一种mep1b基因在制备检测或调控子宫内膜发育产品中的应用
阅读说明：本技术 一种mep1b基因在制备检测或调控子宫内膜发育产品中的应用 (Application of MEP1B gene in preparation of products for detecting or regulating endometrial development ) 是由 洪林君 吴珍芳 贺艳娟 杨化强 蔡更元 李紫聪 顾婷 杨杰 郑恩琴 徐铮 黄思秀 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,具体涉及一种MEP1B基因在制备检测或调控子宫内膜发育产品中的应用。本发明通过超表达MEP1B基因和沉默MEP1B基因进行CCK8实验、ki67检测细胞增殖实验及细胞周期实验均可表明MEP1B蛋白的表达能够促进猪子宫内膜上皮细胞的增殖功能,一方面MEP1B基因可作为妊娠标志物快速准确的检测猪妊娠状况,另一方面为精准调控子宫内膜发育、提高胚胎的成功附植提供了理论依据。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to an application of MEP1B gene in preparation of products for detecting or regulating endometrial development. According to the invention, both a CCK8 experiment, a ki67 cell proliferation detection experiment and a cell cycle experiment are carried out by over-expressing MEP1B gene and silencing MEP1B gene, which show that the expression of MEP1B protein can promote the proliferation function of porcine endometrial epithelial cells, on one hand, MEP1B gene can be used as a pregnancy marker to quickly and accurately detect the pregnancy condition of a pig, and on the other hand, theoretical basis is provided for accurately regulating and controlling the endometrial development and improving the successful implantation of an embryo.)
技术领域
本发明属于生物
技术领域
，具体涉及一种MEP1B基因在制备检测或调控子宫内膜发育产品中的应用。背景技术
母猪窝均产仔数是影响养猪业生产效率及经济效益的最重要的因素。相对于猪的生长性状，母猪的产仔数平均遗传力为0.1，用常规育种技术对产仔数这一低遗传力性状的遗传改良难以取得预期的实质性突破。如果能鉴定调控母猪产仔数的重要基因将可用于分子标记辅助选择或人工调控来提高母猪产仔数。在整个妊娠期间，猪的排卵数有20-28枚，但最终的产仔数只有10-18头，在妊娠的阶段胚胎的死亡率为30-50％，这30-50％的胚胎死亡率限制了母猪产仔数潜能的实现，同时也影响了猪场的经济效益。
在猪胚胎植入期间，子宫内膜上皮细胞呈柱状形状并紧密排列。子宫内膜上皮主要作为胚胎侵入的一个屏障，在非接受态时，子宫内膜上皮会阻止滋养层细胞侵袭，在接受态时，子宫内膜上皮与胎盘滋养层上皮紧密结合，形成母胎界面上皮双分子层。胚胎植入前，子宫处于非黏附的状态，大量的细胞表面抗粘附分子-多糖-蛋白质复合物在子宫内膜上皮细胞表达。植入过程中，子宫内膜上皮的多糖-蛋白复合物含量减少，使得子宫内膜上皮处于接受状态，降低空间阻碍，为胚胎与子宫内膜上皮细胞的粘附做好准备。附植期猪胚胎在子宫腔内呈长时间的游离状态，胚胎在第2天开始进入子宫腔内，在第9天胚胎发育成管状，第10-11天，发育成球形，第12天发育成细丝状，在10-11到12天这个阶段胚胎变化是最明显的，到15天，胚胎发育成较粗的线状并开始与子宫内膜相粘附，在子宫中固定位置；在第9天到12天的这个过程中，子宫内膜增厚并随妊娠时期的增加而呈现不同的状态。