以ccr5为靶点的覆盆子矢车菊素-3-o-半乳糖苷在制备抗hiv-1药物中的应用
阅读说明：本技术 以ccr5为靶点的覆盆子矢车菊素-3-o-半乳糖苷在制备抗hiv-1药物中的应用 (Application of raspberry cyanidin-3-O-galactoside with CCR5 as target spot in preparation of anti-HIV-1 drugs ) 是由 张清燕 李强 段晨晨 邓博文 刘真 桑锋 李�杰 钱洁玉 岳静宇 沈俊岭 李承乘 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及以CCR5为靶点的覆盆子矢车菊素-3-O-半乳糖苷在制备抗HIV-1药物中的应用,可有效解决以CCR5为靶点拮抗受体的抗HIV-1中药天然小分子化合物,实现在制备抗HIV-1药物中的应用问题,该矢车菊素-3-O-半乳糖苷是从中药覆盆子筛选出的天然小分子化合物,具有抗HIV-1的活性,有效用于以CCR5为靶点制备抗HIV-1药物,本发明利用计算机辅助药物设计中的虚拟筛选技术,以CCR5为受体筛选出对CCR5有抑制作用的已知中药天然小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷,以荧光素酶作为报告基因,确定其抗HIV活性,通过细胞毒性试验测试其肝毒性,并明确与CCR5的结合模式,作为CCR5抑制剂,是抗HIV药物上的创新。(The invention relates to an application of raspberry cyanidin-3-O-galactoside with CCR5 as a target spot in preparing an anti-HIV-1 medicament, which can effectively solve the application problem of an anti-HIV-1 Chinese medicinal natural small molecule compound with CCR5 as a target spot antagonistic receptor in preparing the anti-HIV-1 medicament, wherein the cyanidin-3-O-galactoside is a natural small molecule compound screened from the Chinese medicinal raspberry, has anti-HIV-1 activity, is effectively used for preparing the anti-HIV-1 medicament with CCR5 as the target spot, utilizes a virtual screening technology in computer-aided medicament design to screen a known Chinese medicinal natural small molecule compound cyanidin-3-O-galactoside with an inhibiting effect on CCR5 by taking CCR5 as a receptor, takes luciferase as a reporter gene to determine the anti-HIV activity, hepatotoxicity was tested by cytotoxicity assays and the binding pattern to CCR5 was well defined and is an innovation in anti-HIV drugs as a CCR5 inhibitor.)
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种以CCR5为靶点的覆盆子矢车菊素-3-O-半乳糖苷在制备抗 HIV-1药物中的应用。
背景技术
艾滋病是由艾滋病毒HIV-1感染所致的一种人类免疫缺陷性疾病，严重威胁着人们的身体健康和生命安全，因此，对艾滋病的治疗引起人们的高度重视。C-C趋化因子受体5(C-C chemokine receptor type5，CCR5)含有352个氨基酸，位于细胞膜上，属于G蛋白偶联受体家族中的一员，在HIV侵入靶细胞过程中行使重要功能。HIV病毒入侵靶细胞时，表面糖蛋白 gp120与靶细胞表面受体CD4结合，暴露CCR5结合位点，gp120再与其产生相互作用，进一步拉近HIV病毒与细胞膜的空间距离。随后，病毒表面糖蛋白gp41产生一系列的构象变化，实现病毒包膜与细胞膜的最终融合，病毒RNA进入细胞，使人类感染艾滋病。因此，抑制HIV与CCR5受体结合是控制HIV感染靶细胞的关键点。
