醋炙五味子多糖提取物在制备治疗抑郁症的药物中的应用
阅读说明：本技术 醋炙五味子多糖提取物在制备治疗抑郁症的药物中的应用 (Application of vinegar-roasted schisandra polysaccharide extract in preparation of medicine for treating depression ) 是由 郭雨薇 罗正凯 杨安儒 郭琳 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及醋炙五味子多糖提取物及其制备方法,以及醋炙五味子多糖提取物在制备治疗抑郁的药物中的应用。研究结果表明,醋炙五味子多糖提取物减少了小鼠强迫游泳实验的固定不动时间,并显著减少了小鼠社会干扰实验中的攻击行为,增加了社会相互干扰行为,从现代药理学角度确定了醋炙五味子多糖提取物具有治疗抑郁症的药效学作用。(The invention relates to a polysaccharide extract of vinegar-roasted schisandra chinensis and a preparation method thereof, and application of the polysaccharide extract of vinegar-roasted schisandra chinensis in preparing a medicament for treating depression. Research results show that the vinegar-roasted schisandra chinensis polysaccharide extract reduces the immobility time of a forced swimming experiment of a mouse, obviously reduces the attacking behaviors in a social interference experiment of the mouse, increases social mutual interference behaviors and determines that the vinegar-roasted schisandra chinensis polysaccharide extract has the pharmacodynamic effect of treating depression from the perspective of modern pharmacology.)
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及醋炙五味子多糖及其制备方法和治疗抑郁的医药用途。
背景技术
抑郁症又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。临床可见心境低落与其处境不相称，情绪的消沉可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，自卑抑郁，甚至悲观厌世；甚至发生木僵；部分病例有明显的焦虑和运动性激越；严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。每次发作持续至少2周以上、长者甚或数年，多数病例有反复发作的倾向，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性。
抑郁症是世界第四大疾病；但我国对抑郁症的医疗防治还处在识别率低的局面，地级市以上的医院对其识别率不足20％，只有不到10％的患者接受了相关的药物治疗；而且，同时，抑郁症的发病已开始出现低龄(大学，乃至中小学生群体)化趋势。综上所述，对抑郁症的科普、防范、治疗工作亟待重视，抑郁症防治已被列入全国精神卫生工作重点。
目前治疗各类抑郁症的西药主要有三环类抗抑郁剂(简称TCA，分为咪嗪类，普林类，二苯并卓类等)、单胺氧化酶抑制剂(简称MAOI，如异丙肼等)和5-HT 再摄取抑制剂(简称SSRI，如氟西汀等)，但是西药普遍存在耐药性、毒副作用大等弊端，因此寻找安全、高效、副作用小的抗抑郁药物尤为重要，尤其是天然抗抑郁药物成为了该领域的研究热点。
