一种复方干粉吸入剂及其应用
阅读说明：本技术 一种复方干粉吸入剂及其应用 (Compound dry powder inhalant and application thereof ) 是由 刘志东 祁东利 彭辉 皮佳鑫 郭盼 邓秀平 李佳玮 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本申请提供了一种复方干粉吸入剂,包含黄芩苷、盐酸氨溴索、L-亮氨酸和磷酸盐,以复方干粉吸入剂的质量计,L-亮氨酸占0-50％,磷酸盐占15-35％,黄芩苷与盐酸氨溴索的总质量占15-85％,其中黄芩苷与盐酸氨溴索的质量比为1:(0.2-2)；所述复方干粉吸入剂的Dv90≤5μm。黄芩苷与盐酸氨溴索联合用药,可有效降低肺部组织的炎症和氧化损伤,缓解肺水肿和组织病理改变,减轻肺功能障碍和纤维化；复方干粉吸入剂通过肺部给药,明显提高药物在血浆中的半衰期和体内滞留时间,提高药物在肺组织中的生物利用度,降低药物在肺组织中的清除率,延长药物在肺部的滞留时间,有利于药物在肺组织中充分发挥作用。(The application provides a compound dry powder inhalant, which comprises baicalin, ambroxol hydrochloride, L-leucine and phosphate, wherein the L-leucine accounts for 0-50% of the mass of the compound dry powder inhalant, the phosphate accounts for 15-35% of the mass of the compound dry powder inhalant, and the total mass of the baicalin and the ambroxol hydrochloride accounts for 15-85%, wherein the mass ratio of the baicalin to the ambroxol hydrochloride is 1 (0.2-2); the Dv90 of the compound dry powder inhalant is less than or equal to 5 mu m. The combination of baicalin and ambroxol hydrochloride can effectively reduce the inflammation and the oxidative damage of lung tissues, relieve pulmonary edema and histopathological changes and relieve lung dysfunction and fibrosis; the compound dry powder inhalant is administrated through the lung, so that the half-life period and the in-vivo retention time of the medicine in plasma are obviously improved, the bioavailability of the medicine in lung tissues is improved, the clearance rate of the medicine in the lung tissues is reduced, the retention time of the medicine in the lung is prolonged, and the full play of the medicine in the lung tissues is facilitated.)
技术领域
本申请涉及制药技术领域，特别是涉及一种复方干粉吸入剂及其应用。
背景技术
特发性肺间质纤维化(IPF,idiopathic pulmonary fibrosis)是一种病因尚不明确，易发于中老年人的、慢性且不可逆发展的弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱，以细胞外基质异常沉积引起广泛的肺重构为特征，最终导致肺间质纤维化(PF,pulmonary fibrosis)的肺部疾病。大部分肺纤维化是病因不明，特发性肺纤维化的特征在于弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱，最终导致肺间质纤维化。IPF的发展包括肺损伤、炎症、肌成纤维细胞的形成和细胞外基质的积累，最终导致肺结构功能失调。其发病机制目前还不清楚，普遍认为炎症反应和氧化应激可能是参与IPF的起始和进展的重要因素。临床症状表现为发病隐匿，早期症状不明显，最初呈现为咳嗽、咳痰，后期呼吸困难加重，导致呼吸衰竭而死亡。IPF死亡率较高，被称为肿瘤样疾病。因为IPF易发于中老年人，随着各国人口的老龄化，在全球范围内，该疾病的发病率越来越高，世界IPF联合协会统计，大约有320万人患IPF，每年新增122万病例。
IPF临床指南提出的治疗方案表明肺移植是治疗IPF最直接有效的方法。然而，由于其成本高、供者少、技术风险较大，只有少数患者可以接受；临床用糖皮质激素联合免疫抑制剂和抗氧化剂进行治疗，但结果并不理想且出现多种毒副作用，故不推荐使用；在最新的指南中，化药尼达尼布和吡非尼酮被列为有条件推荐应用IPF临床治疗的药物。然而，长期服用会存在一些不良反应，如胃肠道不适、肝功能损害、皮肤过敏反应等。因此，在阐明肺纤维化的病理生理机制的同时，继续寻找疗效确切且安全有效的治疗药物和治疗手段迫在眉睫。
