曲格列酮在抗结核分枝杆菌药物中的应用
阅读说明：本技术 曲格列酮在抗结核分枝杆菌药物中的应用 (Application of troglitazone in anti-mycobacterium tuberculosis drugs ) 是由 张国良 毕静 郭庆龙 李国保 王召钦 黄秀静 覃琳琇 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了曲格列酮在抗结核分枝杆菌药物中的应用,包括以下步骤：THP-1巨噬细胞的分化：利用PMA对THP-1细胞进行诱导分化,然后加入曲格列酮进行培养；结核分枝杆菌的感染：结核分枝杆菌按MOI=10感染细胞,然后进行清洗,加入培养基进行继续培养；涂板计数:感染一段时间后,对细胞进行裂解,然后再进行梯度稀释涂板,再进行长时间培养,然后得到细菌存活数量。本申请测定了结核分枝杆菌强毒株H37Rv感染巨噬细胞后,曲格列酮在细胞内的抗结核分枝杆菌活性,结果显示曲格列酮显著增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除作用,具有良好的开发价值。(The invention discloses an application of troglitazone in a mycobacterium tuberculosis resistant drug, which comprises the following steps: differentiation of THP-1 macrophages: inducing and differentiating THP-1 cells by using PMA, and then adding troglitazone for culturing; infection with mycobacterium tuberculosis: infecting cells with mycobacterium tuberculosis according to MOI =10, then cleaning, and adding a culture medium for continuous culture; and (4) plating counting, namely after a period of infection, cracking the cells, then performing gradient dilution plating, and then performing long-time culture to obtain the survival number of bacteria. The application determines the activity of troglitazone against mycobacterium tuberculosis in cells after macrophages are infected by a virulent strain H37Rv of mycobacterium tuberculosis, and the result shows that troglitazone obviously enhances the clearing effect of the macrophages on the mycobacterium tuberculosis and has good development value.)
技术领域
本发明涉及生物医学医药领域，尤其涉及曲格列酮在抗结核分枝杆菌药物中的应用。
背景技术
结核特别是耐药结核是当前结核病治疗的重点和难点，宿主定向治疗是当今耐药结核病研究领域的热点，其核心理念是通过干预宿主基因功能来增强保护性免疫应答或抑制过度炎症反应来治疗耐药结核病。在深入认识宿主抗结核免疫特征和调节机制的基础上，研发免疫治疗或更广义的基于宿主基因定向治疗结核病新策略为结核病治疗，尤其是克服耐多药结核提供了新的愿景。
发明内容
针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供一种利用曲格列酮对抗结核分枝杆菌的抑制方法，测定了结核分枝杆菌强毒株H37Rv感染巨噬细胞后，曲格列酮在细胞内的抗结核分枝杆菌活性，结果显示曲格列酮具有明显的抗结核分枝杆菌活性，显著增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除；首次发现了曲格列酮抗结核分枝杆菌的新功能，是一个潜在的靶向宿主的抗结核药物。
为实现上述目的，本发明提供曲格列酮在抗结核分枝杆菌药物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
THP-1巨噬细胞的分化：利用PMA对THP-1细胞进行培养分化，然后加入曲格列酮进行培养；
结核分枝杆菌的感染：结核分枝杆菌按MOI＝10感染细胞，然后进行清洗，加入含曲格列酮的培养基进行继续培养；
图板计数:感染一段时间后，对细胞进行裂解，然后再进行稀释倍数涂板，再进行长时间培养，然后得到细胞存活数量。
作为优选，曲格列酮的分子式为C24H27NO5S，相对分子质量为441.54，其结构式为：
作为优选，在THP-1巨噬细胞的分化步骤中，首先采用含10％胎牛血清的1640培养基在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，96孔板按每孔5×104个细胞数铺板，加入终浓度100ng/ml的PMA刺激过夜，使其分化为巨噬细胞，24h后更换为完全培养基。
作为优选，将诱导分化的巨噬细胞继续培养24h后加入不同浓度的曲格列酮，在37℃，5％CO2继续培养48h，利用cck-8试剂盒检测细胞活性。
作为优选，曲格列酮的浓度分别为5μM、10μM、20μM、30μM、50μM、60μM、70μM、80μM和100μM。