五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinesis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，主产于我国东北地区，故习称北五味子。南五味子为木兰科植物华中五味子Schisandrasphenanthera Rehd.Et Wils.的干燥成熟果实。五味子收敛固涩，益气生津，补肾宁心。用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗，盗汗，津伤口渴，短气脉虚，内热消渴，心悸失眠。醋炙五味子是生品五味子醋炙炮制后的又一中药材，归肺、心、肾经，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，是治疗中医中消渴症的著名中药，醋炙后酸涩收敛之性增强，一直以来被用于治疗梦遗滑精、遗尿尿频、内热消渴等疾病的治疗，有着悠久的药用历史。
但是，目前尚无对醋炙五味子多糖提取物对抑郁症的治疗作用和作用机制进行研究。
发明内容
本发明通过相应的药理实验和活性成分研究创新发现了醋炙五味子多糖提取物对抑郁症的治疗作用及其作用机制，继而完成本发明。
本发明第一方面涉及一种醋炙五味子多糖提取物。
所述醋炙五味子多糖提取物中多糖含量在60w/w％以上，优选60w/w％至80 w/w％。
所述多糖提取物中糖醛酸含量为8w/w％至15w/w％，糖蛋白含量为20w/w％至40w/w％。
优选地，所述多糖提取物中多糖含量为63.6w/w％、糖醛酸含量为9.21w/w％、糖蛋白含量为25.6w/w％。
在一个具体的实施方式中，所述多糖包含木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。
优选地，所述多糖提取物中多糖含量为63.6w/w％，所述多糖包含2.67w/w％木糖、30.02w/w％阿拉伯糖、2.01w/w％葡萄糖、6.56w/w％鼠李糖、1.25w/w％甘露糖、22.51w/w％半乳糖、2.18w/w％葡萄糖醛酸和16.44w/w％半乳糖醛酸。
本发明第二方面涉及一种醋炙五味子多糖提取物的制备方法。
所述醋炙五味子按照以下步骤制备：
(1)五味子饮片加入米醋，拌匀，室温闷润；
(2)蒸至醋被吸进，表面显紫黑色，去除干燥；
优选的步骤(1)：采用五味子饮片与米醋混合比例为5：1，闷润1.5小时；优选的步骤(2)：采用蒸制时间为5小时。
所述醋炙五味子粗多糖按照以下步骤制备：
(1)醋炙五味子加95v/v％乙醇回流提取，4层纱布过滤，合并滤液；
(2)晾干后用蒸馏水回流提取，水提液过16层纱布过滤，合并滤液后离心抽滤；
(3)抽滤后浓缩，再加95v/v％乙醇醇沉，静置；
(4)抽滤，滤液回收保存，滤渣用无水乙醇和丙酮交替洗涤；
(5)洗涤后用去离子水溶解后冷冻干燥，制得醋炙五味子粗多糖。
优选的步骤(1)；乙醇回流提取2次，每次2小时；
优选的步骤(2)：采用30倍量水回流2次，每次3小时；
优选的步骤(3)：滤液浓缩至原体积的1/2，加4倍体积的乙醇醇沉；
优选的步骤(4)：交替洗涤2～3次，至溶液无色。
本发明第三方面涉及醋炙五味子多糖提取物在制备预防和/或治疗有需要的受试者的抑郁症的药物中的应用。
本发明还提供一种用于治疗抑郁症的药物组合物，所述药物组合物包含醋炙五味子多糖提取物和药物学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施例中，所述药物组合物是口服给药剂型。
在一个实施例中，所述药物组合物是固体制剂或液体制剂。
在一个实施例中，所述药物组合物是片剂、胶囊、口服液、悬浮液、颗粒剂、粉剂、合计、丸剂或滴丸。
在一个实施例中，所述药物组合物还包含临床上常用的其他抗抑郁药物。
优选地，醋炙五味子多糖提取物与其他抗抑郁药物的重量比为5：1-20：1，更优选地为10：1。
在一个优选实施例中，所述其他抗抑郁药物为选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)。
优选地，所述SSRI为氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀、西酞普兰、舍曲林或度洛西汀中的一种或多种。
