培养。

在第0天使用下述试剂改变iTR抑制基因COX7A1的表达:

-SMART库:ON-TARGETplus COX7A1 siRNA,5nmol(Dharmacon,cat#L-013152-02-0005)

-ON-TARGETplus非靶向库5nmol(Dharmacon,cat#D-001810-10-05)

-DharmaFECT 1转染试剂0.75mL(Dharmacon,cat#T-2001-02)

-无血清、无抗生素，基础培养基

-无抗生素的完全培养基

非靶向库siRNA和在靶(on-target)(COX7A1)siRNA库的母液(100uM)是通过向5nmol添加50ul无菌水而制得。然后在用无菌水稀疏后制得非靶向和在靶siRNA的5uM溶液。各5uM siRNA溶液曲50ul加入2个相应标记的微量离心管，管中含有450ul无血清培养基(DMEM培养基+glutamax 2mM)得到总体积各为500ul。

转染试剂是将110ul加入2090ul无血清培养基(DMEM+glutamax 2mM)来制得。振荡后，离心并静置5分钟，取500ul转染混合物加至500ul(a)非靶向siRNA混合物(对照)和(b)在靶siRNA混合物。试剂(各1ml)通过上下抽吸来混合。

在已培养的Xgene包皮成纤维细胞通过抽吸去除生长培养基、PBS清洗、再向6孔板的各孔添加1.6ml无抗生素生长培养基后，启动转染。添加400ul的(a)非靶向siRNA对照的转染剂、(b)在靶转染剂混合物来得到每个处理孔2ml。siRNA终浓度为50nM。孔板经离心以确保均匀分布，并置入湿培养箱5％O₂和10％CO₂培养6小时。

6小时后，从培养箱去除孔板，并用200ul移液器吸头在各孔中央造成“划痕”。平板随后用PBS清洗两遍，加入新鲜的生长培养基(3ml/孔)并放回培养箱。D0(“划痕”后短时间内)、D1和D2以4x拍照来观察细胞移动、增殖和外形。在第2天和第4天提取RNA用于后续qPCR分析。

如图16所示，iTR抑制基因COX7A1的下调导致三维组织架构再生的显著改善，以相比对照体细胞更快的速率发生再生。提取样品的RNA并通过PCR分析ACTA2和COL1A1转录的相对水平，这些基因被认为分别参与结疤的伤口床内基质细胞的肌纤维母细胞收缩反应和纤维化疤痕响应。如图17所示，新生儿包皮成纤维细胞对iTR抑制基因COX7A1下调的反应是降低ACTA2和COL1A1的表达，这与COX7A1下调导致三维人体组织的再生增强和同时导致更少疤痕形成应答的再生相一致。

在COX7A1以外，单独或联合使用本文所述的其它iTR调控子替代COX7A1来对三维组织结构的再生和降低对组织损伤的纤维化、成靶响应进行体外试验。