此外，目前临床防治IPF多以口服和静脉注射为主，口服给药存在胃肠道刺激以及肝脏首过效应，药物入血浓度低，导致生物利用度较低，疗效不明显；由于治疗周期较长，选用注射剂存在患者顺应性差、药物靶向性低、全身毒性大等不足。因此，如何提高药物的靶向性、生物利用度和达到多方面治疗效果成为医药科研工作者长期以来共同的努力目标。
发明内容
本申请在研究中发现，将黄芩苷(Baicalin，BA，分子式如式I所示)与盐酸氨溴索(Ambroxol Hydrochloride，AH，分子式如式II所示)联合用药，并制成干粉吸入剂(DPI)的剂型，采用肺部吸入的给药方式，能够通过降低炎症因子的表达、改善肺损伤和提高肺功能等方面达到改善和治疗肺纤维化的作用，并基于此完成了本申请。
本申请第一方面提供了一种复方干粉吸入剂，其包含黄芩苷、盐酸氨溴索、L-亮氨酸和磷酸盐，以所述复方干粉吸入剂的质量计，所述L-亮氨酸占0-50％，所述磷酸盐占15-35％，黄芩苷与盐酸氨溴索的总质量占15-85％，其中黄芩苷与盐酸氨溴索的质量比为1：(0.2-2)，优选为1：(0.8-1.2)；所述复方干粉吸入剂的Dv90≤5μm。
本申请第二方面提供了本申请第一方面所提供的复方干粉吸入剂在制备治疗肺间质纤维化的药物中的用途。
本申请提供了一种复方干粉吸入剂及其制备治疗肺间质纤维化的药物中的用途，其中黄芩苷与盐酸氨溴索联合用药，可有效降低肺部组织的炎症和氧化损伤，缓解肺水肿和组织病理改变，减轻肺功能障碍和肺纤维化。进一步地，采用复方干粉吸入剂，通过肺部给药，不仅明显提高了药物在血浆中的半衰期和体内滞留时间，而且还提高了药物在肺组织中的生物利用度，有效降低了药物在肺组织中的清除率，延长了药物在肺部的滞留时间，有利于药物在肺组织中充分发挥作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。
图1为不同配比BA/AH-DPI干粉微粒的水分含量图。
图2为不同配比BA/AH-DPI干粉微粒的水分曲线图。
图3为BA、AH和L-leu原料扫描电镜图。
图4为不同配比BA/AH-DPI干粉微粒扫描电镜图。
图5为BA、AH、L-Leu原料和7种不同配比BA/AH-DPI干粉微粒的粒径分布图。
图6为AH、BA、L-leu、物理混合物及实施例4的BA/AH-DPI干粉的DSC分析图谱。
图7为AH、BA、L-leu及其物理混合物的XRD示意图。
图8为不同配比的BA/AH-DPI干粉微粒的XRD示意图。
图9A为不同配比的BA/AH-DPI干粉中BA的FPF对比图。
图9B为不同配比的BA/AH-DPI干粉中AH的FPF对比图。
图10A显示了不同配比BA/AH-DPI干粉中BA在NGI各层级的沉积率。
图10B显示了不同配比BA/AH-DPI干粉中AH在NGI各层级的沉积率。
图11显示了各组大鼠在1、7、14、21、28天时间内的体重变化。
图12显示了各组大鼠在28天后的肺系数。
图13显示了各组大鼠肺组织HE染色结果。
图14显示了各组大鼠肺泡灌洗液中总蛋白浓度结果图。
图15显示了8组大鼠BALF中炎症因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β水平表达。
图16显示了大鼠肺组织中SOD、MDA、LDH和Hyp的表达情况。
图17显示了各组大鼠血清中MPO的含量对比结果。
图18为血浆中BA的浓度曲线(ng/mL，Mean±SD，n＝6)
图19为血浆中AH的浓度曲线(ng/mL，Mean±SD，n＝6)
图20为肺组织匀浆中BA的浓度曲线(ng/mL，Mean±SD，n＝6)
图21为肺组织匀浆中AH的浓度曲线(ng/mL，Mean±SD，n＝6)
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案、及优点更加清楚明白，以下参照附图并举实施例，对本申请进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员基于本申请中的实施例所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请第一方面提供了一种复方干粉吸入剂(BA/AH-DPI)，其包含黄芩苷、盐酸氨溴索、L-亮氨酸和磷酸盐，以所述复方干粉吸入剂的质量计，所述L-亮氨酸占0-50％，所述磷酸盐占15-35％，黄芩苷与盐酸氨溴索的总质量占15-85％，其中黄芩苷与盐酸氨溴索的质量比为1：(0.2-2)，优选为1：(0.8-1.2)；所述复方干粉吸入剂的Dv90≤5μm。
发明人在研究中发现，采用黄芩苷与盐酸氨溴索联合用药，可以有效有效降低肺部组织的炎症和氧化损伤，缓解肺水肿和组织病理改变，减轻肺功能障碍和纤维化，进一步地，本申请以L-亮氨酸(L-leu)作为DPI载体，有利于改善粉体的流动性和气溶胶性能，进一步，发明人还发现，L-亮氨酸作为DPI载体还具有防潮、提高分散性以及可制造性的等优势。
在本申请第一方面的一些实施方式中，以所述复方干粉吸入剂的质量计，所述L-亮氨酸占10-40％。
在本申请第一方面的一些实施方式中，以所述复方干粉吸入剂的质量计，所述L-亮氨酸占15-25％。
发明人发现，当L-亮氨酸的含量在上述优选的范围内时，有利于进一步提高干粉吸入剂的颗粒均匀度以及雾化性能。
在本申请第一方面的一些实施方式中，以所述复方干粉吸入剂的质量计，BA和AH的总含量为15％-85％，优选40％-60％。
本申请中，所述复方干粉吸入剂在制备过程中以PBS(磷酸缓冲盐液)为溶剂，获得的方法干粉吸入剂中包含磷酸盐，以所述复方干粉吸入剂的质量计，所述磷酸盐的含量为15-35％。