子宫内膜的厚度及发育状态影响胚胎的成功附植。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种MEP1B基因在制备检测或调控子宫内膜发育产品中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种抑制子宫内膜发育的抑制剂，该抑制剂包括子宫腔液总外泌体蛋白MEP1B抑制剂。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种MEP1B基因在制备检测或调控子宫内膜发育产品中的应用；
所述的MEP1B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述的子宫内膜发育包括妊娠早期子宫内膜发育；
所述的检测子宫内膜发育产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、DNA测序、免疫检测、原位杂交或基因芯片检测子宫内膜发育的产品；
所述的通过实时定量PCR检测子宫内膜发育的产品包括至少一对特异性扩增MEP1B基因的引物；
所述的特异性扩增MEP1B基因的引物优选为MEP1B-F和MEP1B-R，其核苷酸序列如下所示：
MEP1B-F：CTGCCGTGTTCGCCCTGATG；
MEP1B-R：TGCTGTATGTGAACCTGGCTCTTTAC；
所述的调控子宫内膜发育包括抑制子宫内膜发育；
所述的抑制子宫内膜发育包括抑制子宫腔液总外泌体蛋白MEP1B的表达；
所述的抑制子宫腔液总外泌体蛋白MEP1B的表达包括通过RNA干扰方法抑制子宫腔液总外泌体蛋白MEP1B的表达；
所述的抑制子宫腔液总外泌体蛋白MEP1B的表达的siRNA的核苷酸序列如下所示：
siRNA-MEP1B-2-sense：CCUGGCACAUAAGGAAUUUTT；
siRNA-MEP1B-2-antisense：AAAUUCCUUAUGUGCCAGGTT；
一种抑制子宫内膜发育的抑制剂，包括子宫腔液总外泌体蛋白MEP1B抑制剂；
所述的子宫腔液总外泌体蛋白MEP1B抑制剂，包含抑制子宫腔液总外泌体蛋白MEP1B表达的siRNA，其核苷酸序列如下所示：
siRNA-MEP1B-2-sense：CCUGGCACAUAAGGAAUUUTT；
siRNA-MEP1B-2-antisense：AAAUUCCUUAUGUGCCAGGTT；
所述的子宫内膜包括但不限于猪子宫内膜，还可以为牛、羊、鼠等其他动物的子宫内膜；
本发明的原理：
胚胎附殖过程中，胚胎和母体之间并不是以相互独立的个体存在的，胚胎和母体之间的生物因子交换，形成母体和胚胎间正确的信号交流。由于此时期胚胎长期游离于子宫腔液中，所以母胎间的信号交流必须依靠子宫腔液中的相关因子来完成，外泌体是一类直径为30-150nm的双层膜囊泡，能把所携带的蛋白质运输到靶细胞中发挥功能，远程行使细胞间信号传递的作用被认为是一种新型的细胞间信号交流方式。外泌体被证实存在于猪的子宫腔液中，它所携带的蛋白成分在子宫内膜与胚胎之间的信号交流中发挥着重要作用。然而具体的调控机制尚不清楚。
本发明通过研究妊娠早期猪子宫腔液总外泌体的蛋白成分在子宫内膜与胚胎之间信号交流的作用机制时，发现MEP1B蛋白的表达在妊娠早期的子宫内膜发育中随妊娠时间的增加而增加。通过超表达MEP1B基因和沉默MEP1B基因进行CCK8实验、ki67检测细胞增殖实验及细胞周期实验均可表明MEP1B蛋白的表达能够促进猪子宫内膜上皮细胞的增殖功能。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)早期的妊娠诊断可以确认配种后的母猪是否受孕，对于已经受孕的母猪要及时进行保胎，对于未孕母猪及时采取复配措施，缩短其空怀期，对于屡配不孕的母猪及早进行淘汰。B超诊断是目前猪场最普及的妊娠诊断方法，但B超诊断需要在母猪妊娠30天左右开展才能达到较高的准确性。为了在妊娠早期准确判定母猪妊娠状况，我们利用外泌体及其携带的MEP1B基因作为妊娠标志物以期快速准确的检测其妊娠状况。
(2)本发明通过超表达MEP1B基因和沉默MEP1B基因进行CCK8实验、ki67检测细胞增殖实验及细胞周期实验均可表明MEP1B蛋白的表达能够促进猪子宫内膜上皮细胞的增殖功能，进而为精准调控子宫内膜发育、提高胚胎的成功附植提供了理论依据。