目前虽有多种治疗艾滋病的药物，但由于种种原因，其疗效和使用并不尽人意，因此，研制和发现新的抗艾滋病毒HIV-1的药物已是业界所希望解决的技术问题。中药具有治疗各种疑难杂症的技术优势，并已研制和药物虚拟筛选出了多种抗HIV-1的中药活性成分。
药物虚拟筛选技术是基于药物设计理论，借助计算机技术和专业应用软件，从大量化合物中挑选出一些理想的化合物的方法。通过计算机模拟分子与受体活性部位结合情况，在现有的分子库中初步筛选出新的先导化合物后，进行活性验证。该技术将计算机辅助药物设计技术和活性实验技术相结合，减少了传统药物筛选过程中的周期长，投资大等缺点。
目前CCR5抑制剂仅有西药马拉韦罗(Maraviroc，MVC)，且临床毒副作用明显，中药治疗艾滋病已取得了一定的临床成果。相比于单纯HAART(高效抗逆转录病毒)治疗，中药联合治疗对于免疫重建不全病人治疗作用优势明显，且不良反应低。另外中药化合物也被证明具有抗HIV作用，但是以CCR5为靶点抑制HIV进入靶细胞的中药天然小分子化合物至今未见公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供能够拮抗CCR5受体的抗HIV-1中药天然小分子化合物的一种以CCR5为靶点的覆盆子矢车菊素-3-O-半乳糖苷在制备抗HIV-1药物中的应用，可有效解决以CCR5为靶点拮抗受体的抗HIV-1中药天然小分子化合物，实现在制备抗HIV-1药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种以CCR5为靶点的覆盆子矢车菊素-3-O-半乳糖苷在制备抗HIV-1药物中的应用，该矢车菊素-3-O-半乳糖苷是从中药覆盆子筛选出的天然小分子化合物，分子量484.838，分子式是C21H21ClO11，分子结构式为：
所述的覆盆子矢车菊素-3-O-半乳糖苷的筛选方法是，查阅中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform)，寻找25个CCR5抑制剂(活性分子Actives)，DeceyFinder1.1软件诱导1300个理论非活性分子(Decoy分子)，以RCSB(http://www.rcsb.org)中CCR5(PDB ID：4MBS)作为对接受体，Ledock和Vina对活性分子和Decoy分子进行对接，以结合能≤-7Kcal·mol-1为阳性结果；SPSS20.0拟合接收者操作特征曲线(Receiver operatingcharacteristic curve，ROC)评估 Ledock和Vina两种对接软件灵敏性，以曲线下面积(Area Under Curve，AUC)作为评判标准，其对接结果中包括四种参数：真阳性(Truepositives，TP)、假阳性(False positives,FP)、真阴性(True negatives,TN)和假阴性(False negatives,FN)；计算公示如下：真阳性率 (True positive rate,TPR)＝Sensitivity＝TP/(TP+FN)；假阳性率(False positive rate,FPR)＝1-specificity＝1-TN/(TN+FP)。对接软件灵敏度检测结果显示，对于CCR5受体而言，Ledock在测试中打分更高，如图2；为了更直观显示Ledock软件对接性能，利用Ledock 重新将阳性药物MVC和CCR5进行对接，PYMOL1.0可视化对接结果，以已报道MVC-CCR5 结合作为对比；经Ledock重新对接与原始结合状态重合度极高，因此利用Ledock对TCMSP 数据库进行虚拟筛选；
Ledock对TCMSP中29384个中药化合物进行虚拟筛选的具体步骤如下：①TCMSP数据 (https://tcmspw.com)中下载化合物.Mol2格式，中药化合物文件信息导入记事本建立ligands.txt 文件；②根据MVC活性结合位点设置盒子(Box)位置(X轴：21.98,41.407；Y轴：-4.105,13.234； Z轴：-31.05,-14.489)，网格大小和间距分别设置为和③运用 PYMOL1.0除去CCR5水分子、配体、杂原子等，进行加氢加电荷处理，将位点坐标导入结合位点文件，在Linux系统下输入对接指令进行CCR5抑制剂的筛选；
虚拟筛选共获得结合能≤-7Kcal·mol-1中药化合物143个，使用DiscoveryStudio 2019查看结合状态，MVC-CCR5结合构象作为对比，以能量值低、与MVC-CCR5结合构象相同残基不少于10个、质量小于500且含有CAS编号为限制条件得到矢车菊素-3-O-半乳糖苷，结合能为-7.02kcal·mol-1，相同氨基酸残基结合数量为13个，分子质量为484.838，CAS号(登陆号)为27214-71-7，为中药覆盆子的活性成分，分子式是C21H21ClO11，分子结构式为：
