一种适用于核酸检测试剂盒冻干的冻干保护剂及其冻干方法
阅读说明：本技术 一种适用于核酸检测试剂盒冻干的冻干保护剂及其冻干方法 (Freeze-drying protective agent suitable for freeze-drying of nucleic acid detection kit and freeze-drying method thereof ) 是由 王晓敏 王河清 冯礼群 张吉燕 赵慧 刘中华 王国强 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种适用于核酸检测试剂盒冻干的冻干保护剂及其冻干方法,通过本发明提供的冻干工艺可以将各种液体核酸检测试剂盒制备成冻干制剂,使其可以完全摆脱冷链运输的限制,便于常温长途运输和常温长期储存,为各种液体核酸检测试剂盒提供了稳定的保存方法。冻干制剂具有稳定性高、使用方便的特点,冻干制剂含水量低,延长了核酸检测试剂的保质期。在本发明中对冻干所需的保护剂进行了优化,使冻干后的成品制剂性能更加稳定。(The invention discloses a freeze-drying protective agent suitable for freeze-drying of a nucleic acid detection kit and a freeze-drying method thereof. The freeze-dried preparation has the characteristics of high stability and convenience in use, has low water content, and prolongs the shelf life of the nucleic acid detection reagent. In the invention, the protective agent required by freeze-drying is optimized, so that the performance of the freeze-dried finished product preparation is more stable.)
技术领域
：本发明属于生物制剂技术领域，特别涉及一种适用于各种核酸检测试剂盒进行真空冷冻干燥的冻干工艺。
背景技术
：真空冷冻干燥技术是一种水溶液在低温下冻结，而后在真空状态下将其中的水分不经过液提状态而直接升华干燥的技术，其干燥后的物质具有物理和化学性质基本不变，性状基本不变，有效成分损失小，复水性好，密封保存周期长。真空冷冻干燥技术为稳定性差的、需要冷链运输和储存的各类液体核酸检测试剂盒提供了稳定的保存方法。
在生物制品的冷冻干燥过程中，主要有三种效应会影响其中活性组分的稳定性甚至导致失活：①冻结效应：在生物制品的冻结过程中，不断结晶会导致溶液的浓度快速升高，离子浓度增加，促进了化学反应。在有些生物制品溶液的冻结过程中，溶液的PH值也会发生变化，导致蛋白质发生物理聚集和化学变性。②脱水效应：水溶液在蛋白质经过充分水合作用后，在蛋白质分子表面附着一水合层，在冷冻干燥过程中有一部分结合水会被去除，结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构，最终导致蛋白质的变性。③低温效应：生物制品中活性组分在降温和升温过程的一定温度范围内会发生变性。生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤的复杂过程，为了防止药品和生物制品在冷冻干燥过程中关键活性组分的变性，因此在大多数的药品和生物制品的冷冻干燥过程中，都需要添加合适的冷冻干燥保护剂，配制成混合液后，才能进行有效的冷冻干燥。
在冷冻干燥过程中常用的一些保护剂主要有糖类、多元醇类、表面活性剂类、氨基酸类、其它添加剂类等。糖类：单糖（葡萄糖、半乳糖）对蛋白质的冷冻干燥过程不能起到保护作用，这是因为单糖在冻结过程中只能提供非常微弱的稳定作用，使得蛋白质在脱水干燥前就发生了不可逆变性，所以在目前的生物制品的冷冻干燥配方中，一般不单独使用单糖作为保护剂。在许多生物制品的冻干过程中，常常采用低聚糖（蔗糖、海藻糖），尤其是二糖既能在冻结过程中起低温保护剂的功能，又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。海藻糖是一种天然的糖类，具有相对较高的玻璃化转变温度，可以有效防止水对玻璃化态的增塑作用。在蛋白质冻干过程中，当蛋白质失水时会发生变性，海藻糖可以填补到因为失水而产生的空缺当中，从而有效的防止了冻干过程中蛋白质的变性。