本申请中所述的PBS溶液为本领域常用的PBS缓冲液，本领域技术人员可根据现有配方配制，所述PBS溶液中通常包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，因此本申请所述的磷酸盐可以包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的混合。
在不损害本申请的效果的范围内，可以另外包含不可避免的杂质。
在本申请第一方面的一些实施方式中，所述的复方干粉吸入剂Dv90≤3μm。
在本申请第一方面的一些实施方式中，所述黄芩苷的微细粒子分数为30-60％；所述盐酸氨溴索的微细粒子分数为25-50％。
在本申请第一方面的一些实施方式中，所述黄芩苷的质量中间空气动力学粒径为2-3.5μm；所述盐酸氨溴索的质量中间空气动力学粒径为2-3.5μm。
在本申请第一方面的一些实施方式中，以所述复方干粉吸入剂的质量计，水分含量低于7％。
在本申请第一方面的一些实施方式中，所述的复方干粉吸入剂采用喷雾干燥法制备。
在本申请第一方面的一些实施方式中，所述喷雾干燥法包括进口温度75-85℃，空气流量80-120L/min，泵速20-25％，喷雾速率50-70％，内部压强30-35Mbar。
发明人发现，采用本申请的方法制备的复方干粉吸入剂，有利于降低粉末内聚力，以改善药物颗粒流动和雾化性能，并确保药物和辅料气溶胶性能的一致性。
本申请第二方面提供了本申请第一方面所提供的复方干粉吸入剂在制备治疗特发性肺纤维化的药物中的用途。
发明人在研究中发现，本申请的复方干粉吸入剂中，黄芩苷与盐酸氨溴索联合用药，可有效降低肺部组织的炎症和氧化损伤，缓解肺水肿和组织病理改变，减轻肺功能障碍和纤维化，因此可以用于治疗特发性肺纤维化，进一步地，可用于制备治疗特发性肺纤维化的药物。
复方干粉吸入剂的制备实施例
采用B-90纳米喷雾干燥机生产复方干粉吸入剂。分别配置具有不同质量含量的黄芩苷、盐酸氨溴索和L-亮氨酸的PBS溶液作为进料溶液，其中，各实施例中，进料溶液组成配比如下表1所示，各进料溶液在相同参数下喷雾干燥：进口温度80℃，空气流量100L·min-1，泵速23％，喷雾速率60％，内部压强34Mbar。喷雾干燥结束后，在常温干燥环境中收集DPI干粉，称重密封后保存在常温干燥器中。
表1
复方干粉吸入剂质量评价
成分含量测定
称定实施例1-7制备的不同L-leu配方比例干粉约10mg，置于25mL容量瓶中并用甲醇定容稀释至刻度，摇匀，作为供试品。采用高效液相色谱进行含量测定分析，对不同配比BA/AH-DPI干粉中载药量进行计算。得到实施例1-7中不同配比的BA/AH-DPI干粉的载药量如表2所示。
BA对照品储备液的配制：精密称量BA对照品8.46mg，置于25mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，浓度为338.4μg/mL，4℃冷藏保存。
AH对照品储备液的配制：精密称量AH对照品8.73mg，置于25mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，浓度为349.2μg/mL，4℃冷藏保存。
标准品溶液的配制：精密量取BA和AH对照品储备液2mL置于10mL容量瓶中，甲醇溶液定容稀释至刻度，摇匀，4℃冷藏保存。制成每1ml中含有BA 67.68μg/ml，AH 69.84μg/mL的标准品溶液。
计算方法如下：
载药量＝(供试品峰面积/标准品峰面积)*标准品浓度*25ml/干粉称重质量
表2不同配比BA/AH-DPI干粉中BA和AH的含量(Mean±SD，n＝3)
从表中可以看出，在剂量范围内符合用药的要求。此外，由于本申请采用PBS作为溶剂，喷雾干燥后干粉中会存在一定量磷酸盐，本申请实施例制备的BA/AH-DPI干粉中，磷酸盐的含量约为15％-35％。
收率测定
收率(％)＝喷干粉质量-喷干PBS干粉的量/总质量
喷干粉质量：按照实施例1-7的方法，以500mL PBS制备不同配方比例的DPI干粉的质量；
喷干PBS干粉质量：500mL PBS溶液喷干后所得质量；
总质量：加入BA、AH、L-亮氨酸的质量和配制500mL PBS溶液中所加入各成分质量之和。
经过喷雾干燥法制备的BA/AH-DPI的收率结果如下表3所示，不同配方比例DPI微粒的收率在75％-85％之间，满足DPI微粉要求。
表3不同配方比例喷雾干粉收率表
水分测定
采用热重分析仪(TGA)分别测定实施例1-7的不同配比BA/AH-DPI干粉中的水分，根据微粉损失的总量计算微粉中得水分。不同配方比例的BA/AH-DPI干粉样品的水分测定结果如表4所示，水分趋势图如图1和图2所示。
表4不同L-leu比例处方的水分数据(Mean±SD，n＝3)
由表4可知，不同配方比例的BA/AH-DPI微粒测得其水分含量均低于7.0％。从图1和图2中可以得出随着L-leu的加入，水分含量逐渐降低，说明与L-leu共同喷雾干燥所得微粒可以减少其所含水分，以防止水分影响。
微粒形态观察
采用扫描电子显微镜(SEM)分别检测BA、AH、L-Leu原料及不同配比BA/AH-DPI干粉的表面形貌，将样品粉末均匀固定在导电胶带上，在离子溅射仪上喷涂30s，然后放置在SEM上观察和采集图像，图像采集电压为10kV。BA、AH、L-leu原料的SEM图像结果如图3所示，其中a-1和a-2图为不同放大倍数下BA的SEM图像，b-1和b-2图为不同放大倍数下AH的SEM图像，c-1和c-2图为不同放大倍数下L-leu的SEM图像；实施例1-7的不同配方比例的BA/AH-DPI干粉中微粒的SEM图像结果如图4所示，其中A-1和A-2图为不同放大倍数下L-leu含量为0％的BA/AH-DPI微粒SEM图像，相应地B-G图分别为L-leu含量为10％、15％、20％、25％、40％、50％的BA/AH-DPI在不同放大倍数下的微粒SEM图像。