最优选地，所述其他抗抑郁药物是度洛西汀，且醋炙五味子多糖提取物与度洛西汀的重量比为10：1。
附图说明
图1醋炙五味子多糖提取流程图。
图2苯酚-硫酸法测定醋炙五味子粗多糖的含量标准曲线。
图3硫酸-咔唑法测定醋炙五味子粗多糖中糖醛酸含量标准曲线。
图4考马斯亮蓝法测定醋炙五味子粗多糖中的蛋白含量标准曲线。
图5气相质谱联用的方法测定醋炙五味子粗多糖的单糖组成图。
图6醋炙五味子多糖对小鼠社会干扰时间和社会干扰次数的影响。
图7醋炙五味子多糖对小鼠入侵时间率和入侵次数率的影响。
图8醋炙五味子多糖对小鼠强迫游泳时间的影响。
有益效果
药理学实验表明，相比于生五味子多糖，本发明的醋炙五味子多糖具有显著更强的抗抑郁作用，且无毒副作用。可以用于制备药物组合物或配方，用于治疗抑郁症，制备方法简单的优点，适合工业化生产。
本发明还发现，将采用本发明方法制备的醋炙五味子多糖与临床上常用的SSRI联用能够产生协同的抗抑郁作用，尤其在特定重量比的条件下两者协同作用最佳，从而在应用中可以显著降低这两者的给药剂量，减少相关毒副作用。
具体实施方式
实施例1：醋炙五味子的制备方法
取五味子饮片5kg，加入米醋1L，拌匀，室温闷润1.5小时；在常压下蒸制5小时，蒸至醋被吸进，表面显紫黑色，去除干燥，即得。
实施例2：醋炙五味子粗多糖多糖提取物的制备方法
取实施例1的方法制备的醋炙五味子饮片1kg，加95v/v％乙醇500mL回流提取2次，每次2小时；取4层纱布过滤，合并滤液；晾干后用30倍量蒸馏水回流提取2次，每次3小时；水提液过16层纱布过滤，合并滤液后离心抽滤；抽滤后浓缩至原体积的1/2，加4倍体积的95v/v％乙醇醇沉，静置10小时；抽滤，滤液回收保存，滤渣用无水乙醇和丙酮交替洗涤2～3次，至溶液无色；洗涤后用去离子水溶解后冷冻干燥，制得醋炙五味子粗多糖。
实施例3：苯酚-硫酸法测定醋炙五味子粗多糖的含量。
优化的条件为：以不同浓度的葡萄糖标准品溶液，加6w/v％苯酚试剂摇匀，迅速滴加浓硫酸摇匀，于490nm处测定吸光度值，以葡萄糖含量(μg)为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，获得回归方程为：y＝0.0079x+0.1246 (R2＝0.9979)(见图2)。
测定醋炙五味子粗多糖样品吸光度值，平行测定三次，从回归方程中求出供试液中葡萄糖的含量，按下式计算样品中多糖含量：
多糖含量(w/w％)＝C×D/W×100％。
W为醋炙五味子粗多糖质量(mg)，C为醋炙五味子粗多糖中葡萄糖浓度 (mg/mL)，D为醋炙五味子粗多糖的稀释倍数。
结果：根据标准曲线测得醋炙五味子粗多糖中多糖含量为63.6w/w％。
实施例4：硫酸-咔唑法测定醋炙五味子粗多糖中糖醛酸含量
优化的条件为：以不同浓度的半乳糖醛酸标准品溶液加入四硼酸钠/硫酸溶液6mL，混匀后水浴加热5分钟，而后在冰水浴中加入1.5mg/mL间羟基联苯溶液100μL，于530nm处测定吸光度值，以半乳糖醛酸浓度值(μL/mL)为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，获得回归方程为：y＝0.0029x+0.0105 (R2＝0.9911)(见图3)。
结果：根据标准曲线测得醋炙五味子粗多糖中糖醛酸含量为9.21w/w％。
实施例5：马斯亮蓝法测定醋炙五味子粗多糖中的蛋白含量
优化的条件为：以不同浓度的蛋白质标准品溶液加入5mL考马斯亮蓝G-250 试剂，于595nm处测定吸光度值，以蛋白质浓度值(μg/mL)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得回归方程为y＝0.0021x+0.0011(R2＝0.9997) (见图4)。
结果：根据标准曲线测得醋炙五味子粗多糖中蛋白含量为25.6w/w％。
实施例6：气相质谱联用的方法测定醋炙五味子粗多糖的单糖组成
(1)采用在110℃条件下TEA水解多糖，水解时间4小时，甲醇带干；
(2)氨水及NaBH4还原多糖，用盐酸甲醇带干；
(3)还原后加入六甲基二硅氮烷、三甲基氯硅烷放置70℃水浴锅中硅醚化反应，反应时间12小时；
(4)三氯甲烷和蒸馏水萃取后果有机滤膜进行气质分析
结果：测得醋炙五味子粗多糖由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成(见图5)。