多元醇（甘露醇、山梨醇、丙三醇）具有和糖类一样的作用。甘露醇在无菌溶液中性状稳定，不易被氧化。在生物制品的冷冻干燥过程中，甘露醇一般提供支持结构，用作填充剂，并且不与活性组分发生反应。山梨醇是甘露醇的同分异构体，其溶解度比甘露醇大，具有吸湿性，但高温下不稳定，在冷冻干燥配方中，山梨醇常用作填充剂。丙三醇（甘油）在冷冻干燥配方中，一般用作低温保护剂。
氨基酸类：氨基酸是蛋白质的基本构成单位，其中最主要的是a-氨基酸。常用的氨基酸类保护剂有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和组氨酸，氨基酸是很好的填充剂。由于氨基酸离子具有酸碱两性，因此能够在生物制品的低温保存和冷冻干燥过程中抑制溶液PH值的变化，从而达到保护活性组分的目的。如低浓度甘氨酸可通过抑制10或100mmol/L磷酸缓冲盐结晶所致PH值的改变而阻止蛋白质变性，并且能升高成品的塌陷（崩解）温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质的破坏。
聚合物类：聚合物能提高生物制品混合溶液的玻璃化转变温度，因此在有些生物制品的配方中常常加入多种聚合物类保护剂。聚合物类保护剂一般同时起着低温保护剂和脱水保护剂的作用，如：聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、右旋糖酐、聚乙二醇等。在一般情况下，在生物制品中的冷冻干燥过程中添加聚合物可以提高溶液的黏度；抑制小分子赋形剂（如蔗糖）的结晶；抑制溶液PH值降低；在蛋白质分子之间产生位阻作用等。
表面活性剂类：表面活性剂可以降低界面的张力。在生物制品的冷冻干燥过程中，表面活性剂既能在冻结和脱水过程中降低冰水界面张力引起的冻结和脱水变性，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用。其它添加剂类：其它添加剂类保护剂包括抗氧化剂、缓冲剂和冻干加速剂。抗氧化剂：抗氧化剂可以防止生物制品在冷冻干燥过程中发生氧化变质的物质，如维生素E、硫代硫酸钠、蛋白质水解物等。将不同的抗氧化剂混合起来使用，比单独使用时，具有更高的效力，即混合抗氧化剂具有增效的作用。缓冲剂：在冷冻干燥过程中溶液的浓度会逐渐升高，当浓度升高到一定程度时可改变溶液的PH值，PH值变化4个单位会导致蛋白质变性，从而使生物制品失去活性。因此在冻干保护剂配方中，需添加适量缓冲剂来将生物制品的PH值调整到活性物质的最稳定区域，如氨基酸、磷酸、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠等。冻干加速剂：冷冻干燥过程耗时长、耗能多，迫切需要对冻干工艺进行优化，降低生产成本。叔丁醇是一种小分子醇，在溶液中加入叔丁醇可降低干燥层阻力，从而加速干燥过程，缩短冷冻干燥时间，同时对于难溶于水的物质，可使产品具有较高的比表面积、好的外观，并易于复水，提高药品溶液和冻干品的稳定性，且有一定的抑菌作用。
公开于该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
：本发明的目的在于提供一种适用于各种核酸检测试剂盒进行真空冷冻干燥的冻干工艺，从而克服上述现有技术中的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一种适用于核酸检测试剂盒冻干的冻干保护剂，包括：一种适用于DNA检测试剂盒冻干的冻干保护剂和一种适用于RNA检测试剂盒冻干的冻干保护剂；所述DNA检测试剂盒的冻干保护剂混合液包括：乳糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶、精氨酸、甘氨酸、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、右旋糖酐、Tween20、SE-15中的几种；所述RNA检测试剂盒的冻干保护剂混合液包括：乳糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明胶、精氨酸、甘氨酸、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、右旋糖酐、Tween20、SE-15中的几种。
我们发明了一种适用于核酸检测试剂盒冻干的冻干保护剂及其冻干方法，通过本发明提供的冻干工艺可以将各种液体核酸检测试剂盒制备成冻干制剂，使其可以完全摆脱冷链运输的限制，便于常温长途运输和常温长期储存，为各种液体核酸检测试剂盒提供了稳定的保存方法。冻干制剂具有稳定性高、使用方便的特点，冻干制剂含水量低，延长了核酸检测试剂的保质期。在本发明中对冻干所需的保护剂进行了优化，使冻干后的成品制剂性能更加稳定。在本发明中还包含一种冻干制剂制备方法，在所述的冻干制剂制备方法中对冻干程序参数进行了优化，极大的提高了冻干制剂的性状，保证了冻干制剂的稳定性，同时得到的冻干制剂具有外观美观、完好率高、酶活性稳定、操作简单等优点，并且本发明提供的冻干工艺和制备方法简单可行，条件温和，重现性好，可控性强，适合大规模的生产，且更加方便临床使用和保存。