由图3的结果可知，BA、AH和L-leu原料具有不规则、条状、非球形的形态，而图4中的不同配比BA/AH-DPI干粉呈单分散粒径范围，不规则折叠絮凝、表面粗糙、褶皱形态的球形形态微粒，与文献报道一致。从图4中还可以看出，L-leu含量在10％-40％之间所得出的BA/AH-DPI表面褶皱形态较好且呈大小均一球形。
不限于任何理论，发明人分析认为，由于L-leu的Péclet数(Pe)较高，在喷雾干燥得到的DPI微粒表面形成疏水层，导致波纹微粒的形成，增加了BA/AH-DPI微粒的表面粗糙度，降低了微粒表面能，这是正是由于L-leu在微粒表面富集的结果。
粒径分布测试
使用激光粒度分析仪通过干分散法测量DPI干粉的粒度分布，分别测定其Dv10、Dv50、Dv90、VMD(Volume median diameter，体积中值直径)和SMD(Sauter mean diameter，索特平均直径)，结果如表5所示。以VMD和SMD作图获的粒径分布曲线，结果如图5所示，其中A图为BA；B图为AH；C图为L-leu原料；D图-J图依次为L-leu含量为0％、10％、15％、20％、25％、40％和50％(实施例1-7)的BA/AH-DPI。
表5不同配比BA/AH-DPI干粉的粒径测定结果
从表5和图5的结果中可以看出，原料药粒径较大，而经过喷雾干燥后各配方微粒粒径明显符合吸入制剂的要求，粒径Dv90均在5μm以内，当L-leu含量占比为10％-40％时，BA/AH-DPI的Dv90在3μm以内。
差式扫描量热法(DSC)测试
分别精密称取BA，AH，L-leu，以及三者以2：2：1的质量比制备的物理混合物，与实施例4的BA/AH-DPI干粉(L-leu占20％)5mg，置于铝制样品盘中压制，放入DSC的样品室中，并放置空白参比盘，保持干燥的N2环境(30mL/min)，待系统稳定后，以10℃/min的速度从30℃到350℃的升温范围进行检测，绘制样品吸热放热曲线。
BA、AH、L-leu、三者物理混合物和BA/AH-DPI干粉DSC图谱如图6所示。从图6中可以看出，BA(曲线C)在216.49℃处有一个熔融吸热峰，AH(曲线D)在246.26℃可以看到熔融吸热峰，L-leu(曲线E)在301.28℃可以看到熔融吸热峰；而三者物理混合物(曲线B)在196.45℃为有一个吸热峰，推测BA在辅料L-leu的影响下，使得其熔融温度减小；同时三者的物理混合物中在255.19℃处可以看到AH的吸热峰，在302.26℃处可以看到L-leu的放热峰。在DPI(曲线A)中105.51℃和218.19℃处出现熔融的小吸热峰，而BA的熔融峰减弱，AH和L-leu的熔融和吸热峰消失，其图谱中无BA和AH特征峰出现，说明由BA和AH的晶型形态转变为DPI的无定形形态。不限于任何理论，发明人认为这可能是BA/AH-DPI干粉形成后BA和AH以分子形式被包裹于L-leu中，由晶型形态转变为无定形形态。
X射线衍射(XRD)分析
分别称取BA，AH，L-leu，三者物理混合物(BA、AH和L-leu)，实施例1-7的不同配比的BA/AH-DPI干粉适量，研磨成均匀粉末，把粉末制成一个平整平面的样品试片。通过Ni过滤的Cu-Kα辐射源记录其XRD曲线，设定检测条件：电压40kV、200mA、扫描范围5°-60°(2θ)、扫描速度4°/min、采样时间1s，分别绘制XRD图。BA、AH、L-leu和三者物理混合物的XRD图如图7所示，实施例1-7的不同配比的BA/AH-DPI干粉的XRD结果如图8所示。
从图7中可以看出，BA、AH、L-leu和三者物理混合物均为晶体形态，BA在8.52°、10.28°、12.32°、14.60°、16.90°、20.59°、23.70°、25.32°、27.90°、29.34°处有强衍射峰，AH在12.91°、15.71°、17.47°、20.45°、22.50°、23.28°、25.09°处亦存在强衍射峰，L-leu在6.13°、12.15°、24.37°、30.53°、36.82°处亦存在强衍射峰。三者物理混合物也表现出相同的衍射峰，在6.09°、8.58°、12.15°、12.95°、15.75°、16.96°、17.51°、20.49°、22.54°、23.32°、24.37°、25.09°、30.57°、36.88°等处均有结晶特征强衍射峰，提示药物均为晶体，混合后晶型未发生改变。
而图8的结果显示BA/AH-DPI干粉则为非晶体状态。BA/AH-DPI微粉在19.14°、31.65°和45.39°处虽然有一个小的宽峰微弱的衍射峰，但随着L-leu的加入，衍射峰强度减弱直至消失且表现出不规则的电磁辐射衍射，表明粉末主要是无定形的；进一步说明，喷雾干燥后得到的微粉由晶型形态转变成为无定形形态，并证实了DSC结果。
体外空气动力学分析
本领域通常在常温、相对湿度较低的条件下测定DPI体外沉积情况，以模拟DPI在肺部的沉积情况。
本申请采用新一代药物撞击器(the next generation pharmaceuticalimpactor，NGI)测定实施例1-7的BA/AH-DPI干粉的体外沉积性质。按顺序将仪器的各个组成部分依次连接，包括NGI的铰链盖，预分离器(Presep.)、人工喉(I.P.)和入口适配器(M.A.)，将含有一定量苄基和甘油的乙醇溶液加入到每个收集杯的表面，静置蒸发0.5h以避免颗粒反弹或再夹带。将BA/AH-DPI微粒过量加入到Easyhaler多剂量粉末吸入器中，进行试验(吸入时间：4s，吸入速度：60L/min)，在雾化后用预定体积的甲醇均匀充分冲洗溶解所有阶段中的含药微粉，并进行收集，按照以下色谱条件及表6所示的梯度洗脱条件，通过HPLC分析收集的溶液。通过软件计算气溶胶性质的参数：微细粒子分数(FPF)、质量中间空气动力学粒径(MMAD)和几何标准差(GSD)，结果如表7所示。不同L-leu配比的BA/AH-DPI干粉中BA和AH的FPF测定结果如图9A和图9B所示；BA和AH在NGI各层级的沉积情况如图10A和图10B所示。
