盖裂果及其提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用
阅读说明：本技术 盖裂果及其提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用 (Application of dehiscent fruit and its extract in preparing medicine for resisting helicobacter pylori ) 是由 赵明 段金廒 徐明明 周俊飞 毕洪凯 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了盖裂果及其提取物在制备抗幽门螺杆菌的药物中的应用,本发明通过筛选实验发现,从盖裂果中分离的氮杂蒽醌benzo[g]isoquinoline-5,10-dione和/或氧杂蒽醌1-hydroxybenzoisochromanquinone,在体外的抑菌活性强于阳性药甲硝唑和左氧氟沙星,可用于制备抗幽门螺杆菌的药物。(Screening experiments show that the azaanthraquinone benzo [ g ] isoquinoline-5,10-dione and/or oxaanthraquinone 1-hydroxybenzoisohroman quinone separated from the dehiscent fruits have higher in vitro antibacterial activity than positive drugs metronidazole and levofloxacin and can be used for preparing the anti-helicobacter pylori drugs.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及盖裂果及其提取物氮杂蒽醌和氧杂蒽醌在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
背景技术
幽门螺杆菌Helicobacter pylori(Hp)是一种螺旋状、微需氧型的革兰阴性杆菌，定植于胃黏膜起致病作用，与慢性活动性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、胃癌等多种消化系统疾病密切相关。Hp在全球自然人群的感染率超过50％，不同国家感染率有差异，发展中国家明显高于发达国家。根据最新荟萃分析，Hp在我国人群的感染率高达55.82％，感染人数接近8亿人，并且每年以0.5％-1％的速度递增。2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单显示，Hp属于I类致癌物，可诱发胃癌和淋巴增生性胃淋巴瘤等肿瘤的发生。目前，临床上Hp感染的治疗方案是三联或四联疗法，即同时服用质子泵抑制剂(奥美拉唑等)加两种抗生素(克拉霉素、阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)或铋剂(枸橼酸铋钾等)加质子泵抑制剂(奥美拉唑等)再加两种抗生素(克拉霉素、阿莫西林、四环素、甲硝唑等选二种)。但随着抗生素的长期使用，Hp对抗生素产生不同程度的耐药，导致相关的根除疗法根除率显著下降，远不能达到临床要求。据报道，Hp对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、利福平、阿莫西林、四环素的耐药率分别为63.4％、52.6％、54.8％、18.2％、4.4％、7.3％，相关药物治愈效果不显著，因此亟待研究发现具有高效、安全的抗Hp新药物。
盖裂果Mitracarpus hirtus(L.)DC(MH)是茜草科盖裂果属植物，广泛分布于热带国家。盖裂果在西非传统医学用于治疗牙痛、闭经、消化不良、肝病、性病、喉咙痛、皮肤病、外科伤口、麻风病以及头痛等神经系统疾病，也被作为箭毒的解毒剂。现代研究表明，MH具有较好的抗细菌及真菌作用，但未见其在幽门螺杆菌方面的报道研究。本发明研究发现盖裂果提取物对幽门螺杆菌具有较好的抑制作用，通过活性追踪分离发现盖裂果中抗幽门螺杆菌的主要功效物质是benzo[g]isoquinoline-5,10-dione(1)和1-hydroxybenzoisochromanquinone(2)，在体外的抑菌活性强于阳性药甲硝唑和左氧氟沙星。
发明内容
本发明的目的是提供盖裂果及其提取物氮杂蒽醌和氧杂蒽醌在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用价值，本发明另外一个目的是提供氮杂蒽醌和氧杂蒽醌的制备方法。
技术方案：本发明从植物盖裂果中分离得到一种氮杂蒽醌(benzo[g]isoquinoline-5,10-dione)和氧杂蒽醌(1-hydroxybenzoisochrom-anquinone)，提供了这类化合物的制备方法。
本发明通过实验发现，氮杂蒽醌和氧杂蒽醌对耐药性和敏感性幽门螺杆菌均有较强的抑制作用，在体外的抑菌活性强于阳性药甲硝唑和左氧氟沙星，可用于制备抗幽门螺杆菌的药物。