优选地，上述技术方案中，根据权利1所述的适用于核酸检测试剂盒冻干的冻干保护剂，其特征在于，所述DNA检测试剂盒的冻干保护剂混合液和所述RNA检测试剂盒的冻干保护剂混合液的PH值为6~10。
优选地，上述技术方案中，冻干保护剂混合液的PH的PH调节剂选自醋酸-醋酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCL缓冲液、磷酸盐-氢氧化钠组成的缓冲体系中的一种或几种。
一种适用于核酸检测试剂盒冻干方法，冻干方法包括：预冻、升华干燥和解析干燥。
预冻设置为：预冻温度在20min~60min内达到-30℃~-50℃，保持1 h ~5 h；
所述升华干燥设置为：升华干燥温度在20min~60min内达到-45℃~-20℃，保持5h~25 h，真空度为0~30Pa；
所述解析干燥设置为：解析干燥温度在1h~5 h内达到10℃~35℃，保持2h~10 h，真空度为极限真空；
在冷冻干燥结束后，真空状态下冲入惰性气体，箱内压塞后出箱。
优选地，上述技术方案中，各种液体核酸检测试剂盒通过真空冷冻干燥得到的冻干制剂成品的含水量为0.1%~3%。
优选地，上述技术方案中，惰性气体为氮气、氩气、二氧化碳中的一种。
一种核酸检测8联PCR反应管冻干制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）配制核酸检测反应试剂混合液；
（2）将混合液利用精确分液系统分装到单个8联PCR反应管中；
（3）将8联PCR反应管放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
（4）冻干结束后，对8联PCR反应管冻干制剂进行抽真空密封。
优选地，上述技术方案中，各种液体核酸检测试剂盒通过真空冷冻干燥得到的冻干制剂成品的含水量为0.1%~3%。
一种核酸检测西林瓶冻干制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）配制新型冠状病毒核酸检测反应试剂混合液；
（2）将混合液利用精确分液系统分装到西林瓶中；
（3）将西林瓶放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
（4）冻干结束后，对西林瓶进行密封。
优选地，上述技术方案中，各种液体核酸检测试剂盒通过真空冷冻干燥得到的冻干制剂成品的含水量为0.1%~3%。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
上述技术方案中对冻干保护剂组分进行了优化，使冻干后的成品制剂性能更加稳定。对冻干程序参数进行了优化，极大的提高了冻干制剂的性状，保证了冻干制剂的稳定性，同时使所得的冻干制剂具有美观的形态。各种液体核酸检测试剂盒通过本发明提供的冻干工艺制备成冻干制剂后，可以完全摆脱冷链的运输，实现常温的长途运输和常温的长期储存，尤其解决了偏远地区低温冷链难以保障的技术问题。各类液体核酸检测试剂盒通过本发明的冻干工艺制备成冻干制剂，其制备方法简单、重现性好，容易实现大规模生产，且更加方便临床使用和保存。将用于核酸检测的PCR扩增体系混匀后冻干，后期核酸检测时，只需将冻干制剂复溶后，加入提取核酸即可进行PCR扩增检测。与液体试剂相比不存在繁琐的混液和分装的过程，操作误差少，操作更加简单，可以从根本上节约时间，加大检测量。
附图说明
：图1为本发明实施例中提供的使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（货号为：JB20105）进行冷冻干燥的8联PCR反应管冻干制剂成品图。
图2为本发明实施例中提供的使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（货号为：JB20105）进行冷冻干燥的冻干制剂成品密封包装图。
图3为本发明实施例中提供的使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（货号为：JB20105）进行冷冻干燥的8联PCR反应管冻干制剂成品在45℃条件下放置3个月时的加速稳定性PCR扩增曲线图。
图4为本发明实施例中提供的使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（货号为：JB20105）进行冷冻干燥的西林瓶冻干制剂成品图。
图5是本发明实施例中提供的使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）进行冷冻干燥的8联PCR反应管冻干制剂成品在45℃条件下放置3个月时的加速稳定性PCR扩增曲线图。