该矢车菊素-3-O-半乳糖苷具有抗HIV-1的活性，有效用于以CCR5为靶点制备抗HIV-1 药物，实现矢车菊素-3-O-半乳糖苷在制备抗HIV-1药物中的应用。
本发明为一种能够拮抗CCR5受体的抗HIV-1中药天然小分子化合物，利用计算机辅助药物设计中的虚拟筛选技术，以CCR5为受体筛选出对CCR5有抑制作用的已知中药天然小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷，以荧光素酶作为报告基因，确定其抗HIV活性，通过细胞毒性试验测试其肝毒性，并明确与CCR5的结合模式，因此，矢车菊素-3-O-半乳糖苷的分子结构可以作为CCR5抑制剂，成为抗HIV新药设计的技术基础，有广阔的开发潜力，是抗HIV药物上的创新，有良好的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷的分子结构式图。
图2为本发明小分子化合物木矢车菊素-3-O-半乳糖苷的Ledock和Vina接收者操作特征曲线图。
图3为本发明小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷的梯度稀释病毒荧光图。
图4为本发明小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷的梯度稀释病毒CCK-8OD值曲线图。
图5为本发明小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷的处理后的MAGI-CCR5细胞IC50 荧光素酶表达水平曲线图。
图6为本发明小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷处理后的MAGI-CCR5细胞毒性作用曲线图。
图7为本发明小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷处理后的LO2细胞毒性作用曲线图。
图8为小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷的核磁H谱图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明一种以CCR5为靶点的矢车菊素-3-O-半乳糖苷在制备抗HIV-1药物中的应用，所述的矢车菊素-3-O-半乳糖苷是从覆盆子中筛选出来的，筛选方法是：
查阅医药文献寻找25个CCR5抑制剂(活性分子，Actives)，DeceyFinder1.1软件诱导 1300个理论非活性分子(Decoy分子)，以RCSB(http://www.rcsb.org)中CCR5(PDB ID：4MBS) 作为对接受体，Ledock和Vina对活性分子和Decoy分子进行对接，以结合能≤-7Kcal·mol-1为阳性结果；SPSS20.0拟合接收者操作特征曲线(Receiver operatingcharacteristic curve,ROC) 评估Ledock和Vina两种对接软件灵敏性，以曲线下面积(Area Under Curve，AUC)作为评判标准，其对接结果中包括四种参数：真阳性(Truepositives，TP)、假阳性(False positives,FP)、真阴性(True negatives,TN)和假阴性(False negatives,FN)；计算公示如下：真阳性率(True positive rate,TPR)＝Sensitivity＝TP/(TP+FN)；假阳性率(False positive rate,FPR)＝1-specificity＝1-TN/(TN+FP)。对接软件灵敏度检测结果显示，对于 CCR5受体而言，Ledock在测试中打分更高，如图2；为了更直观显示Ledock软件对接性能，利用Ledock重新将阳性药物MVC和CCR5进行对接，PYMOL1.0可视化对接结果，以已报道MVC-CCR5结合作为对比；经Ledock重新对接与原始结合状态重合度极高，因此利用 Ledock对TCMSP数据库进行虚拟筛选；
Ledock对TCMSP中29384个中药化合物进行虚拟筛选的具体步骤如下：①TCMSP数据 (https://tcmspw.com)中下载化合物.Mol2格式，中药化合物文件信息导入记事本建立ligands.txt 文件；②根据MVC活性结合位点设置盒子(Box)位置(X轴：21.98,41.407；Y轴：-4.105,13.234； Z轴：-31.05,-14.489)，网格大小和间距分别设置为和③运用 PYMOL1.0除去CCR5水分子、配体、杂原子等，进行加氢加电荷处理，将位点坐标导入结合位点文件，在Linux系统下输入对接指令进行CCR5抑制剂的筛选；