本发明的化合物结构式：
所述的氮杂蒽醌和氧杂蒽醌是通过以下方法制备得到的：
(1)称取盖裂果药材，粉碎，加乙醇或甲醇水溶液室温浸泡药材，过滤后收集滤液，通过减压浓缩至无醇味，得盖裂果浓缩液；
(2)将步骤(1)中得到的盖裂果浓缩液，用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取部位，减压浓缩，得乙酸乙酯部位；
(3)将步骤(2)中得到取乙酸乙酯部位，上硅胶柱，并用不同体积比的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂洗脱；
(4)将步骤(3)中得到的体积比为85:15石油醚：乙酸乙酯混合溶剂洗脱流分Fr.2，经MCI反相中压制备梯度洗脱，收集6.3-6.9BV和8.1-8.7BV的流出液；将6.3-6.9BV流出液经制备型高效液相色谱制得氧杂蒽醌1-hydroxybenzoisochromanquinone；8.1-8.7BV流出液经制备型高效液相色谱制得氮杂蒽醌benzo[g]isoquinoline-5,10-dione；
作为优选方案，本发明提供的氮杂蒽醌和氧杂蒽醌的制备方法是按照下述步骤进行的：
(1)称取盖裂果Mitracarpus hirtus L.(MH)药材2.83kg，粉碎，取10倍药材重量，浓度为70-80％乙醇或甲醇水溶液室温浸泡药材，浸泡三次，每次2-3小时，过滤后收集滤液，通过减压浓缩至无醇味，得MH浓缩液；
(2)将步骤(1)中得到的药液用等体积的乙酸乙酯萃取，萃四次，合并萃后的乙酸乙酯部位，减压浓缩，得乙酸乙酯部位。
(3)将步骤(2)中得到取乙酸乙酯部位，按样品：硅胶＝1:1.2拌样，2倍量硅胶装负压柱(30.0cm×9.5cm)，柱体积500mL，并用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂洗脱。采用石油醚：乙酸乙酯＝95:5的混合溶剂洗脱5个柱体积，得到流分Fr.1；采用石油醚：乙酸乙酯＝85:15的混合溶剂洗脱4个柱体积，得到流分Fr.2；采用石油醚：乙酸乙酯＝70:30的混合溶剂洗脱5个柱体积，得到流分Fr.3；采用石油醚：乙酸乙酯＝60:40的混合溶剂洗脱6个柱体积，得到流分Fr.4；采用石油醚：乙酸乙酯＝30:70的混合溶剂洗脱6个柱体积，得到流分Fr.5；采用乙酸乙酯洗脱4个柱体积，得到流分Fr.6。
(4)将步骤(3)中得到的流分Fr.2经MCI(MCI粒径为75-150μm，3.0cm×60.0cm，柱体积为400mL)反相中压制备梯度洗脱，收集6.3-6.9BV和8.1-8.7BV的流出液；6.3-6.9BV的流出液经制备型高效液相色谱制得1-hydroxybenzoisochromanquinone；8.1-8.7BV流出液经制备型高效液相色谱制得benzo[g]isoquinoline-5,10-dione。
优选地，步骤(4)中所述benzo[g]isoquinoline-5,10-dione和1-hydroxybenzoisochromanquinone中压制备色谱的制备条件为：以纯水(A)-甲醇(B)为流动相梯度洗脱，洗脱梯度：0.01～10.00min，30％-30％B；10.00～25.00min，40％-40％B；25.00～40.00min，50％-50％B；40.00～60.00min，60％-60％B；60.00～80.00min，70％-70％B；80.00～100.00min，80％-80％B；100.00～120.00min，90％-90％B；120.00～130.00min，0％-100％B；130.00～140.00min；在62-72min时间段收集1-hydroxybenzoisochromanquinone储备液，95-104min时间段收集benzo[g]isoquinoline-5,10-dione储备液。benzo[g]isoquinoline-5,10-dione储备液再经制备型高效液相色谱得到单体化合物(H2O:MeOH＝32:68)，1-hydroxybenzoisochromanquinone储备液再经制备型高效液相色谱得到单体化合物(H2O:MeOH＝55:45)；检测波长均为250nm和310nm。
一种药物组合物，该药物组合物包含盖裂果提取物或氮杂蒽醌(benzo[g]isoquinoline-5,10-dione)和氧杂蒽醌(1-hydroxybenzoisochrom-anquinone)与药学上可以接受的辅料。所述的药学上可接受的辅料选自淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、植物油、维晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮、羟甲基淀粉钠、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、维粉硅胶、葡萄糖、甘露醇和木糖醇中的一种或多种。
一种药物制剂，将上述的药物组合物与药学上可以接受的辅料制成颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、滴剂、口服液、气雾剂、滴鼻剂或注射剂的形式。