图6是本发明实施例中提供的使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）进行冷冻干燥的8联PCR反应管冻干制剂成品在37℃条件下放置6个月时的加速稳定性PCR扩增曲线图。
图7是本发明实施例中提供的使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）进行冷冻干燥的西林瓶冻干制剂复溶后放置于-20℃条件下，冻融10次时的PCR扩增曲线图。
具体实施方式
：
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
在本实施例中，提供了一种适用于DNA检测试剂盒冻干的冻干保护剂及一种冻干方法，制备成8联PCR反应管冻干制剂。使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（货号为：JB20105）进行冷冻干燥。优化后的冻干保护剂混合液包括：25%海藻糖、16%甘露醇、4%甘氨酸、2.5mg/mL牛血清白蛋白、5%右旋糖酐、0.5%Tween20、0.1%SE-15、100mmol/mLTris-HCl以及焦磷酸二乙酯处理过的水。
具体步骤如下：
（1）配制优化后的冻干保护剂混合液。
（2）根据肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）说明书配制核酸检测PCR反应试剂混合液。
（3）将优化后的冻干保护剂混合液和配制好的核酸扩增PCR反应试剂混合液按4:16的比例混匀。
（4）将混匀后的液体试剂利用精确分液系统分装到8联PCR反应管中。
（5）将8联PCR反应管放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。
（6）冻干程序参数设定：
预冻设置为：
第一阶段预冻温度在40min内达到4℃，保持0.5h；
第二阶段预冻温度在30min内达到-45℃，保持3h。
升华干燥设置为：
第一阶段升华干燥温度在40min内达到-35℃，保持1 h，真空度为10Pa；
第二阶段升华干燥温度在30min内达到-30℃，保持10h，真空度为10Pa。
解析干燥设置为：
第一阶段解析干燥温度在40min内达到20℃，保持1 h，真空度为极限真空；
第二阶段解析干燥温度在30min内达到30℃，保持5 h，真空度为极限真空。
（7）冻干结束后，冲入氮气，箱内压塞，环境的温度和湿度达到要求后，打开冻干机箱门，取出核酸检测8联PCR冻干制剂反应管。
（8）观察冻干制剂的外观是否合格。
（9）利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量。（利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量为1.79%）
（10）将核酸检测8联PCR冻干制剂反应管和干燥剂一起放入铝箔袋中进行抽真空密封。
（11）使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒进行冷冻干燥的8联PCR反应管冻干成品制剂如附图1所示，8联PCR反应管冻干制剂成品密封包装如附图2所示。
实施例2
在本实施例中，提供了一种适用于DNA检测试剂盒冻干的冻干保护剂及一种冻干方法，在预冻阶段加入退火操作，制备成8联PCR反应管冻干制剂。使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（货号为：JB20105）进行冷冻干燥。所优化的保护剂混合液包括：25%海藻糖、16%甘露醇、4%甘氨酸、2.5mg/mL牛血清白蛋白、5%右旋糖酐、0.5%Tween20、0.1%SE-15、100mmol/mLTris-HCl以及焦磷酸二乙酯处理过的水。
具体步骤如下：
（1）配制优化后的冻干保护剂混合液。
（2）根据肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）说明书配制核酸检测PCR反应试剂混合液。
（3）将优化后的冻干保护剂混合液和配制好的核酸检测PCR反应试剂混合液按4:16的比例混匀。
（4）将混匀后的液体试剂利用精确分液系统分装到8联PCR反应管中。
（5）将8联PCR反应管放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。
（6）冻干程序参数设定：
预冻设置为：
第一阶段预冻温度在40min内达到4℃，保持0.5h；
第二阶段预冻温度在30min内达到-45℃，保持2h。
第三阶段预冻温度（退火操作）在30min内达到-30℃，保持1h；
第四阶段预冻温度在40min内达到-45℃，保持3h。
升华干燥包括：
第一阶段升华干燥温度在40min内达到-35℃，保持1h，真空度为10 Pa；
第二阶段升华干燥温度在30min内达到-30℃，保持7h，真空度为10Pa。