实施例7：生、醋炙五味子多糖含量及单糖组成的变化
根据实施例2的方法制备五味子多糖。
根据葡萄糖标准曲线Y＝0.0079X+0.1246(R2＝0.9979)线性良好，以此计算生、醋炙五味子多糖含量，结果如表1所示。从表1可以看出，生五味子多糖含量最高，达到69.76w/w％，经醋炙后，多糖含量降低。
表1：生、醋炙五味子多糖含量及单糖组成的测定
实施例8：生、醋炙五味子多糖抗抑郁的药效学实验
实验方法
1实验动物分组及给药方式
将30只小鼠适应性喂养1周后，随机分为3组∶生理盐水组(空白组)，WF (生五味子多糖组)200mg/kg组和WP(醋炙五味子多糖组)200mg/kg组。均溶解在生理盐水中，并按照10mL/kg的容积口服给予小鼠。
2实验设计
每天给药1次(08:00AM)，连续给药12天，于给药第8天(给药后1h)开始行为学实验，对照组给予相等体积的生理盐水，给药剂量及给药方式遵循着实验室的前期经验。行为学实验按以下顺序进行；自主运动测试，高架十字迷宫测试，社会干扰测试及强迫游泳测试。行为顺序遵循前期实验最少限度干扰后期实验的的原则进行，且此顺序的合理性已经被Einm实验室证实。
3自主活动测试
给药后第8天，小鼠被放置于一个50cm×25cm×20cm的透明自动活动监视器中(OptoM3，Columbus Instruments，Columbus，OH)。红外线监测每10min 记录1次，连续记录6次，共60min，实验完成后，小鼠被送返饲养笼中，并用10v/v％的酒精擦净监视器。
4高架十字迷宫测试(EPM)
高架十字迷宫是木制的，高于地面60cm的十字形状的迷宫，由四条臂组成，其中包含两条密闭的臂(有24cm高的木制侧壁)和两条敞开的臂(有1cm高的木制侧壁)。每条臂都是由30cm×5cm的区域及5cm×5cm的中心区共同组成。给药后第9天，小鼠首先被放置于迷宫的中心区，由迷宫上方的摄像机记录其行为学5min，然后根据摄像记录手动计数小鼠在敞开臂及密闭臂的时间及次数，只有当小鼠四肢全部进入臂中才被记录。进入臂中的时间及次数被用于统计学分析(敞开臂时间/敞开臂时间+密闭臂时间)(敞开臂次数/敞开臂次数+密闭臂次数)。每只小鼠实验结束后都被送返其饲养笼，并用10v/v％酒精擦净迷宫装置。
5社会相互干扰测试
给药后第10天，小鼠从其饲养笼中，被配对转移进入一空的、不熟悉的测试笼中10min，配对的小鼠应当为同一治疗组或生理盐水组，通过其上方的摄像机连续记录配对小鼠的行为学10min，然后根据摄像记录手动计数每只小鼠的攻击时间及社会相互干扰时间。攻击时间被定义为试图咬、实际咬、拳击、踢等行为。社会相互干扰时间被定义为另一种形式的身体接触，包括嗅、舔或身体的接触。小鼠之间没有进行相互接触将不被记录。入侵比率被定义为入侵时间/入侵时间+社会相互干扰时间。实验结束后，小鼠被送返回饲养笼中。
6强迫游泳实验
强迫游泳实验的实验过程如下∶ICR小鼠于给药后第11天，被分别放入盛有水的塑料圆柱体(25cm×10cm)中，圆柱体盛有23-25℃，10cm高的水，小鼠被强迫待在塑料圆柱体中6min，当小鼠在塑料圆柱体中终止挣扎，保持漂浮的状态(仅有微小的动作以保持头部露出水面)则被认为是固定不动。总测试时间持续6min，前2min作为适应期，后4min通过自动分析软件(Biobserve， Bomm，Germany)记录下其游泳时间及固定不动时间。每只小鼠游泳完，都需要更换下圆柱体中的水。
7统计方法
统计学分析采用Statistis统计软件进行处理，所有数据均以X士SE表示。所有行为学测试结果通过ANOVA进行分析，以WP的剂量作为单因素，组间对比通过Fisher LSD事后比较完成，p<0.05被认为差别有显著性意义。
结果
1.醋炙五味子多糖(WP)对小鼠自主活动的影响
连续口服给予小鼠WP 8天后，进行自主活动实验，结果如表2所示，无论在前10min内还是在60min内，WP并未影响小鼠的自主活动时间。即WP并未影响小鼠行为学基线的改变。
表2：醋炙五味子总多糖对小鼠自主活动的影响
剂量
自动活动能力(10分钟)
自动活动能力(60分钟)
空白组
1201±92
3285±502
WP组
1188±104
3296±439
WF组
1193±95
2350±514
统计分析
F(2,27)＝2.01，p＝0.17(N.S.)