虚拟筛选共获得结合能≤-7Kcal·mol-1中药化合物143个，使用DiscoveryStudio 2019查看结合状态，MVC-CCR5结合构象作为对比，以能量值低、与MVC-CCR5结合构象相同残基不少于10个、质量小于500且含有CAS编号为限制条件得到小分子化合物，经HPLC鉴定和测定，结合能为-7.02kcal·mol-1，相同氨基酸残基结合数量为13个，分子质量为484.838， CAS号(登陆号)为27214-71-7，命名为矢车菊素-3-O-半乳糖苷，分子式是C21H21ClO11，分子结构式为：
矢车菊素-3-O-半乳糖苷为中药覆盆子天然小分子化合物，具有抗HIV-1的活性，有效用于以CCR5为靶点制备抗HIV-1药物，实现矢车菊素-3-O-半乳糖苷在制备抗HIV-1药物中的应用，并经检测和实验，效果非常好，有关资料如下：
一、筛选中药天然小分子化合物：
查阅中药文献库，找出25个CCR5抑制剂(活性分子，Actives)，DeceyFinder1.1软件诱导1300个理论非活性分子(Decoy分子)，以RCSB(http://www.rcsb.org)中CCR5(PDBID： 4MBS)作为对接受体，Ledock和Vina对活性分子和Decoy分子进行对接，以结合能≤-7Kcal·mol-1为阳性结果。SPSS20.0拟合接收者操作特征曲线(Receiver operatingcharacteristic curve,ROC)评估Ledock和Vina两种对接软件灵敏性，以曲线下面积(AreaUnder Curve， AUC)作为评判标准，其对接结果中包括四种参数：真阳性(True positives，TP)、假阳性(False positives,FP)、真阴性(True negatives,TN)和假阴性(Falsenegatives,FN)。计算公示如下：真阳性率(True positive rate,TPR)＝Sensitivity＝TP/(TP+FN)；假阳性率 (False positive rate,FPR)＝1-specificity＝1-TN/(TN+FP)。对接软件灵敏度检测结果显示，对于CCR5受体而言，Ledock在测试中打分更高如图2。为了更直观显示Ledock软件对接性能，利用Ledock重新将阳性药物MVC和CCR5进行对接，PYMOL1.0可视化对接结果，以已报道MVC-CCR5结合作为对比。经Ledock重新对接与原始结合状态重合度极高，因此利用Ledock对TCMSP数据库进行虚拟筛选。
Ledock对TCMSP中29384个中药化合物进行虚拟筛选的具体步骤如下：①TCMSP数据 (https://tcmspw.com)中下载化合物.Mol2格式，中药化合物文件信息导入记事本建立ligands.txt 文件；②根据MVC活性结合位点设置盒子(Box)位置(X轴：21.98,41.407；Y轴：-4.105,13.234； Z轴：-31.05,-14.489)，网格大小和间距分别设置为和③运用 PYMOL1.0除去CCR5水分子、配体、杂原子等，进行加氢加电荷处理。将位点坐标导入结合位点文件，在Linux系统下输入对接指令进行CCR5抑制剂的筛选。
虚拟筛选共获得结合能≤-7Kcal·mol-1中药化合物143个。使用DiscoveryStudio 2019查看结合状态，MVC-CCR5结合构象作为对比，以能量值低、相同残基不少于10个、质量小于500且含有CAS编号为限制条件得到矢车菊素-3-O-半乳糖苷(SJ)。SJ结合能为-7.02kcal·mol-1，相同氨基酸残基结合数量为13个，分子质量为484.838，CAS号为27214-71-7；其来源为覆盆子，经HPLC液相色谱分析鉴定，色谱柱：C18柱，4.6×250mm×5μm；流动相甲醇：0.3％磷酸水＝28：72，波长λ＝520nm，流速1mL/min，35℃，样品用50％甲醇溶解，峰结果：
保留时间(分钟)
面积(微伏/秒)
％面积
1
6.120
15934
0.47
2
10.075
3363449
99.53
分析结果：
检测项目
质量标准
结果
性状
深棕色固体，溶于甲醇、酸水
符合
纯度
≥98.0％(面积归一化法)
99.53％(520nm)
质谱
应符合其结构
符合
核磁
应符合其结构
符合
有关光谱图参见图8。
二、活性实验
1实验材料
实验细胞及质粒：
293T细胞株、MAGI-CCR5细胞株、LO2细胞株由河南中医药大学第一附属医院艾滋病研究中心病毒实验室保存；DH-5α大肠杆菌购自上海生工生物公司；重组质粒JRFL和PLAI由中科院上海巴斯德研究所惠赠。
实验药物：
Lip2000转染试剂(批号：1526341)购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒(货号： 740410.5)购自德国Macherey-Nagel公司；遗传霉素(批号：10788700)购自美国Gibco公司；嘌呤霉素(货号：P8833)购自美国Sigma公司；潮霉素B溶液(货号：10843555001)购自美国 Roche公司；CCK-8试剂盒(批号：K10186133EF5E)购自美国APEXBIO公司；胎牛血清(批号：RB35935)购自海客隆公司；细胞裂解液(批号：0000381551)、荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号：0000151502)购自美国PROMEGA；PBS缓冲液(批号：20191221)、DMEM高糖培养基(批号：20200110)、Opti-MEM无血清培养基(批号：2152784)及0.25％胰蛋白酶-EDTA 消化液(批号：20191211)购自北京索莱宝公司；本发明中药天然小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷，MVC购自四川埃法生物科技有限公司。