解析干燥包括：
第一阶段解析干燥温度在40min内达到20℃，保持1h，真空度为极限真空；
第二阶段解析干燥温度在30min内达到30℃，保持5h，真空度为极限真空。
（7）冻干结束后，冲入氮气，箱内压塞，环境的温度和湿度达到要求后，打开冻干机箱门，取出核酸检测8联PCR冻干制剂反应管。
（8）观察冻干制剂的外观是否合格。
（9）利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量。（利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量为1.64%）
（10）将核酸检测8联PCR冻干制剂反应管和干燥剂一起放入铝箔袋中进行抽真空密封。
（11）高温加速稳定性测试
将上述肺炎克雷伯菌核酸检测8联PCR反应管冻干制剂成品在45℃条件下进行高温加速测试，PCR扩增结果表明在45℃条件下放置3个月时肺炎克雷伯菌核酸检测8联PCR反应管冻干制剂于对照液体试剂盒的差异不大，如附图3所示。
实施例3
在本实施例中，提供了一种适用于DNA检测试剂盒冻干的冻干保护剂及一种冻干方法，制备成西林瓶冻干制剂。使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（货号为：JB20105）进行冷冻干燥。所优化的保护剂混合液包括：25%海藻糖、16%甘露醇、4%甘氨酸、2.5mg/mL牛血清白蛋白、5%右旋糖酐、0.5%Tween20、0.1%SE-15、100mmol/mLTris-HCl以及焦磷酸二乙酯处理过的水。
具体步骤如下：
（1）配制优化后的冻干保护剂混合液。
（2）根据肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）说明书配制核酸检测PCR反应试剂混合液。
（3）将优化后的冻干保护剂混合液和配制好的核酸检测PCR反应试剂混合液按4:16的比例混匀。
（4）将混匀后的液体试剂利用精确分液系统分装到西林瓶中。
（5）将西林瓶放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。
（6）冻干程序参数设定：
预冻设置为：
第一阶段预冻温度在40min内达到0℃，保持1h；
第二阶段预冻温度在50min内达到-45℃，保持5h。
升华干燥包括：
第一阶段升华干燥温度在40min内达到-40℃，保持2h，真空度为10Pa；
第二阶段升华干燥温度在50min内达到-35℃，保持17h，真空度为10Pa。
解析干燥包括：
第一阶段解析干燥温度在40min内达到20℃，保持2h，真空度为极限真空；
第二阶段解析干燥温度在50min内达到25℃，保持6h，真空度为极限真空。
（7）冻干结束后，冲入氮气，箱内压塞，环境的温度和湿度达到要求后，打开冻干机箱门，取出核酸检测西林瓶冻干制剂反应管。
（8）观察冻干制剂的外观是否合格。
（9）利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量。（利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量为2.24%）
（10）将核酸检测西林瓶密封处理。
（11）使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的肺炎克雷伯菌核酸检测试剂盒进行冷冻干燥的西林瓶冻干制剂成品如附图4所示。
实施例4
在本实施例中，提供了一种适用于RNA检测试剂盒冻干的冻干保护剂及一种冻干方法，制备成8联PCR反应管冻干制剂。使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）进行冷冻干燥。所优化的保护剂和赋形剂混合液包括：20%海藻糖、15%甘露醇、5%甘氨酸、3mg/mL牛血清白蛋白、6%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、0.5%Tween20、0.1%SE-15、100mmol/mL Tris-HCl以及焦磷酸二乙酯处理过的水。
具体步骤如下：
（1）配制优化后的冻干保护剂混合液。
（2）根据新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）说明书配制核酸检测PCR反应试剂混合液。
（3）将优化后的冻干保护剂混合液和配制好的新型冠状病毒2019-nCoV核酸扩增PCR反应试剂混合液按3.5:16.5的比例混匀。
（4）将混匀后的液体试剂利用精确分液系统分装到8联PCR反应管中。
（5）将8联PCR反应管放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。
（6）冻干程序参数设定：
预冻设置为：
第一阶段预冻温度在40min内达到4℃，保持0.5h；