作为优选，将THP-1细胞诱导为巨噬细胞后，在感染前1h加入曲格列酮进行预处理，结核分枝杆菌H37Rv按MOI＝10感染细胞，然后采用PBS进行清洗，加入1640完全培养基在37℃，5％CO2继续培养，在此过程中一直维持曲格列酮的添加。
作为优选，在涂板技术步骤中，将感染24、48、72小时后，用0.025％的SDS裂解细胞，分别按10-2、10-3稀释倍数涂板，37℃细菌培养箱培养约三周计数。
本发明的有益效果是：本发明的技术方案主要为曲格列酮在抗结核分枝杆菌药物中的应用，本发明测定了结核分枝杆菌强毒株H37Rv感染巨噬细胞后，曲格列酮在细胞内的抗结核分枝杆菌活性，结果显示曲格列酮具有明显的抗结核分枝杆菌活性，显著增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除；且具有以下优势：本发明首次发现了曲格列酮抗结核分枝杆菌的新功能，是一个潜在的靶向宿主的抗结核药物；本发明首次提出曲格列酮在抗结核药物中的应用；本发明发现了曲格列酮可以显著增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除功能。
附图说明
图1为本发明曲格列酮的剂量反应曲线；
图2为曲格列酮对结核分枝杆菌H37Rv的抑制情况；
图3为涂板计数检测曲格列酮联合异烟肼对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的影响。
具体实施方式
为了更清楚地表述本发明，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步地描述。
曲格列酮是是PPARγ的激动剂，在MIA Paca2和PANC-1细胞中能增加染色质凝聚，增强caspase-3的活性，下调Bcl-2的表达。曲格列酮促进肺腺癌细胞中TRAIL-介导的凋亡，自噬抑制剂可阻断曲格列酮增强的TRAIL-诱导的凋亡。曲格列酮为噻唑烷二酮类药物，可改善胰岛素抵抗，增加人体组织对胰岛素的敏感性，增强胰岛素的作用。动物实验表明其作用靶位是通过与核过氧化物酶体增殖体活化受体(涉及胰岛素-效应基因的转录和调节脂细胞分化和脂代谢)结合而降低胰岛素的抵抗性；曲格列酮的分子式为C24H27NO5S，相对分子质量为441.54，其结构式如下：
但是现有技术对曲格列酮都主要应用在胰岛素方面，而对于抗结核分枝杆菌方面，却没有任何的研究或者报告指出，申请人在进行抗结合分枝杆菌的试验的过程中，偶然发现曲格列酮能显著增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除功能，基于此，申请人进行后续研究。
实施例一
S1:THP-1巨噬细胞的分化：THP-1细胞购自中国科学院细胞库，用含10％胎牛血清的1640培养基在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，96孔板按每孔5×104个细胞数铺板，加入终浓度100ng/ml的PMA(丙二醇甲醚醋酸酯)刺激过夜，使其分化为巨噬细胞，24h后更换为完全培养基。
S2:细胞存活率的测定：将上述诱导分化的巨噬细胞继续培养24h后加入曲格列酮，曲格列酮浓度分别为5μM、10μM、20μM、30μM、50μM、60μM、70μM、80μΜ和100μΜ；每个浓度分别做三个重复，利用曲格列酮溶剂DMSO(二甲基亚砜)作为对照组，无细胞培养基为空白组，37℃，5％CO2继续培养48h，利用cck-8试剂盒检测细胞活性，每孔加入10μl cck-8，培养箱培养2h后，利用酶标仪测定OD450nm的吸光度。
然后将细胞存活率按以下公式计算出不同浓度曲格列酮的细胞存活率后，利用GraphPad软件绘制剂量反应曲线并计算IC50。：
细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
其中As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、不同浓度的曲格列酮)；Ac：对照看(含有细胞的培养基、CCK-8、DMSO)；Ab：空白孔(不含细胞的培养基、CCK-8)。
图1为曲格列酮的剂量反应曲线，结果表明，曲格列酮对THP-1细胞IC50浓度为41.14μM。
实施例二
S3:结核分枝杆菌的感染：THP-1细胞以24孔板每孔2.5×105个细胞数的数量按上述方法诱导成为巨噬细胞，感染前1h加入曲格列酮预处理，结核分枝杆菌H37Rv按MOI＝10感染细胞，4h后用PBS清洗3遍，加入1640完全培养基培养在37℃，5％CO2的培养箱中继续培养，在此过程中一直维持曲格列酮的添加。
S4:涂板计数CFU：感染4、24、48、72小时后，用0.025％的SDS裂解细胞，分别按10-2、10-3稀释倍数涂板，37℃细菌培养箱培养约三周计数CFU。
图2为曲格列酮对结核分枝杆菌H37Rv的抑制情况，结果表明，和DMSO对照组相比，加入曲格列酮后结核分枝杆菌的存活率有明显下降，并且随着曲格列酮的浓度增加，对结核分枝杆菌的抑制作用也显著增加。从而可得出结论，曲格列酮能有效抑制巨噬细胞内结核分枝杆菌的生长，从而为抗结核病的治疗提供新的研究方向。
实施例三：
结核分枝杆菌的感染：THP-1细胞以24孔板每孔2.5×105个细胞数的数量按上述方法诱导成为巨噬细胞，感染前1h加入曲格列酮预处理，结核分枝杆菌H37Rv按MOI＝10感染细胞，4h后用PBS清洗3遍，加入1640完全培养基培养在37℃，5％CO2的培养箱中继续培养，在此过程中一直维持曲格列酮/异烟肼的添加。
涂板计数CFU：感染24、48、72小时后，用0.025％的SDS裂解细胞，分别按10-2、10-3稀释倍数涂板，37℃细菌培养箱培养约三周计数CFU。
图3为曲格列酮联合异烟肼对结核分枝杆菌H37Rv的抑制情况，结果表明，单独使用异烟肼或曲格列酮均可有效抑制或杀伤巨噬细胞中的结核分枝杆菌，异烟肼联合曲格列酮可显著增强异烟肼的杀伤效果。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。