液相色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)，流动相：甲醇-0.1％磷酸水；检测波长：248nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL
表6 BA/AH含量测定洗脱梯度条件
表7 BA/AH-DPI的体外沉积性质测定结果
从表7以及图9A、图9B的结果中可以看出，与不加L-leu的DPI相比，加L-leu处方中BA和AH的FPF值均较高；随着L-leu含量的升高，干粉的FPF逐渐升高，在15-25％，尤其是20％时，达到最高，说明此时BA/AH-DPI干粉的体外沉积性质最好，进一步增加L-leu含量，FPF值反而减小。说明DPI中适量加入L-leu载体在一定程度上可以改善DPI干粉的FPF等体外沉积性质。
通过体外空气动力学研究表明，L-leu的加入相对未加L-leu明显提高微粉的FPF(53.95±0.17％)，对提高BA/AH-DPI的分散性有重要作用，说明L-leu的适量加入使本申请的BA/AH-DPI具有优异的气溶胶性能和物理雾化稳定性。
以上实验结果表明，当L-leu占比为15-25％时，体外空气动力学的测定结果最优。后续选择L-leu占比为20％时为最优处方，进一步考察BA/AH-DPI的体内药效。
药效学研究
实验动物及药物
SPF级雄性SD大鼠，180g-220g，环境温度25±2℃，自由进食进水，本研究经天津中医药大学医学伦理委员会批准，在动物实验中心进行，课题中所使用的动物严格按照批准的研究方案开展研究工作。
博来霉素(Bloe)：浙江海正药业股份有限公司；将所述博来霉素溶于生理盐水溶液中，配制浓度为12.5mg/mL的博来霉素溶液，用于气管插管给药。
BA-DPI：将400mg BA和200mg L-亮氨酸溶于500mL PBS中，在与实施例4相同的喷雾干燥条件下制备BA-DPI(干粉中BA含量为0.638mg/mg)。
AH-DPI：将400mg AH和200mg L-亮氨酸溶于500mL PBS中，在与实施例4相同的喷雾干燥条件下制备AH-DPI(干粉中AH含量为0.571mg/mg)。
BA/AH-DPI：采用本申请实施例4的BA/AH-DPI干粉，其中，以下药效学研究及结果中，如无特殊说明，BA/AH-DPI指实施例4的BA/AH-DPI。
尾静脉注射制剂溶液：以实施例4的L-Leu含量为20％的BA/AH-DPI干粉，溶于生理盐水中，配制成浓度为3mg/ml的尾静脉注射制剂溶液。
吡菲尼酮：厂家北京康蒂尼药业有限公司，规格100mg，货号国药准字H20133376；吡菲尼酮是目前常用的治疗肺纤维化的临床用药，在本申请中采用吡菲尼酮作为阳性对照；将所述吡菲尼酮溶于生理盐水溶液中，配制浓度为11.6mg/ml的吡菲尼酮溶液，用于灌胃给药。
实验动物分组及处理方式
将48只SPF健康的SD雄性大鼠(体重180-220g)随机分为8组，每组6只大鼠：(1)正常组(对照组)：在动物中心正常饲养；(2)假手术组：该组通过肺部给药形式给予同等剂量的空气；(3)Bleo模型组：通过气管插管给浓度为12.5mg/mL的Bleo溶液100μL，给药后大鼠正立旋转晃5min后即可，本申请中也可简称为Bleo组或模型组；(4)Bleo+BA-DPI组：采用与Bleo模型组相同的造模方法，从造模第二天后开始气管插管通过DP-4大鼠干粉肺部给药装置(厂家：北京元森凯德生物技术有限公司)进行BA-DPI给药，剂量9mg/kg，每天给药3mg，共给药28天；(5)Bleo+AH-DPI组(方法同4)；(6)Bleo+BA/AH-DPI组(方法同4)；(7)Bleo+尾静脉注射组：从造模第二天后开始尾静脉注射制剂溶液，按照9mg/kg，浓度3mg/ml，每天给药1ml，共给药28天；(8)Bleo+吡菲尼酮组：在造模成功后第二天开始灌胃每天给药2ml，浓度为11.6mg/ml，共给药28天。
肺部DPI干粉给药操作：精密称取DPI微粉置于给药装置的储存室内，安装DP-4干粉给药装置，连接存有1.5-2ml空气的注射器，将大鼠麻醉后平躺在气管插管平台，用大鼠喉镜进行暴露气管口，趁气管口打开，立即将给药装置喷头从气管口插入，至支气管岔口，立即向给药装置推入空气，将DPI微粉推入大鼠肺部。假手术组按上述方法推入1.5-2ml空气(不包含药)。
数据分析
实验结果以(Mean±SD)表示。组间差异采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验。p<0.05为存在显著性差异。所有数据计算和分析均使用GraphPad Prism 8.0进行。
大鼠体重变化分析
每日观察大鼠呼吸、活动、进食和体重情况，将Bleo造模视为第一天，分别记录1、7、14、21、28天的各组大鼠体重，并进行统计学分析，结果如图11所示。正常组和假手术组大鼠正常饲养、精神状态良好，正常饮食，体重持续增长，从图11中可以看出，假手术组大鼠体重増长与正常组之间没有差异。Bleo组大鼠体重在14天以内基本保持不变，Bleo+AH-DPI组大鼠造模后精神状态差、略有萎靡，饮食饮水量减少，懒动易聚集，双耳、肢端肤色晦暗，自第7d后体重逐渐回升，但体重增加较Bleo组增加不明显。Bleo+BA-DPI组和Bleo+BA/AH-DPI组大鼠在前7天体重略有增加，活动较少，7天后大鼠活动较多，饮水进食正常，体重快速增长；Bleo+尾静脉注射组和Bleo+吡菲尼酮组大鼠体重呈增长趋势，动物状态稍有改善，但与Bleo+BA/AH-DPI组大相比仍较差；其中从第7天开始正常组、Bleo+BA/AH尾静脉注射组和Bleo+BA/AH-DPI组大鼠体重明显高于Bleo组(p<0.01或p<0.05)，Bleo+吡菲尼酮组从第14天开始大鼠体重与Bleo组相比有明显差异(p<0.01)。经过28天的尾静脉注射后大鼠状态均有一定的不适，尾部发生一定程度的脱皮现象。综上，BA/AH-DPI能够明显改善Bleo诱导的肺纤维化大鼠的体重下降。