第二阶段预冻温度在30min内达到-45℃，保持3h。
升华干燥包括：
第一阶段升华干燥温度在40min内达到-35℃，保持1h，真空度为10Pa；
第二阶段升华干燥温度在30min内达到-30℃，保持10h，真空度为10Pa。
解析干燥包括：
第一阶段解析干燥温度在40min内达到20℃，保持1h，真空度为极限真空；
第二阶段解析干燥温度在30min内达到30℃，保持5h，真空度为极限真空。
（7）冻干结束后，冲入氮气，箱内压塞，环境的温度和湿度达到要求后，打开冻干机箱门，取出核酸扩增8联PCR反应管冻干制剂。
（8）观察冻干制剂的外观是否合格。
（9）利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量。（利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量为1.74%）。
（10）将核酸扩增8联PCR反应管冻干制剂和干燥剂一起放入铝箔袋中进行抽真空密封。
实施例5
在本实施例中，提供了一种适用于RNA检测试剂盒冻干的冻干保护剂及一种冻干方法，在预冻阶段加入退火操作，制备成8联PCR反应管冻干制剂。使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）进行冷冻干燥。所优化的保护剂混合液包括：20%海藻糖、15%甘露醇、5%甘氨酸、3mg/mL牛血清白蛋白、6%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、0.5%Tween20、0.1%SE-15、100mmol/mLTris-HCl以及焦磷酸二乙酯处理过的水。
具体步骤如下：
（1）配制优化后的冻干保护剂混合液。
（2）根据新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）说明书配制核酸检测PCR反应试剂混合液。
（3）将优化后的冻干保护剂混合液和配制好的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测PCR反应试剂混合液按3.5:16.5的比例混匀。
（4）将混匀后的液体试剂利用精确分液系统分装到8联PCR反应管中。
（5）将8联PCR反应管放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。
（6）冻干程序参数设定：
预冻设置为：
第一阶段预冻温度在40min内达到4℃，保持0.5h；
第二阶段预冻温度在30min内达到-45℃，保持2h；
第三阶段预冻温度（退火操作）在30min内达到-30℃，保持1h；
第四阶段预冻温度在40min内达到-45℃，保持3h。
升华干燥包括：
第一阶段导油温度在40min内达到-35℃，保持1h，真空度为10Pa；
第二阶段导油温度在30min内达到-30℃，保持8h，真空度为10Pa。
解析干燥包括：
第一阶段导油温度在40min内达到20℃，保持1h，真空度为极限真空；
第二阶段导油温度在30min内达到30℃，保持5h，真空度为极限真空。
（7）冻干结束后，冲入氮气，箱内压塞，环境的温度和湿度达到要求后，打开冻干机箱门，取出核酸检测8联PCR反应管冻干制剂。
（8）观察冻干制剂的外观是否合格。
（9）利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量。（利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量为1.68%）
（10）将核酸检测8联PCR反应管冻干制剂和干燥剂一起放入铝箔袋中进行抽真空密封。
（11）高温加速稳定性测试。
新型冠状病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）进行冷冻干燥的8联PCR反应管冻干制剂成品在45℃条件下放置3个月时与液体新型冠状病毒核酸检测试剂盒相比性能差异不大，冻干制剂成品在45℃条件下放置3个月时的加速稳定性PCR扩增曲线图如附图5所示。
新型冠状病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）进行冷冻干燥的8联PCR反应管冻干制剂成品在37℃条件下放置6个月时与液体新型冠状病毒核酸检测试剂盒相比性能差异不大，冻干制剂成品在37℃条件下放置6个月时的加速稳定性PCR扩增曲线图如附图6所示。
实施例6
在本实施例中，提供了一种适用于RNA检测试剂盒冻干的冻干保护剂及一种冻干方法，制备成西林瓶冻干制剂。使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）进行冷冻干燥。所优化的保护剂混合液包括：20%海藻糖、15%甘露醇、5%甘氨酸、3mg/mL牛血清白蛋白、6%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、0.5%Tween20、0.1%SE-15、100mmol/mLTris-HCl以及焦磷酸二乙酯处理过的水。