有益效果：
(1)本发明在于提供一种具有抗幽门螺杆菌作用的氮杂蒽醌(benzo[g]isoquinoline-5,10-dione)和氧杂蒽醌(1-hydroxybenzoisochrom-anquinone)的制备方法。
(2)本发明通过大量实验筛选发现盖裂果提取物(氮杂蒽醌(benzo[g]isoquinoline-5,10-dione)和氧杂蒽醌(1-hydroxybenzoisochrom-anquinone)对幽门螺杆菌具有较好的抑制作用。
(3)本发明首次发现化合物benzo[g]isoquinoline-5,10-dione和1-hydroxybenzoisochromanquinone对耐药性和敏感性幽门螺杆菌均具有较强的抑制作用，在体外的抑菌活性强于阳性药甲硝唑和左氧氟沙星，为开发新型抗幽门螺杆菌药物。
具体实施方式
实施例1
1.仪器与材料
1.1仪器
1.2.实验材料
Hedera ODS制备色谱柱(10nm，5μm，10*250mm)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱；MCI GEL(CHP 20/P120)，MCI(CHP20,75-150μm)，凝胶为Sephadex LH-20，柱色谱硅胶(200～300目)；色谱级乙腈、甲醇和甲酸购自美国默克公司，分析级石油醚、乙酸乙酯等购自南京化学试剂有限公司。
2.实验方法
2.1盖裂果样品的制备
(1)称取盖裂果Mitracarpus hirtus L.(MH)药材2.83kg，粉碎，取10倍药材重量，浓度为70-80％乙醇或甲醇水溶液室温浸泡药材，浸泡三次，每次2-3小时，过滤后收集滤液，通过减压浓缩至无醇味，得MH浓缩液；
(2)将步骤(1)中得到的药液用等体积的乙酸乙酯萃取，萃四次，合并萃后的乙酸乙酯部位，减压浓缩，得乙酸乙酯部位。
(3)将步骤(2)中得到取乙酸乙酯部位，按样品：硅胶＝1:1.2拌样，2倍量硅胶装负压柱(30.0cm×9.5cm)，柱体积500mL，并用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂洗脱。采用石油醚：乙酸乙酯＝95:5的混合溶剂洗脱5个柱体积，得到流分Fr.1；采用石油醚：乙酸乙酯＝85:15的混合溶剂洗脱4个柱体积，得到流分Fr.2；采用石油醚：乙酸乙酯＝70:30的混合溶剂洗脱5个柱体积，得到流分Fr.3；采用石油醚：乙酸乙酯＝60:40的混合溶剂洗脱6个柱体积，得到流分Fr.4；采用石油醚：乙酸乙酯＝30:70的混合溶剂洗脱6个柱体积，得到流分Fr.5；采用乙酸乙酯洗脱4个柱体积，得到流分Fr.6。
(4)将步骤(3)中得到的流分Fr.2流分，经MCI反相中压制备(MCI粒径为75-150μm，3.0cm×60.0cm，柱体积为400mL)梯度洗脱，以甲醇-纯水为流动相洗脱，其中A为纯水，B为甲醇；洗脱梯度：0.01～10.00min，30％-30％B；10.00～25.00min，40％-40％B；25.00～40.00min，50％-50％B；40.00～60.00min，60％-60％B；60.00～80.00min，70％-70％B；80.00～100.00min，80％-80％B；100.00～120.00min，90％-90％B；120.00～130.00min，0％-100％B；130.00～140.00min。洗脱流速20mL/min，检测波长为250nm和310nm；经高效液相色谱分析后，采用旋转蒸发仪浓缩合并，得到8个流份Fr.2-1～Fr.2-8。
Fr.2-4(6.3-6.9BV的流出液)经C18制备型高效液相色谱(Hedera ODS,5μm,20×250mm)，以纯水(A)-甲醇(B)为流动相梯度洗脱，洗脱梯度：0.01～54.00min，60-75％，在35-39min时间段收集1-hydroxybenzoisochromanquinone；储备液再经制备型高效液相色谱得到单体化合物1-hydroxybenzoisochromanquinone(H2O:MeOH＝64:36)，高效液相色谱柱压9.8MPa，柱温22-26℃，进样量为120μL，流速5mL/min，检测波长为250nm和310nm。
Fr.2-6(8.1-8.7BV的流出液)经C18制备型高效液相色谱(Hedera ODS,5μm,20×250mm)，以纯水(A)-甲醇(B)为流动相梯度洗脱，洗脱梯度：0.01～60.00min，65-80％，在43-47min时间段收集benzo[g]isoquinoline-5,10-dione储备液；储备液再经制备型高效液相色谱得到单体化合物benzo[g]isoquinoline-5,10-dione(H2O:MeOH＝70:30)，高效液相色谱柱压9.8MPa，柱温22-26℃，进样量为120μL，流速5mL/min，检测波长为250nm和310nm。
化合物benzo[g]isoquinoline-5,10-dione和1-hydroxybenzoisochromanquinone的鉴定：经核磁共振及高分辨质谱分析鉴定化合物1为苯并[g]异喹啉-5,10-二酮，化合物2为1-羟基苯并异色蒽醌。化合物结构解析如下：