(3)本发明提供了一对高效沉默MEP1B基因的siRNA，经沉默实验验证，该siRNA可以有效沉默猪子宫内膜上皮细胞MEP1B基因，为母猪产仔数潜能理论机理的研究以及猪育种的发展提供了基础和方向。
附图说明
图1是实施例1制得的妊娠12天猪子宫腔液总外泌体电镜鉴定和Western blot(蛋白CD9、CD63表达)检测结果分析图；其中，A：电镜鉴定结果，B：Western blot检测结果。
图2是利用NTA技术对实施例1制得的妊娠12天猪子宫腔液总外泌体进行分析检测的结果图。
图3是Western blot检测四个时期(C9、D9、D12、D15)猪子宫腔液总外泌体中MEP1B蛋白表达结果分析图。
图4是子宫内膜上皮细胞转染三对siRNA与NC干扰片段后qPCR检测结果分析图。
图5是CCK8检测超表达载体转染后的猪子宫内膜上皮细胞增殖结果分析图(P＜0.05)。
图6是Western Blot检测超表达载体转染后的猪子宫内膜上皮细胞中MEP1B蛋白和ki67蛋白表达的结果分析图(P＜0.05)。
图7是流式细胞仪检测超表达载体转染后的猪子宫内膜上皮细胞细胞周期的结果分析图(P＜0.05)。
图8是CCK8检测siRNA干扰后猪子宫内膜上皮细胞增殖结果分析图(P＜0.01)。
图9是Western Blot检测siRNA干扰后猪子宫内膜上皮细胞中MEP1B蛋白和ki67蛋白表达的结果分析图(P(MEP1B)＜0.01；P(ki67)＜0.05)。
图10是流式细胞仪检测siRNA干扰后猪子宫内膜上皮细胞细胞周期的结果分析图(p＜0.05)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 4个不同时期猪子宫腔液总外泌体的制备及鉴定
一、4个不同时期猪子宫腔液总外泌体的制备
(1)取大白母猪(由温氏三和屠宰场提供，每个时间3个重复，共12头)发情9天、妊娠9天、妊娠12天及妊娠15天的子宫；
(2)在一侧子宫上切1个小口，将冲胚管一端插入到这个小口并用注射器注入空气，使冲胚管在子宫腔中位置固定，冲胚管另一端用于50ml离心管收集PBS的冲洗液；
(3)将装有PBS的注射器注射到子宫腔中，夹紧注射口的上游部位，缓慢地将PBS注入到子宫腔中，用手轻轻挤压使PBS冲洗液流向冲胚管方向；重复上述操作几次，及时收集子宫腔液；另一侧的子宫采用同样的方法收集子宫腔液，最后合并两侧子宫的子宫腔液并及时放-80℃保存；
(4)将收集的子宫腔液4℃、2000g离心20min，弃沉淀，保留上清；
(5)将上清转移到新的离心管中，4℃、8000g离心40min，弃沉淀，保留上清；
(6)将上清转移到超离管中，4℃、100000g离心2h，所得到的沉淀为猪子宫腔液总外泌体，并收集上清放-80℃保存；
二、4个不同时期猪子宫腔液总外泌体的鉴定
(1)电镜鉴定外泌体
将步骤一制得的猪子宫腔液总外泌体用PBS重悬，得到猪子宫腔液总外泌体重悬液；然后取10μl重悬液滴于铜网上；再取10μl铀溶液与上述10μl重悬液混匀，室温下负染2min，自然风干；最后透射电镜80KV下观察。
步骤一制得的4个不同时期的猪子宫腔液总外泌体均符合外泌体30-150nm形态特征的双层膜囊泡，其中，图1A为妊娠12天的猪子宫腔液总外泌体。
(2)Western blot检测蛋白CD9、CD63的存在
①将步骤一制得的猪子宫腔液总外泌体取出30μl，转移至1.5ml离心管中。加入300μl样品裂解液，再加入蛋白酶抑制剂PMSF使其终浓度为1mM；然后冰上超声破碎：功率80W，超声1.0s，关闭1.0s，共3min；超声后将溶液在室温下12000×g离心10min，取上清，并再次离心取上清；上清即为样品的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用，其中，发情9天(C9)样品的总蛋白溶液的浓度为0.873μg/μL，妊娠9天(D9)样品的总蛋白溶液的浓度为1.564μg/μL，妊娠12天(D12)样品的总蛋白溶液的浓度为1.853μg/μL，妊娠15天(D15)样品的总蛋白溶液的浓度为2.201μg/μL；
②将玻板和梳子用洗洁精进行清洗，再用超纯水清洗放于烘箱中烘干，制作质量体积比为12％的分离胶和质量体积比为5％的浓缩胶；上样，每孔上样量为30μg；
③安装电极，接通电源，电压调到80V、30min左右；再将电压调到100V、60min左右；
④将纤维素性膜浸在装有甲醇的平皿中活化，将玻璃板放置在装有转膜液的托盘中，轻轻撬掉玻璃板，切胶；