具体步骤如下：
（1）配制优化后的冻干保护剂混合液。
（2）根据新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR荧光法）说明书配制核酸检测PCR反应试剂混合液。
（3）将优化后的冻干保护剂混合液和配制好的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测PCR反应试剂混合液按3.5:16.5的比例混匀。
（4）将混匀后的液体试剂利用精确分液系统分装到西林瓶中。
（5）将西林瓶放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。
（6）冻干程序参数设定：
预冻设置为：
第一阶段预冻温度在40min内达到0℃，保持1h；
第二阶段预冻温度在50min内达到-45℃，保持3h。
升华干燥设置为：
第一阶段升华干燥温度在40min内达到-40℃，保持2h，真空度为10 Pa；
第二阶段升华干燥温度在50min内达到-35℃，保持17h，真空度为10Pa。
解析干燥设置为：
第一阶段解析干燥温度在40min内达到20℃，保持2h，真空度为极限真空；
第二阶段解析干燥温度在50min内达到25℃，保持6h，真空度为极限真空。
（7）冻干结束后，冲入氮气，箱内压塞，环境的温度和湿度达到要求后，打开冻干机箱门，取出核酸检测西林瓶冻干制剂反应管。
（8）观察冻干制剂的外观是否合格。
（9）利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量。（利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量为2.47%）
（10）将核酸检测西林瓶冻干制剂密封处理。
（11）西林瓶冻干制剂复溶后冻融次数测试
新型冠状病毒核酸检测西林瓶冻干制剂复溶后进行冻融次数测试，冻融10次时的制剂性能与液体新型冠状病毒核酸检测盒相比较差异不大，冻融10次时的PCR扩增曲线图7所示。
实施例7
在本实施例中，提供了一种适用于RNA检测试剂盒冻干的冻干保护剂及一种冻干方法，在预冻阶段加入退火操作，制备成西林瓶冻干制剂。使用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（货号为：JC10202N）进行冷冻干燥。所优化的保护剂 混合液包括：25%海藻糖、12%甘露醇、4%甘氨酸、3mg/mL牛血清白蛋白、8%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、0.5%Tween20、0.1%SE-15、100mmol/mL Tris-HCl以及焦磷酸二乙酯处理过水。
具体步骤如下：
（1）配制优化后的冻干保护剂混合液。
（2）根据甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）说明书配制核酸检测PCR反应试剂混合液。
（3）将优化后的冻干保护剂混合液和配制好的甲型/乙型流感病毒核酸检测PCR反应试剂混合液按3.5:16.5的比例混匀。
（4）将混匀后的液体试剂利用精确分液系统分装到西林瓶中。
（5）将西林瓶放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥。
（6）冻干程序参数设定：
预冻设置为：
第一阶段预冻温度在40min内达到0℃，保持1h；
第二阶段预冻温度在50min内达到-45℃，保持3h。
第三阶段预冻温度（退火操作）在40min内达到-30℃，保持1h；
第四阶段预冻温度在50min内达到-45℃，保持4h。
升华干燥设置为：
第一阶段升华干燥温度在40min内达到-40℃，保持1h，真空度为10 Pa；
第二阶段升华干燥温度在50min内达到-35℃，保持15h，真空度为10Pa。
解析干燥设置为：
第一阶段解析干燥温度在40min内达到20℃，保持1h，真空度为极限真空；
第二阶段解析干燥温度在50min内达到25℃，保持5h，真空度为极限真空。
（7）冻干结束后，冲入氮气，箱内压塞，环境的温度和湿度达到要求后，打开冻干机箱门，取出核酸检测西林瓶冻干制剂。
（8）观察冻干制剂的外观是否合格。
（9）利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量。（利用卡式水分测定仪测定冻干制剂的水分含量为2.41%）
（10）将核酸检测西林瓶冻干制剂进行密封处理。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。