实验仪器：
Thermo3111 CO2细胞培养箱(美国)、THZ-92B气浴恒温振荡器(上海博讯)、 DL-CJ-2ND超净工作台(哈尔滨东联)、Olympus CKX41-A32PH倒置荧光相差显微镜(日本)、QL-861涡旋仪(其林贝尔仪器)、HFsafe1200生物安全柜(上海力申)、3K3D台式高速冷冻离心机(德国Sigma)、NanoVue Plus核酸蛋白测定仪(美国Biochrom)、 SpectraMaxi3多功能酶标仪(美国分子仪器)、SpectraMaxL化学发光读板机(美国分子仪器)。
2、假病毒制备及感染能力检测实验：
(1)双质粒转化DH5α大肠杆菌
质粒PLAI(含HIV包膜蛋白基因)JRFL(含HIV骨架基因)各4μL，分别加入到含40μLDH5α大肠杆菌离心管中混匀，冰浴45min，42℃水浴90s，冰浴2min。后加至700μL无抗性 LB液体培养基中，混匀，200r·min-1，37℃培养40min后转移至含氨苄青霉素的抗性LB琼脂培养基平板上，灭菌玻璃棒涂匀，倒置平板，37℃培养过夜制得含有重组质粒的大肠杆菌。
(2)质粒提取及浓度检测
挑取单个含重组质粒的大肠杆菌，分别混匀于含4mL抗性LB液体培养基摇菌管中，37℃、250r·min-1，6h后倒入抗性LB液体培养基中，37℃，250r·min-1，过夜。严格按照质粒提取试剂盒进行质粒提取，核酸检测仪上测定质粒浓度和纯度。
(3)双质粒转染293T细胞
293T细胞用DMEM培养基(10％FBS、双抗，高糖)，于CO2培养箱(37℃,含5％CO2)中培养，正常换液传代。Opti-MEM稀释质粒(PLAI：JAFL＝3:1，共8μg)至350μL/孔，振荡混匀；Opti-MEM稀释lip2000转染试剂8μL至350μL/孔，合并质粒与转染试剂溶液，振荡混匀，室温放置20min。293T细胞以密度1×106/孔接种于6孔板中，至密度为80％左右进行转染。每孔加入质粒与转染试剂合并溶液700μL；6h后，更换为DMEM完全培养基继续培养48h。收集上清，分装，-80℃保存备用。
(4)MAGI-CCR5细胞用DMEM培养基(10％FBS、双抗，高糖，0.2mg/mL遗传霉素，0.1mg·mL-1潮霉素B，1μg·mL-1嘌呤霉素)，于CO2培养箱(37℃,含5％CO2)中培养，正常换液传代。1×104个/孔密度接种于96孔板，每孔100μL。次日弃96孔板上清，按照 1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64倍比加入100μL假病毒，不加病毒组为空白对照组，每组4个复孔，培养48h后吸弃每孔的细胞上清液，加入100μL/孔的无菌PBS缓冲液清洗，放置于摇床 5min，弃去PBS上清溶液；每孔加入35μLPassive Lysis Buffer细胞裂解液，放置于摇床15min；将每孔裂解后的溶液20μL转移到L检测板上；按照说明书配置Luciferase Assay检测液，将 L检测板放入SpectraMaxL化学发光读板机中读取数据。另培养一96孔板MAGI-CCR5细胞，次日弃96孔板上清，按照1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64倍比加入100μL假病毒，不加病毒组为空白对照组，每组4个复孔，在48h后加入CCK-8试剂20μL/孔，37℃孵育1h，酶标仪测定OD值。
3矢车菊素-3-O-半乳糖苷抗假病毒活性检测实验：
MAGI-CCR5细胞用DMEM培养基(10％FBS、双抗，高糖，0.2mg/mL遗传霉素，0.1mg·mL-1潮霉素B，1μg·mL-1嘌呤霉素)，于CO2培养箱(37℃,含5％CO2)中培养，正常换液传代。1×104个/孔密度接种于96孔板，每孔100μL。次日弃96孔板上清，将梯度稀释的矢车菊素-3-O- 半乳糖苷加入96孔板中，稀释梯度(V/V)为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μmol·L-1，不加中药化合物为空白对照组，每组3个复孔。2h后加入假病毒100μL/孔，继续培养48h后，吸弃每孔的细胞上清液，加入100μL/孔的无菌PBS缓冲液清洗，放置于摇床5min；弃去PBS上清溶液；每孔加入35μLPassive Lysis Buffer细胞裂解液，放置于摇床15min；将每孔裂解后的溶液20μL转移到L检测板上；按照说明书配置Luciferase Assay检测液，将L检测板放入SpectraMaxL化学发光读板机中读取数据，使用GraphPad 8.0计算50％抑制浓度(50％Inhibiting Concentration,IC50)。