⑤将纤维素性膜、胶、滤纸、薄海绵制作成“三明治”样的结构，转膜装置上叠放的顺序为：负极、薄海绵、滤纸、胶、纤维素性膜、滤纸、薄海绵、正极，夹紧；将其放于电泳槽中，倒入转膜液以及放入冰袋，将电泳槽放置在4℃冰箱中；
⑥安装电极，接通电源，电压调到110V、60min左右，转膜结束后，取出纤维素性膜放在装有TBST的培养皿中，TBST洗6次，每次5min；
⑦用质量分数为5％的脱脂奶粉封闭，封闭时间为2.5h；再将封闭后的膜用TBST洗6次，每次5min；
⑧加一抗CD9(兔抗，ab236630，abcam)、CD63(兔抗，ab134045，abcam)孵育，放于4℃冰箱孵育过夜；孵育后用TBST洗6次，每次5min；
⑨加二抗(山羊抗兔，GB23303，Servicebio)孵育，于室温，摇床上孵育1.5h；孵育后用TBST洗6次，每次5min；
⑩在暗室中将发光液滴在膜上，将膜浸泡在发光液上1min，在曝光仪上曝光。
本实施例制得的4个不同时期的猪子宫腔液总外泌体样品均可成功检测到标志蛋白CD9和CD63的表达，其中，图1B为妊娠12天的猪子宫腔液总外泌体样品的Western blot检测结果。
(3)利用NTA技术对猪子宫腔液总外泌体进行鉴定
使用纳米粒径分析仪对悬浮于PBS中的猪子宫腔液总外泌体进行纳米颗粒跟踪分析，具体方法为：取适量步骤(1)制得的猪子宫腔液总外泌体重悬液用PBS进一步稀释，将浓度调整为每毫升2-6×108粒。视频记录30s，在此期间，分析软件跟踪每个可见的粒子。利用斯托克斯-爱因斯坦方程进行测定样品中粒子的分布和数量。
结果表明：4个不同时期的猪子宫腔液总外泌体的粒径均在30-150nm之间，其中，图2为妊娠12天的猪子宫腔液总外泌体样品的结果分析图。
三、4个不同时期猪子宫腔液总外泌体候选蛋白的选取
(1)通过iTRAQ蛋白组学(送检公司为鹿明生物公司)鉴定发情9天、妊娠9天、妊娠12天和妊娠15天子宫腔液总外泌体的蛋白成分及相对表达量，发现MEP1B蛋白在妊娠12天和妊娠15天的相对表达量较高。因此，选取MEP1B进行功能上的研究。
(2)Western blot检测MEP1B蛋白表达，具体方法同步骤二(2)，其中，一抗为单克隆大鼠MEP1B(MAB28951，R&D)，二抗为山羊抗大鼠(GB23302，Servicebio)；
Western blot检测结果见图3，四个时期(C9、D9、D12、D15)的猪子宫腔液总外泌体中MEP1B蛋白的表达在妊娠15天表达最高。因此，选取MEP1B做为后续功能研究。
实施例2超表达载体pDouble Ex-EGFP-MEP1B的构建
(1)用EcoRⅠ与XhoⅠ对pDouble Ex-EGFP(+)真核表达载体(购自长沙赢润生物技术有限公司)进行双酶切，具体反应体系(50μl)为：EcoRⅠ2.5μl，XhoⅠ2.5μl，pDouble Ex-EGFP(+)2.5μl，FD Buffer 10μl，ddH2O 32.5μl；反应程序为：37℃酶切2h；酶切后用质量体积比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果并回收目的片段；
(2)提取大白母猪(由温氏三和屠宰场提供)妊娠12天子宫内膜的cDNA，以该cDNA为模板，用分别含有EcoRⅠ与XhoⅠ酶切位点的特异性上下游引物(MEP1B-F：CCGGAATTCATGGATTCTTGGTATCTGCCTTCGT；MEP1B-R：CCGCTCGAGTCACAGTGCATATTGATTTTCCAGAGT)进行PCR扩增，扩增体系：cDNA 模板1μl，上游引物(10μM)：0.5μl，下游引物(10μM)：0.5μl，2×PhantaMaster Mix：5μl，RNase-free Water 3μl；扩增程序：94℃5min预变性；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，40个循环；72℃5min，16℃5min；扩增后用质量体积比为0.8％的琼脂糖凝胶电泳回收目的片段；取3μg的目的片段进行双酶切(具体方法同步骤(1))，酶切后通过质量体积比为0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行回收；
(3)将步骤(2)酶切回收后的目的片段和步骤(1)酶切回收后的pDouble Ex-EGFP(+)载体采用T4 DNA Ligase连接，连接体系(10μl)为：目的片段回收产物1μl，pDouble Ex-EGFP(+)回收产物2μl，T4 DNA Ligase 1μl，T4 DNA Ligase buffer 2μl，ddH2O 4μl；连接程序为：4℃过夜连接；