肺功能指标测试
于28天造模完成时用EMKA肺功能检测仪对自由活动状态下的大鼠进行检测各种呼吸指标，包括吸气持续时间(Ti)，呼气持续时间(Te)，最大吸气流量(PIF)，最大呼气流量(PEF)，潮气量(TV)，松驰时间(RT)，呼气量(EV)等，结果如表8所示。
肺阻力和顺应性通常被认为是评估肺功能的金标准。肺功能参数数据见表8所示。与正常组比较，Bleo组大鼠肺功能参数中Ti、Te、PIF、PEF、RT和TV、EV值均较低(p<0.01，p<0.05)；与Bleo组比较，Bleo+AH-DPI组在肺功能参数中PIF、PEF升高较为明显(p<0.01)。Bleo+BA-DPI组在肺功能参数中PIF、PEF、RT升高显著。Bleo+BA/AH尾静脉注射组、Bleo+BA/AH-DPI组与Bleo+吡菲尼酮组在肺功能参数中Ti、Te、PIF、PEF、RT均比Bleo组较高(p<0.01)，且Bleo+BA/AH-DPI组在参数TV和EV上与Bleo组相比均有显著性差异(p<0.01，p<0.05)。以上结果说明，相较于单独BA或者AH的DPI给药，以及采用尾静脉注射的方式给药，本申请的BA/AH-DPI对于肺功能指标的改善更明显。
大鼠肺系数测定
肺水肿是公认的肺纤维化指标，而肺系数是反映肺组织损伤、肺水肿和纤维化程度的指标之一，其值越高，说明肺病变程度越重。用以下公式计算肺系数并进行统计学分析。
公式如下：
8组大鼠(每组6只)处死后，收集大鼠的肺泡灌洗液(用于后续实验)，摘取肺组织并称重，所得肺系数值如表9及图12所示，从结果中可以看出，正常组和假手术组肺系数均在4-5之间；Bleo组的肺系数大于8，说明该指标符合肺纤维化模型要求。Bleo+AH-DPI组和Bleo+BA-DPI组的肺系数大于7，Bleo+BA/AH-DPI组、Bleo+BA/AH尾静脉注射组和Bleo+吡菲尼酮组大鼠的肺系数均在6-7的范围内，说明BA/AH联合用药相比于单独用药，对于改善肺水肿具有更好的效果。
表9各组大鼠肺组织系数数据(n＝6)
大鼠肺组织HE染色观察
将称重后的左肺存放在10％中性福尔马林固定液中浸泡24h后，经脱水处理并包埋于石蜡中。切片厚度为5μm，经苏木精及伊红染色(HE染色)、脱水透明及中性树胶封固等步骤后于显微镜下进行观察切片标本并拍照。结果如图13所示。
从图13中可以看出，正常组和假手术组肺组织病理学改变较少，切片正常，肺泡间隔薄；而Bleo模型组大鼠肺组织出现严重纤维化，表现为结构紊乱呈典型的纤维化外观，包括炎性细胞浸润和肺泡出血，图中箭头指示肺泡增大，肺泡间质增厚。与Bleo模型组相比，Bleo+尾静脉注射组、Bleo+吡菲尼酮组和Bleo+BA/AH-DPI组大鼠肺泡间质增厚更薄，纤维化特征和炎症浸润更少；Bleo+BA-DPI组和Bleo+AH-DPI组同Bleo组病理学结果相似，肺泡间质略显比Bleo组薄、均有炎性渗出物，但无明显的差异。本实验说明本申请的BA/AH-DPI能够改善Bleo造成的组织病理学改变。
肺部支气管肺泡灌洗液(BALF)的分析
利用支气管肺泡灌洗术所得到的肺泡表面衬液即为肺泡灌洗液(Bronchoalceolar lavage fluid，BALF)，临床上主要将BALF用于细胞因子、氧化应激相关酶及可溶性物质的检测，用于肺部相关疾病(如肺部炎症、IPF等)的判断、诊治、疗效和改善其预后[63]。
本实验进行的支气管肺泡灌洗术(BAL)操作如下：腹主动脉取血处死大鼠后，抛开胸腔，去除气道上多余脂肪组织，暴露出气管。将滞留针从气管前端插入，使针头到达右肺支气管处，将针头前后均固定，向肺内缓慢灌注2ml预冷的生理盐水，停留2min进行抽吸，反复操作3次，将3次BALF合并置于10ml的EP管中，并低温保存，此方法的灌洗回收率＞80％。
将所得BALF在4℃、4000r·min-1条件下离心10min，得上清液。采用比色法对总蛋白含量进行测定，测定方法按总蛋白测定试剂盒(厂家：南京建成生物工程研究所有限公司；货号：A045-4-2)说明书步骤进行。总蛋白含量测定结果如下表10和图14所示，正常组和假手术组总蛋白含量均在8mg/mL左右，两者无差异性(p>0.05)；与假手术组相比，Bleo组总蛋白含量为(17.04±1.87)mg/mL，显著升高(p<0.01)。与Bleo组相比，Bleo+吡菲尼酮组(p<0.01)和Bleo+BA/AH-DPI组(p<0.05)大鼠BALF中总蛋白含量均较低；而Bleo+尾静脉注射组、Bleo+AH-DPI组和Bleo+BA-DPI组总蛋白含量下降(p<0.05)。从测定结果可以看出两药联用降低总蛋白含量的效果比单药显著，同吡菲尼酮无差异性(p>0.05)。
表10 BALF中总蛋白浓度测定结果(Mean±SD，n＝6)
为了验证BA/AH-DPI是否能通过调节细胞因子的分泌来调节炎症过程，本申请还检测BALF中炎症因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β的浓度，以确定BA/AH-DPI对Bleo诱导的特发性肺纤维化发病过程中起到保护和治疗的作用。
