阅读说明：本技术 一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法 (Research method for inducing damage of hamster ovary cells by heavy metal uranium ) 是由 尹晶晶 李建国 潘泽轩 高洁 黄立群 刘欢 秦秀军 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明属于辐射防护技术领域,涉及一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法。所述的研究方法依次包括如下步骤：(1)建立重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤模型；(2)分别提取正常仓鼠卵巢细胞RNA和步骤(1)所得损伤模型的仓鼠卵巢细胞RNA；(3)对正常仓鼠卵巢细胞RNA和损伤模型的仓鼠卵巢细胞RNA分别进行转录组测序；(4)对正常仓鼠卵巢细胞和损伤模型的仓鼠卵巢细胞进行转录水平差异比较分析,筛选出差异表达基因；(5)进行差异表达基因的功能富集分析。利用本发明的研究方法,能够筛选出重金属铀致仓鼠卵巢细胞损伤相关基因,并对差异表达基因进行功能富集分析,为重金属铀致仓鼠卵巢细胞损伤作用机制研究提供分子水平的实验数据。(The invention belongs to the technical field of radiation protection, and relates to a research method for inducing damage of hamster ovary cells by heavy metal uranium. The research method sequentially comprises the following steps: (1) establishing a heavy metal uranium-induced hamster ovary cell damage model; (2) extracting RNA of normal hamster ovary cells and RNA of hamster ovary cells of the damage model obtained in the step (1) respectively; (3) performing transcriptome sequencing on normal hamster ovary cell RNA and hamster ovary cell RNA of an injury model respectively; (4) carrying out comparative analysis on difference of transcription levels of normal hamster ovary cells and hamster ovary cells of an injury model, and screening out a differential expression gene; (5) and performing functional enrichment analysis on the differentially expressed genes. By utilizing the research method, the genes related to the damage of the heavy metal uranium caused hamster ovary cells can be screened out, the function enrichment analysis is carried out on the differentially expressed genes, and the experimental data of the molecular level is provided for the research on the mechanism of the damage of the heavy metal uranium caused hamster ovary cells.)

一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法

技术领域

本发明属于辐射防护技术领域，涉及一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法。

背景技术

铀作为重金属元素，具有很强的重金属毒性和放射性毒性。铀在自然界中主要以化合物形式存在，其可溶态易被生物吸收，并沿着食物链进入人体，对人体造成内辐射，严重危害人体健康。

已有很多研究报道了铀的化学毒性，但铀对哺乳动物的生殖毒性却较少关注。重金属铀的生殖发育毒性主要基于其化学毒性而非放射毒性。

仓鼠卵巢细胞是实验中常用的细胞株，培养条件简单，贴壁强度适中，因此采用仓鼠卵巢细胞可建立可靠的细胞模型。

转录组测序技术是最新发展起来的利用高通量测序平台进行转录组分析的技术，已成为研究转录组学的重要手段之一。该技术可全面快速地获得特定细胞或组织在某一状态下几乎所有转录本的序列信息和表达信息，包括编码蛋白的mRNA和各种非编码RNA，基因选择性剪接产生的不同转录本的表达丰度等。转录组测序的优势在于不需要知道目标物种的基因信息，即可对任意物种的转录组进行分析，检测通量高，检测范围广。

发明内容

本发明的目的是提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，以能够筛选出重金属铀致仓鼠卵巢细胞损伤相关基因，并对差异表达基因进行功能富集分析，为重金属铀致仓鼠卵巢细胞损伤作用机制研究提供分子水平的实验数据。