(4)连接产物转化采用北京全式金生物公司的Trans5α感受态细胞进行转化，其具体操作步骤如下：
①取50μl冰浴上融化的感受态细胞，加入目的DNA，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；
②42℃水浴中热激45s，然后快速将其转移至冰浴中2min，该过程不要摇动离心管；
③向离心管中加入500μL无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃、200rpm摇床中复苏1h；
④根据实验要求，吸取适量体积已转化的感受态细胞加到含卡纳抗性的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开；
⑤将平板置于37℃培养箱中正放培养30min，倒置平板，过夜培养；随后在超净工作台中用灭菌枪头从抗性平板中挑取单克隆菌落到500μL含有卡纳霉素的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床扩大培养4-6h，取培养后的菌液1μL为模板，以分别含有EcoRⅠ与XhoⅠ酶切位点的上下游引物特异性引物(MEP1B-F：CCGGAATTCATGGATTCTTGGTATCTGCCTTCGT；MEP1B-R：CCGCTCGAGTCACAGTGCATATTGATTTTCCAGAGT)进行PCR扩增；扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，确定阳性克隆后参照OMGEA公司的Endo-free Plasmid Mini KitⅡ试剂盒的说明书提取去内毒素质粒，吸取一部分送公司测序。利用NCBI网站中的BLASTn比对测序结果，鉴定序列是否正确，最后成功获得超表达载体pDouble Ex-EGFP-MEP1B，置于-20℃冰箱备用，其中，MEP1B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
MEP1B基因的核苷酸序列：
ATGGATTCTTGGTATCTGCCTTCGTTTCTGTTCGTTGCTGCCCTCCTCCTGGTTTCTGGCTTGCCAGCTCCAGAAAACTTCGACGTAGATGGTGGACTTGACCGGGATATATTTGATATCAATGAAGATTTGGGACTGGATCTTTTTGAGGGAGACATCAGTCTTGATGGGGTACAAGAAAGAAATTCCATCGTTGGAGAAGGATATAGGTGGCCTCATACTATTCCATATGTTCTAGACGATAGCTTGGAAATGAATGCCAGAGGAGTTATCCTGGAGGCATTTGAACGCTATCGCCTGAAAACATGCATTGACTTCAAGCCTTGGTCTGGAGAAGCCAACTATATATCGGTGTTCAAGGGCAGTGGCTGCTGGTCTTCAGTGGGAAATCAGCACGTTGGGAAGCAAAATCTCTCCATTGGACATAACTGTGACAGAACAGCAACCGTTCAACATGAATTTCTCCATGCACTGGGATTCTTTCATGAGCAGTCGCGATCTGACCGAGATGACTATGTCAGCATAATATGGGACAGAATTACTCCAGGCAAAGAGAACAATTTTAAAGCCTATACTGACGAAGAAACGGATTCCCTGAATGTTCCCTATGATTACAACTCAGTAATGCACTACAGTAAAACTGCATTCCAGATTGGATCAGAACCAACAATTGTGACAAGAATCTCAGACTTCATGGATGTGATCGGCCAGCGATTGGATTTCAGTGACCATGATCTCTTAAAGTTGAATCGACTCTATAACTGCTCCTCTTCCTTGAGCTTTATGGACTCGTGCGATTTTGAACTGGAAAACGTGTGTGGTATGATTCAAAGTTCAGAAGATAGTGCTGACTGGCAGCGGGTCTCCCAGGTTCCCGAGGGGCCAGAGAGCGATCACTCCAACATGGGCCAGTGCAAAGGTTCTGGCTTCTTCATGCATTTCAGCAGCAGCTCTGTAAATGTCGGGGACACAGCAGTGCTGGAAAGTAGAAAACTCTACCCCAAACGAGGTTTTCAGTGCCTGCAGTTCTTTTTATATAACAGTGGACATGAAAATGACCAGCTGGACATCTATATCCGGGAGTATTCTGGAGACAATGTGAACGGTATTCTAATCCTTGTGGAAGAAATAAAAGATATACCCCTTGGGAGCTGGCAGCTTTACCACGTTACATTGAAGGTGACCAACAAATTTAGAGTAGTGTTTAGAGGGGTCAGAGGTGCTGGTGACTCACTGGGTGGCCTGTCTATCGATGACATCAATCTTTCAGAAACACAGTGCCCTCATCATACCTGGCACATAAGGAATTTCACACAGTACCTTAGCGACCCCAATGGAGCTCTGTTTAGCCCTCCATTTTATTCGTCTAAAGGTTATGCCTTTCAGATTTACATGACCCTAACCAATTTGACTAAGATAGGAATTTATTTCCACTTGATCTCTGGAGCCAATGATGATCAGTTACAGTGGCCGTGTCCTTGGCAACAAGCCACGATGACAATCTTGGATCAGAATCCTGACATTCGACAGCGTATGTCCAACGGGCGGAGTATAACCACAGACCCCTCTTTGACCTCGGATGACGGAACCTATTTTTGGGACAGGCCTTCCAAAGTGGGAACAGAAGCTTTTTTCCCAAATGGAACTCAATTTAAAAGAAGTAGAGGCTATGGATCCAGTTCCTTTATAACCTATGAGAGGCTGAAGAGCAGGGATTTTATCAAAGGAAATGATGTTTACATCCTACTGACAGTGGAAGACATATCCCACCTTAATTCTACACAAGACGAACCAGTCCCAACCTCAAGTGTCAGTGACCTTTGCGCATTCTTCAGGTGTGAGAATGATGGCATCTGCCTTGTCCGAAATGGCAACGCCGAGTGCAGGTGTCCCTCAGGGGAAGACTGGTGGTACATGGGGAAAAGGTGTGAAAAGAGAGGCTCCAGGAGAGACACCATTGTCATCGCCACTTCTTCCACTGCTGCCGTGTTCGCCCTGATGCTGGTCATCACCCTTGTCAGTGTCTACTGTACCCGGAAGAAGTATCGTAAAGAGCCAGGTTCACATACAGCAAATACGACTCTGGAAAATCAATATGCACTGTGA
实施例3MEP1B基因siRNA的设计与合成
一、在美国国立生物研究所网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查找猪MEP1B基因(NCBI Reference Sequence:XM_003127883.5)的CDS区域序列，利用BlOCK-iTRNAiDesigner软件(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do)，针对猪MEP1B基因不同靶位点设计3对siRNA，并设计阴性对照siRNA-NC(序列如表1所示)，序列由苏州吉玛基因有限公司合成。
表1猪MEP1B基因siRNA序列
二、三对siRNA与NC干扰片段的细胞转染
(1)猪子宫内膜上皮细胞的分离方法：采摘新鲜的大白母猪子宫(未妊娠)，在超净台中剪开子宫，采取子宫内膜；将采取的子宫内膜组织用PBS冲洗一遍，剪成1mm3的小块并用PBS洗一遍，500g离心5min，弃上清；加沉淀2倍体积的浓度为0.1mg/ml的胶原蛋白酶I，消化2.5h，期间每30min晃动数次；加等体积培养液，终止消化；细胞过筛(100目细胞筛)后500g离心5min，取上清到一新管，沉淀为猪子宫内膜上皮细胞，添加培养基(79％F12+20％FBS+1％双抗)，24h后换液；
(2)转染前一天，将形态良好、生长旺盛的猪子宫内膜上皮细胞接种至6孔细胞培养皿中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞的密度达到70-80％时按照表2的转染体系进行转染；具体转染方法如下：
表2 siRNA转染体系
①用150μL Opti-DEMETM培养基稀释9μL RNAiMAXReagent试剂并充分混匀；
②用150μL Opti-DEMETM培养基稀释3μL siRNA(30pmol)干涉片段制备预混液并充分混匀；