取上述BALF上清液采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行测定检测其中炎症因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β以及IFN-γ、TGF-β1浓度水平。具体实验操作按照ELISA试剂盒(IL-4、IL-6、IL-1β厂家：武汉博士德生物工程有限公司；货号：EK0406、EK0412、EK0393。IL-8厂家：上海科兴生物科技有限公司；货号：F8655-A)说明书步骤进行，实验结果如图15所示。
从图15中可以看出，正常组和假手术组大鼠BALF中炎症因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β浓度水平相当(p>0.01)。与正常组相比，Bleo组大鼠BALF中IL-4、IL-6、IL-8和IL-1β水平明显升高(##p<0.01)；与Bleo组相比，Bleo+吡菲尼酮组、Bleo+BA/AH-DPI组和Bleo+尾静脉注射组中IL-4、IL-6、IL-8和IL-1β均显著性降低(p<0.01或p<0.05)；而Bleo+BA-DPI组和Bleo+AH-DPI组大鼠BALF中IL-4、IL-6、IL-8和IL-1β浓度值降低，但均无差异性(p>0.05)。结果表明，BA/AH-DPI能够显著降低炎症因子水平，对Bleo诱导大鼠的炎症反应有抑制作用。
肺组织匀浆中羟脯氨酸(Hyp)和氧化应激指标测定分析
将称重后的右肺放于生理盐水漂洗干净后，用滤纸吸干水分，进行肺组织匀浆。
氧化应激在Bleo诱导的肺纤维化进程中起着重要作用。MDA表达水平和SOD活力高低可反映机体氧化和抗氧化作用是否平衡的状态。因此本申请中将SOD与MDA配合测定以达到观察在肺纤维化中的作用。在胶原蛋白中Hyp含量最高，肺组织匀浆中Hyp含量的高低表现出肺组织中胶原蛋白代谢情况及肺纤维化程度。
本申请采用ELISA进行检测Hyp水平，按照ELISA试剂盒(厂家：上海科兴生物科技有限公司；货号：F3609-A)说明书步骤进行。采用超氧化物歧化酶WST-1法检测SOD浓度水平，硫代巴比妥酸(TBA)法进行检测MDA浓度水平，微板法进行检测乳酸脱氢酶(LDH)浓度水平。实验操作按照制造商SOD、MDA和LDH测定试剂盒(SOD、MDA和LDH厂家：南京建成生物工程研究所有限公司；货号：A001-3、A003-1、A020-2)说明书步骤进行检测分析。Hyp、SOD、MDA和LDH检测结果如图16所示。
如图16所示，相较正常组，给予Bleo诱导后，大鼠肺组织氧化代谢产物MDA和LDH显著升高(p<0.01)，而SOD明显降低(p<0.01)。与Bleo组相比，连续给药28天后，Bleo+吡菲尼酮组、Bleo+BA/AH-DPI组和Bleo+尾静脉注射组大鼠肺组织中MDA水平均显著降低(p<0.01，p<0.05)，Bleo+吡菲尼酮组、Bleo+BA/AH-DPI组大鼠肺组织中SOD抗氧化指标显著升高(p<0.01)，LDH含量明显降低(p<0.01或p<0.05)，而Bleo+尾静脉注射组中SOD和LDH虽然有一定的升高和下降趋势，但均无差异性(p>0.05)；Bleo+BA-DPI组和Bleo+AH-DPI组大鼠肺组织中MDA和LDH水平降低(p>0.05)，SOD抗氧化指标升高(p>0.05)。Bleo+BA-DPI组和Bleo+AH-DPI组相对正常组而言，大鼠肺组织中MDA水平较高(p<0.05)，SOD抗氧化指标较低(p<0.05)。由此说明，本申请的BA/AH-DPI能够有效改善肺纤维化大鼠肺组织中的氧化损伤。
正常组和假手术组大鼠肺组织中Hyp含量分别为76.43pg/ml和77.57pg/ml，两者无差异性，Bleo组Hyp含量为118.33pg/ml，显著高于正常组和假手术组(p<0.01)。与Bleo组相比，Bleo+吡菲尼酮组(含量为83.40pg/ml)、Bleo+BA/AH-DPI组(含量为84.06pg/ml)和Bleo+尾静脉注射组(含量为85.65pg/ml)大鼠肺组织中Hyp水平均显著降低(p<0.01，p<0.05)，且接近正常组和假手术组的水平(如图16)。Bleo+AH-DPI组和Bleo+BA-DPI组肺组织Hyp含量分别为100.17pg/ml和102.97pg/ml，均显著高于正常组和假手术组(p<0.05)，但低于Bleo组，三组之间无显著性差异(p>0.05)。由此说明，本申请的BA/AH-DPI能够改善大鼠的肺纤维化。
血清中髓过氧化物酶含量(MPO)分析
大鼠经处死前经腹主动脉取血，全血在4000r·min-1下离心10min，取上清得血清，血清在4℃、4000r·min-1条件下离心10min，取上清液，采用比色法进行检测MPO含量。实验操作按照厂家说明使用试剂盒(厂家：上海科兴生物科技有限公司；货号：F3213-A)检测MPO水平。
血清中MPO的含量反映了中性粒细胞在肺组织中的积累，是判断肺部炎症细胞浸润的可靠指标。本申请大鼠血清中MPO的检测结果如图17所示，结果显示通过Bleo诱导增加了大鼠血清中MPO的水平。与正常组相比，Bleo组、Bleo+BA-DPI组和Bleo+AH-DPI组大鼠血清中MPO水平显著升高(p<0.01)。与Bleo组相比，Bleo+吡菲尼酮组、Bleo+BA/AH-DPI组和Bleo+尾静脉注射组均明显抑制MPO活性(p<0.01或p<0.05)；而Bleo+BA-DPI组和Bleo+AH-DPI组略微对MPO活性抑制，但无明显差异性(p>0.05)。由此说明，本申请的BA/AH-DPI能够抑制MPO活性，从而改善肺部炎症细胞浸润。