为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，所述的研究方法依次包括如下步骤：

(1)建立重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤模型；

(2)分别提取正常仓鼠卵巢细胞RNA和步骤(1)所得损伤模型的仓鼠卵巢细胞RNA；

(3)对正常仓鼠卵巢细胞RNA和损伤模型的仓鼠卵巢细胞RNA分别进行转录组测序；

(4)对正常仓鼠卵巢细胞和损伤模型的仓鼠卵巢细胞进行转录水平差异比较分析，筛选出差异表达基因；

(5)进行差异表达基因的功能富集分析。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，其中步骤(1)中，用50-1000μmol/L重金属铀染毒4-48h建立仓鼠卵巢细胞损伤模型。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，其中步骤(2)中，RNA的提取使用RNA提取试剂盒，并参照RNA提取试剂盒的使用方法进行提取；对提取的RNA进行质量检测(包括浓度和质量)。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，其中步骤(3)中，对提取的仓鼠卵巢细胞RNA，先去除核糖体RNA，将RNA片段化，然后逆转录合成cDNA，再进行末端修复，加A尾，加接头，最后PCR扩增后进行测序。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，其中步骤(4)中，差异表达基因的筛选采用DESeq软件进行标准化处理，计算差异倍数，并采用负二项分布检验的方式进行差异显著性检验，差异筛选条件为P<0.05并且差异倍数大于2。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，其中步骤(5)中，采用GO和KEGG对差异表达基因进行功能富集分析。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，其中GO功能富集分析是将全部基因作为背景，差异表达基因作为背景列表中筛选出的候选列表，利用超几何分布检验计算富集显著性，使用fisher算法对差异表达基因进行生物学过程、细胞组分和分子功能富集分析。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，其中KEGG功能富集分析是利用KEGG数据库对差异表达的基因进行通路分析，并采用超几何分布检验的方法计算每个通路中差异基因富集的显著性。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，其中所述的研究方法在步骤(5)后还包括如下步骤：

(6)选取差异表达显著的基因，验证转录组测序数据的可靠性。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，其中步骤(6)中，选取差异表达显著的基因，采用实时荧光定量PCR技术进行检测，并与转录组测序数据中该基因的表达趋势比较，验证转录组测序数据的可靠性。

本发明的有益效果在于，利用本发明的重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法，能够筛选出重金属铀致仓鼠卵巢细胞损伤相关基因，并对差异表达基因进行功能富集分析，为重金属铀致仓鼠卵巢细胞损伤作用机制研究提供分子水平的实验数据。

附图说明

图1为示例性的本发明的重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法的流程图。

图2为实施例1中转录组cDNA文库构建及测序流程图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。

实施例1：

示例性的本发明的重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤的研究方法的流程如图1所示，包括如下步骤：

1、建立重金属铀诱导仓鼠卵巢细胞损伤模型

采用500μmol/L重金属铀染毒24h建立仓鼠卵巢细胞损伤模型。

2、分别提取正常仓鼠卵巢细胞RNA和损伤模型的仓鼠卵巢细胞RNA

按照RNA提取试剂盒方法，分别提取正常仓鼠卵巢细胞RNA和损伤模型的仓鼠卵巢细胞RNA，并对提取RNA的浓度和质量进行检测，检测结果显示RNA浓度和质量符合实验要求。

3、对正常仓鼠卵巢细胞RNA和损伤模型的仓鼠卵巢细胞RNA分别进行转录组测序

对提取的仓鼠卵巢细胞RNA，先去除核糖体RNA，将RNA片段化，然后逆转录合成cDNA，再进行末端修复，加A尾，加接头，最后PCR扩增后进行测序(参见图2)。

4、对正常仓鼠卵巢细胞和损伤模型的仓鼠卵巢细胞进行转录水平差异比较分析，筛选出差异表达基因

进行转录水平差异比较分析，筛选出差异表达基因。差异表达基因的筛选采用DESeq软件进行标准化处理，计算差异倍数，并采用负二项分布检验的方式进行差异显著性检验，差异筛选条件为P<0.05并且差异倍数大于2，筛选出差异表达基因2389条，其中上调表达1539条，下调表达850条。

5、进行差异表达基因的功能富集分析

差异表达基因的GO功能富集分析是将全部基因作为背景，差异表达基因作为背景列表中筛选出的候选列表，利用超几何分布检验计算富集显著性，使用fisher算法对差异表达基因进行生物学过程、细胞组分和分子功能富集分析，发现差异表达基因主要富集于免疫、氧化损伤和凋亡等过程。

差异表达基因的KEGG功能富集分析是利用KEGG数据库对差异表达的基因进行通路分析，并采用超几何分布检验的方法计算每个通路中差异基因富集的显著性，发现细胞免疫、氧化损伤和凋亡的信号通路发生差异表达。

6、选取差异表达显著的基因，验证转录组测序数据的可靠性

选取差异表达显著的基因，采用实时荧光定量PCR技术进行检测，并与转录组测序数据中该基因的表达趋势比较，验证转录组测序数据的可靠性，验证结果显示PCR扩增结果与测序结果是一致的。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。