③将①②中液体按体积比为1:1混匀，室温孵育5min；
④将③中混合液体加入至细胞培养孔中，轻轻摇匀，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；
⑤培养4-6h后，吸弃转染混合液，加入完全培养基继续培养。
(3)培养48h后，进行qPCR实验，所用目的基因引物(MEP1B-F：CTGCCGTGTTCGCCCTGATG；MEP1B-R：TGCTGTATGTGAACCTGGCTCTTTAC)，内参基因引物β-actin(F：CCACGAGACCACCTTCAACTC；R：TGATCTCCTTCTGCATCCTGT)，所述的荧光定量PCR的体系为：cDNA模板1μL；上下游引物分别为0.5μL；Green qPCR SuperMix 5μL；RNase-free Water 3μL；所述的荧光定量PCR的程序为：94℃预变性30sec；94℃5sec，60℃30sec，40个循环；94℃15sec，60℃1min，94℃15sec。
结果如图4所示，对子宫内膜上皮细胞转染三对siRNA与NC干扰片段后，发现siRNA-MEP1B-2对细胞MEP1B基因的表达干扰效率最高，因此，用siRNA-MEP1B-2进行后续实施例5实验。
实施例4MEP1B基因超表达载体pDouble Ex-EGFP-MEP1B在猪子宫内膜上皮细胞增殖中的作用
一、超表达载体pDouble Ex-EGFP-MEP1B的细胞转染
(1)转染前一天，将形态良好、生长旺盛的猪子宫内膜上皮细胞接种至细胞培养皿中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞的密度达到70-80％时按照表3的转染体系进行转染，实验组转染实施例2制得的pDouble Ex-EGFP-MEP1B质粒，对照组转染pDouble Ex-EGFP质粒；具体转染方法如下：
表3超表达载体转染体系
①用Opti-DEMETM培养基稀释Invitrogen公司的LipofectamineTM 3000试剂并充分混匀，室温静置5min；
②用Opti-DEMETM培养基稀释pDouble Ex-EGFP-MEP1B制备预混液，然后添加P3000TM试剂并充分混匀，室温静置5min；
③将①②中的液体按体积比为1：1混匀，室温孵育15min；
④将③中混合液体加入至细胞培养孔中，轻轻摇匀，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；
⑤培养4-6h后，吸弃转染混合液，加入完全培养基继续培养。
(2)CCK8检测细胞增殖
实验前，将猪子宫内膜上皮细胞以每孔约5×103的数量接种于96孔板中于37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞的密度达到70-80％，转染0.2μg pDouble Ex-EGFP-MEP1B(方法同步骤(1))，转染24h后加入CCK8试剂于37℃、5％CO2的培养箱中孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
结果如图5所示，转染pDouble Ex-EGFP-MEP1B组细胞吸光值率高于对照组(P＜0.05)，说明上调MEP1B蛋白的表达促进了猪子宫内膜上皮细胞的增殖。
(3)ki67增殖蛋白的检测
实验前，将猪子宫内膜上皮细胞以每孔约3×104的数量接种于6孔板中于37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞的密度达到70-80％，转染5μg pDouble Ex-EGFP-MEP1B(方法同步骤(1))，转染72h后通过Western Blot检测MEP1B蛋白和ki67蛋白的表达，其中，MEP1B蛋白：一抗为单克隆大鼠MEP1B(MAB28951，R&D)，二抗为山羊抗大鼠(GB23302，Servicebio)；ki67蛋白：一抗为兔单克隆抗体ki67(ab92742，abcam)，二抗为山羊抗兔(GB23303，Servicebio)。
结果如图6所示，转染pDouble Ex-EGFP-MEP1B组细胞MEP1B蛋白和细胞增殖蛋白ki67蛋白的表达高于对照组(P＜0.05)，说明上调MEP1B基因的表达促进了猪子宫内膜上皮细胞的增殖。
(4)超表达载体pDouble Ex-EGFP-MEP1B对猪子宫内膜上皮细胞细胞周期的调控