综合上述药效学研究结果，本申请的BA/AH-DPI能够改善肺纤维化大鼠的肺功能，对于肺水肿和肺部病理改变也具有很好的改善作用，同时发明人还发现本申请的BA/AH-DPI可以改善肺部验证和氧化损伤，降低肺部Hyp含量，说明本申请的BA/AH-DPI能够改善肺部纤维化的症状，且实验数据表明本申请的BA/AH-DPI相比于单独DPI给药或者通过尾静脉注射的方式给予BA/AH，其对肺纤维化的治疗效果均更佳，说明本申请的BA/AH-DPI通过BA/AH联合用药，结合DPI的肺部给药方式，能够获得更好的治疗效果。
体内药代动力学研究
实验动物
SPF级健康SD雄性大鼠，体重180-220g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司(合格证号：SCXK(京)2019-0010)，饲养温度：(23±2)℃，湿度：(50±10)％，正常饲养。本研究经天津中医药大学动物实验中心批准进行。
血浆样品和肺组织的采集
将108只SPF级SD雄性大鼠随机分为尾静脉注射组和肺部给药组，每组分2min、4min、10min、15min、30min、1h、2h、4h和6h共9个时间点，每组每个时间点6只大鼠。实验前12h对大鼠禁食，不禁水。取大鼠称重(计算给药量)并编号，两组均按2mL/kg的剂量腹腔注射10％水合氯醛，第1组按9mg/kg的剂量尾静脉注射给药BA/AH-DPI生理盐水溶液；第2组按相同剂量使用DP-4气管吹入器喷雾给药BA/AH-DPI微粉3mg(每次推入空气1.5mL，连续推入3-4次)；两组大鼠分别于给药后按上述时间点腹主动脉取血处死大鼠。将取得的全血置于有肝素钠的离心管中，4000r/min离心10min，分离出上层血浆于-80℃冰箱中保存。取血后迅速打开胸腔，分离出大鼠的肺部，用冰浴的生理盐水将肺组织表面的少量浮血洗净，滤纸吸干肺组织表面水分，剪去气管，用锡箔纸包裹并置于10mL离心管中。精密称取肺重，于-80℃冰箱中保存。
血浆样品和肺组织的处理
取肺组织按照重量体积比1：4(g：mL)加入生理盐水，在冰水浴下用匀浆机进行打散并研磨均匀得到匀浆液，6500r/min离心20min，即得肺组织匀浆上清液。
精密吸取血浆样品或肺组织上清液100μL，加入含有内标的甲醇溶液200μL(100ng/mL)，涡旋混匀3min，12000r/min离心10min，得上清液即处理完样品，采用UPLC-MS/MS方法对BA和AH含量进行测定。
液质条件
色谱柱：Waters ACQUITYBEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱如表11所示，柱温：30℃，流速：0.3mL/min，检测波长：进样量：5μL，进样室温度：4℃。
表11梯度洗脱
电喷雾离子源(ESI源)；扫描方式：正离子(ESI+)检测；检测方式：多反应离子监测(MRM)。电喷雾电压：4kV；雾化气体：N2；喷雾气流速(Gas1)：15psi；离子源温度：300℃。具体质谱参数见下表12。
表12测定大鼠血浆与肺组织匀浆中BA和AH含量的质谱参数设定值
本申请的BA/AH-DPI进行肺部给药和尾静脉注射给药后，大鼠血浆和肺组织匀浆中的药物浓度，结果如表13和表14所示；药时曲线结果见图18-图21，其中，图18为血浆中BA的浓度曲线，图19为血浆中AH的浓度曲线；图20为肺组织匀浆中BA的浓度曲线；图21为肺组织匀浆中AH的浓度曲线；相关药代动力学参数结果见表15和表16。
表13大鼠肺部给药和尾静脉注射两组的血药浓度(ng/mL，Mean±SD，n＝6)
表14大鼠肺部给药和尾静脉注射两组的肺组织匀浆中药物浓度(ng/mL，Mean±SD，n＝6)
药动学参数含义：HLz为生物半衰期，药物在体内的量或血药浓度降低一半所需要的时间；Tmax为达峰时间，给药后达到药峰浓度所需的时间。Cmax为药峰浓度，给药后出现的血药浓度最高值。AUC为血药浓度曲线对时间轴所包围的面积。Vz为表观分布容积，药物在体内达到动态平衡时体内药量与血药浓度的比例常数。CL/F为清除率，单位时间内从体内清除的药物表观分布容积数。MRTlast为平均滞留时间，药物分子在体内停留时间的平均值。
由结果可知，同尾静脉注射给药相比，肺部给药相同剂量的BA/AH-DPI干粉后，AH在血浆中4min时达到最大血药浓度(表13)，体内药物滞留时间略大但没有统计学差异(表15)，肺部给药组中AH的AUC0-6h相对较小但无统计学差异(表15)，绝对生物利用度达到53.5％，生物利用度(AUC)较高。肺部给药后BA在血浆中9min左右达到最大血药浓度(Cmax)(p<0.01)(表15)，与尾静脉注射相比体内半衰期明显延长(p<0.01)，体内平均滞留时间(MRTlast)明显延长(p<0.01)(表15)，均具有显著性差异。肺部给药BA的半衰期(HLz)较大，AUC0-6h偏小但无统计学差异(表15)，绝对生物利用度达到60.7％，生物利用度较高。由此可知，肺部给药能够明显提高药物在血浆中的生物利用度和体内平均滞留时间(MRTlast)，并延长半衰期。
在肺组织匀浆中，肺部给药组与尾静脉注射给药组相比，肺组织中BA的AUC0-6h在统计学上极显著性差异(p<0.01)，说明肺部给药明显提高了BA在肺组织内的生物利用度(AUC)。BA在肺组织内的清除率较低，体内滞留时间(MRTlast)相对较长(表16)，均具有显著性差异(p<0.05)。肺部给药中的AH与尾静脉注射组相比，AH在肺组织中的滞留时间(MRTlast)相对较长(表16)，无明显的显著性差异(p>0.05)，但AUC0-6h明显较高(p<0.01)(表16)，半衰期(HLz)延长(p>0.05)，体内清除率(CL/F)降低(p<0.01)(表16)，具有显著性差异。由此可知，所采用肺部给药能够显著提高BA和AH的肺内生物利用度，并具有一定的肺靶向性，为治疗肺部疾病带来具有潜力的前景。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。