化合物1淡黄色粉末，HR-ESI-MS m/z:210.0541[M+H]+。1H-NMR(500MHz,Chloroform-d)δ:9.58(1H,s,H-1),9.11(1H,d,J＝5.0Hz,H-3),8.10(1H,d,J＝5.0Hz,H-4),8.33(2H,ddd,J＝9.0,7.6,4.1Hz,H-6,9),7.87(2H,m,H-7,8)。13C-NMR(125MHz,Chloroform-d)δ:155.3(C-1),149.7(C-3),119.3(C-4),126.5(C-4a),182.5(C-5),133.2(C-5a),135.3(C-6),127.5(C-7),127.6(C-8),134.8(C-9),133.2(C-9a),182.6(C-10),138.7(C-10a)。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物1为benzo[g]isoquinoline-5,10-dione。
化合物2淡黄色粉末，HR-ESI-MS m/z:213.0666[M+H]+。1H-NMR(500MHz,Chloroform-d)δ:5.39(1H,t,J＝3.6Hz,H-1),4.77(1H,dt,J＝18.5,3.1Hz,H-3a),4.63(1H,dt,J＝18.6,2.3Hz,H-3b),2.78(1H,dq,J＝18.7,3.3Hz,H-4a),2.66(1H,m,H-4b),7.69(2H,m,H-6,9),8.03(2H,m,H-7,8)。13C-NMR(125MHz,Chloroform-d)δ:90.5(C-1),57.8(C-3),28.2(C-4),139.7(C-4a),183.7(C-5),131.8(C-5a),141.5(C-6),126.2(C-7),126.5(C-8),133.9(C-9),132.0(C-9a),183.3(C-10),133.9(C-10a)。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物2为1-hydroxybenzoisochromanquinone。
实施例2抗幽门螺杆菌实验
1.材料
1.1样品
化合物1：benzo[g]isoquinoline-5,10-dione(纯度大于98％)和化合物:2：1-hydroxybenzoisochrom-anquinone(纯度大于98％)实验制备制备。
1.2菌株
幽门螺杆菌G27，Hp159和JRES00015由南京医科大学毕洪凯教授提供。
1.3试剂
培养基和主要试剂：哥伦比亚培养基、脑心浸液培养基、选择性抗生素(甲硝唑、左氧氟沙星、多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶)、血清、奥美拉唑、阿莫西林、克拉霉素、革兰氏染色液、细菌基因组DNA提取试剂盒、幽门螺杆菌特有CagA基因引物等。
2.方法与结果
2.1微量稀释法检测化合物1和2对幽门螺杆菌的最小抑菌浓度(MIC,100μL体系)
(1)配备化合物1和2样液浓度为2mg/mL。
(2)MIC板制备第一孔先加培养基173.6μL，再加6.4μL抗菌药物，倍比稀释至第7孔；第8孔不加药，保留90μL培养基，作为加菌不加药对照。
(3)菌液制备取固体平板上对数期生长的幽门螺杆菌用BHI培养基制作成菌悬液，调整浓度OD600为0.3(1×108CFU/mL)，稀释10倍，为1×107CFU/mL，备用。
(4)接种菌液取10μL加至第1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0×106CFU/mL)。培养72h判断结果。第1孔至第7孔药物浓度分别为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL。
(5)结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔第8孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。每个药物重复3次试验。
(6)结果：结果见表1。
表1.化合物1和2对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度(MIC:μg/mL)
菌株
G27
Hp159
JRES00015
化合物1
0.125
0.0625
0.0625
化合物2
0.125
0.125
0.0625
MTZ
2
16
16
CLR
0.008
2
2
LVX
0.25
8
16
MTZ：甲硝锉；CLR；克拉霉素；LVX：左氧氟沙星.
通过以上实验结果表明，化合物benzo[g]isoquinoline-5,10-dione和1-hydroxybenzoisochromanquinone对耐药性和敏感性幽门螺杆菌均具有较强的抑制作用，在体外的抑菌活性强于阳性药甲硝唑和左氧氟沙星，可开发新型抗幽门螺杆菌药物。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。