实验前，将猪子宫内膜上皮细胞以每孔约3×104的数量接种于6孔板中于37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞的密度达到70-80％时，转染5μg pDouble Ex-EGFP-MEP1B(方法同步骤(1))，转染72h后通过体积分数为70％的酒精对消化的子宫内膜上皮细胞进行固定，之后用pi染液对固定的细胞进行染色，染色半小时内上流式细胞仪检测。
结果如图7所示，转染pDouble Ex-EGFP-MEP1B组细胞S期阳性率高于对照组(P＜0.05)，说明上调MEP1B基因的表达促进了猪子宫内膜上皮细胞S期增长。
上述超表达结果总体说明了超表达MEP1B促进猪子宫内膜上皮细胞的生长。
实施例5siRNA抑制MEP1B基因表达后抑制猪子宫内膜上皮细胞的增殖
(1)siRNA干扰片段的细胞转染
转染前一天，将形态良好、生长旺盛的猪子宫内膜上皮细胞接种至细胞培养皿中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞的密度达到70-80％时进行转染，转染体系如表2所示；转染方法如下：
①用Opti-DEMETM培养基稀释RNAiMAXReagent试剂并充分混匀；
②用Opti-DEMETM培养基稀释siRNA-MEP1B-2(30pmol)干涉片段制备预混液并充分混匀；
③将①②中液体按体积比为1:1混匀，室温孵育5min；
④将③中混合液体加入至细胞培养孔中，轻轻摇匀，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；
⑤培养4-6h后，吸弃转染混合液，加入完全培养基继续培养。
(2)CCK8检测细胞增殖
实验前，将猪子宫内膜上皮细胞以每孔约5×103的数量接种于96孔板中于37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞的密度达到70-80％时进行转染，转染5pmol的siRNA-MEP1B-2和siRNA-NC(方法同步骤(1))，转染24h后加入CCK8试剂于37℃、5％CO2的培养箱中孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
结果如图8所示，转染si-MEP1B-2组细胞吸光值率低于对照组(P＜0.01)，说明干扰MEP1B基因的表达抑制了猪子宫内膜上皮细胞的增殖。
(3)ki67增殖蛋白的检测
实验前，将猪子宫内膜上皮细胞以每孔约3×104的数量接种于6孔板中于37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞的密度达到70-80％时进行转染，转染30pmol的siRNA-MEP1B-2和siRNA-NC，转染72h后通过Western Blot检测MEP1B蛋白和ki67蛋白的表达(具体抗体同实施例4)。
结果如图9所示，转染si-MEP1B-2组细胞MEP1B蛋白和ki67蛋白的表达低于对照组(P(MEP1B)＜0.01；P(ki67)＜0.05)，说明干扰MEP1B基因的表达抑制了猪子宫内膜上皮细胞的增殖。
(4)siRNA干扰片段对猪子宫内膜上皮细胞细胞周期的调控
实验前，将猪子宫内膜上皮细胞以每孔约3×104的数量接种于6孔板中于37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞的密度达到70-80％时进行转染，转染30pmol的siRNA-MEP1B-2和siRNA-NC，转染72h后通过体积分数为70％的酒精对消化的子宫内膜上皮细胞进行固定，之后用pi染液对固定的细胞进行染色，染色半小时内上流式细胞仪检测。
结果如图10示，转染siRNA干扰片段组细胞S期阳性率低于对照组(p＜0.05)，说明干扰MEP1B基因的表达抑制了猪子宫内膜上皮细胞S期增长。
上述沉默结果总体说明了沉默MEP1B抑制猪子宫内膜上皮细胞的生长。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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<110> 华南农业大学
<120> 一种MEP1B基因在制备检测或调控子宫内膜发育产品中的应用
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