4矢车菊素-3-O-半乳糖苷细胞毒性检测实验
(1)矢车菊素-3-O-半乳糖苷对MAGI-CCR5细胞毒性检测
MAGI-CCR5细胞用DMEM培养基(10％FBS、双抗，高糖，0.2mg/mL遗传霉素，0.1mg·mL-1潮霉素B，1μg·mL-1嘌呤霉素)，于CO2培养箱(37℃,含5％CO2)中培养，正常换液传代。以1×104个/孔密度接种于96孔板，每孔100μL。次日弃96孔板上清，将一定梯度稀的中药化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷100μL加入96孔板中，稀释梯度(V/V)为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μmol·L-1，不加中药化合物为空白对照组，每组3个复孔，培养48h后每孔加入CCK-8试剂10μL，37℃孵育1h，酶标仪测定OD值，使用GraphPad8.0计算50％毒性浓度(50％Cytotoxicity Concentration，CC50)。
(2)矢车菊素-3-O-半乳糖苷对LO2细胞毒性检测
LO2细胞用DMEM培养基(10％FBS、双抗，高糖)，于CO2培养箱(37℃,含5％CO2)中培养，正常换液传代。以8×103个/孔密度接种于96孔板，每孔100μL。次日弃96孔板上清，将一定梯度稀的中药化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷100μL加入96孔板中，稀释梯度(V/V) 为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μmol·L-1，不加中药化合物为空白对照组，每组3 个复孔，培养48h后每孔加入CCK-8试剂10μL，37℃孵育1h，酶标仪测定OD值，使用 GraphPad8.0计算50％毒性浓度(50％Cytotoxicity Concentration，CC50)。
5、矢车菊素-3-O-半乳糖苷与CCR5结合方式：
PYMOL1.0、Discovery Studio 2019可视化探究矢车菊素-3-O-半乳糖苷与CCR5受体复合物相互作用模式。其中MVC-CCR5构象作为对照，矢车菊素-3-O-半乳糖苷能与CCR5的疏水口袋紧密结合，主要的相互作用力包括氢键、范德华力及疏水作用等。矢车菊素-3-O-半乳糖苷-CCR5构象与MVC-CCR5构象相同的关键残基共13个，矢车菊素-3-O-半乳糖苷与关键残基Thr105、Ser180、Tyr251、Glu283形成4个氢键，表明以上关键残基在二者相互作用中发挥极为重要的作用。
6、统计学处理
运用SPSS20.0软件对所得数据进行正态分布检验，符合正态分布者采用单因素方差分析 (One-Way ANOVA)；不符合正态分布的数据转化以均数±标准差表示，显著性水准取α＝0.05。
7、结论
A260/A280吸光度下质粒PLAI、JRFL纯度分别为1.845、1.836，可用于转染实验。假病毒感染MAGI-CCR5细胞48h后，能够检测到荧光素酶的表达，假病毒倍比稀释后荧光素酶表达情况如图3，随着稀释倍数增加，假病毒感染强度递减。当假病毒滴度过高时，易抑制细胞生长(图4)，1：8稀释浓度开始，假病毒感染的细胞活性与空白对照组细胞活性无显著性差异(P>0.05)，阳性药物MVC在该假病毒模型中的IC50为1.85±0.34nmol·L-1，证明该假病毒模型可靠，因此本发明选用1︰8倍稀释假病毒浓度进行实验。
矢车菊素-3-O-半乳糖苷处理后的MAGI-CCR5细胞荧光素酶表达水平降低，表明能够拮抗假病毒感染MAGI-CCR5细胞；其IC50为(28.35±7.59)μmol·L-1(图5)。矢车菊素-3-O-半乳糖苷对MAGI-CCR5和LO2细胞具有较低的毒性，其对MAGI-CCR5细胞的CC50为(164.90±42.95)μmol·L-1(图6)，对LO2细胞的CC50为(329.80±24.35)μmol·L-1(图7)。
实验表明，本发明以CCR5为靶点，对TCMSP数据库中的已知中药化合物进行筛选，通过活性测试与细胞毒性实验初步筛选到矢车菊素-3-O-半乳糖苷这一具有潜在抗HIV活性的中药天然小分子化合物，并明确其抗病毒有效浓度范围，该中药天然小分子化合物矢车菊素-3-O-半乳糖苷可作为先导抗病毒化合物，通过下一步结构改造增加其抗病毒活性，为日后深入研究中药抗HIV作用提供前期技术支持，开拓了中药覆盆子天然小分子化合物矢车菊素 -3-O-半乳糖苷的新用途和覆盆子的药用价值和商业价值，有良好的经济和社会效益。