F(2,27)＝1.92，p＝0.24(N.S.)
2.WP对小鼠高架十字迷宫的影响
连续口服给予小鼠WP9天后，进行高架十字迷宫实验，结果见表3，WP并未影响小鼠的(敞开臂/敞开臂+密闭臂)时间率及(敞开臂/敞开臂+密闭臂)次数率。
表3：醋炙五味子总多糖对小鼠高架十字迷宫的影响
3.WP对小鼠社会干扰实验的影响
连续口服给予小鼠WP10天后，进行小鼠社会干扰实验，WP 200mg/kg显著影响了社会干扰实验的结果。与生理盐水组相比，WP显著增加了小鼠的社会干扰时间[F(2,27)＝13.5，p<0.0001](图6A)和社会干扰次数[F(2,27)＝7.01， p＝0.0038](图6B)。同时，WP显著降低了小鼠的入侵时间率和入侵次数率。对于入侵时间：F(2,27)＝3.55，p＝0.039；对于入侵次数：F(2,27)＝9.9，p<0.001 (图7)。
4.WP对小鼠强迫游泳实验的影响
连续口服给予小鼠WP11天后，进行强迫游泳实验，WP显著减少了强迫游泳实验的固定不动时间。如图8所示，F(2,27)＝8.46，p<0.002。
结论
当前的研究结果支持了WP具有抗抑郁的效果，且比WF效果好。WP减少了小鼠强迫游泳实验的固定不动时间，并显著减少了小鼠社会干扰实验中的攻击行为，增加了社会相互干扰行为。强迫游泳实验已经被确定为可靠的评价抑郁症的动物模型。社会干扰实验是另一个评价抗抑郁药及情绪稳定剂的动物行为学实验。WP并未影响小鼠的自主活动时间，这个结果是评价WP抗抑郁活性的前提，因为WP并未引起小鼠行为学基线的改变，如因精神萎靡，情绪低落而导致的固定时间增加，社会干扰时间减少等症状。WP具有减少小鼠强迫游泳实验固定时间的作用，减少小鼠攻击行为。给予WP并未影响高架十字迷宫的结果，表明WP并未引起躁狂行为。
实施例9：醋炙五味子多糖与其他抗抑郁药物联用的协同增效作用
在上述实施例8实验的基础上还做了延伸实验，初步考察了将醋炙五味子多糖与其他临床上常用的治疗抑郁症的SSRI药物联用后，其治疗抑郁症的药效。
协同指数采用金正均q值法进行判定，q值由以下的公式求得：q＝ PA+B/(PA+PB-PA×PB)。式中PA、PB和PA+B分别为A药组、B药组和两药联用组治疗率。q＜1说明两药合用后产生拮抗作用；q＞1，说明两药合用后产生协同作用， q＝1说明两药合用后产生相加作用。
在本部分实验中，以减少强迫游泳固定不动时间(％)作为计算q值的指标。强迫游泳固定不动时间的测定方法参见实施例8中的第6部分。减少强迫游泳固定不动时间％的具体计算公式如下：减少强迫游泳固定不动时间(％)＝(空白组动物平均强迫游泳固定不动时间-受试药物组动物平均强迫游泳固定不动时间)/空白组动物平均强迫游泳固定不动时间×100％。
具体结果如下表2所示。
表2：生、醋炙五味子多糖与其他抗抑郁药物联用的协同增效作用
从表2中的结果可以看出，生五味子多糖与度洛西汀联用在治疗抑郁症方面无协同增效作用。低剂量和高剂量的炙五味子多糖与度洛西汀的组合均显示出协同增效作用，并且以高剂量的炙五味子多糖与度洛西汀以特定用量比例联用的协同作用最佳。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
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