具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：获得β半乳糖苷酶(本发明中称为：B17_2)

1、β半乳糖苷酶B17_2的重组表达载体的构建：

根据基因和表达载体pET28a的序列特点，采用在线软件NEBcutter V2.0和GenScrip进行引物设计：

PrimerF：AAAAAACATATGACTACTCGTAGAACGTTCAGG

PrimerR：GTGGTGCTCGAGTTAGCAGGACGTTTTAGCG

以双歧杆菌B.longum020402菌株的基因组为模板，使用High-Fidelity DNA Polymeras(New England Biolabs)通过PCR扩增获得B17_2的DNA片段，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，PCR体系如下：

表1

PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃解链30s，72℃退火2min，72℃延伸10min，32个循环。

将质粒pET28a与纯化后的PCR产物同时双酶切。酶切体系为：PCR纯化产物/质粒20μL，内切酶NdeI 2μL，内切酶XhoI 2μL，buffer 5μL，无菌水21μL。酶切条件为37℃/1.5h。将酶切后的质粒和PCR产物纯化后用T4连接酶进行连接，连接条件为室温2h。将连接产物用热激法转化DH5α质粒构建重组菌株，涂布于LB(含卡那霉素)平板，过夜培养后，挑取阳性菌落，经PCR检测后送测序验证(上海生工生物有限公司)与基因核苷酸序列对比。选取无突变的重组质粒用热激法转化BL21表达菌株。

2、重组β半乳糖苷酶B17_2的制备：

将含有重组质粒的BL21表达菌株接种于含有卡那霉素的SB液体培养基中，37℃震荡培养4～6h，随后将摇床温度降至18℃，继续培养30min后加入200μL浓度为1mol/L的IPTG，再继续培养48～72h。培养好的菌液低温高速(9000×g，4℃，20min)离心收集菌体，然后用35mL裂解液(1mol/L NaCl,50mmol/LNaH₂PO₄,70mmol/L Na₂HPO₄ and 50mmol/L咪唑,pH＝7.6～7.8)重悬于50mL离心管中，再加入0.2g溶菌酶进行裂解，随后放入-80℃冰箱冻存。冻存12h后从-80℃冰箱取出菌悬液自然解冻后，用超声破碎仪进行间歇破碎(600W，40～50min)至菌液不再浑浊。将破碎后的液体转移至高速离心管中进行低温高速离心(4℃，24000×g，30min)，之后小心将上清液吸出并用0.8μm的滤膜进行过滤。取出在4℃条件下冷藏保存的蛋白纯化镍柱，首先用裂解液(约50mL)平衡柱子。再将过滤后的蛋白溶液以速度为3mL/min进行上柱，上柱完成后以速度为5mL/min进裂解液除去柱缝隙间的杂蛋白。之后将洗涤液换成洗脱液(150mmol/L NaCl,150mmol/L NaH₂PO₄,50mmol/L Na₂HPO₄ and200mmol/Limidazole,pH＝7)，速度可保持不变。纯化的酶用交换液(100mmol/L NaCl,100mmol/L NaH₂PO₄ and 50mmol/L Na₂HPO₄,pH＝7.2)透析。蛋白经SDS-PAGE检测样品分子量为75kDa，纯度大于90％(图1)。

实施例2：重组β半乳糖苷酶B17_2的序列分析

经分析后发现本发明重组β半乳糖苷酶B17_2的一级结构由719个氨基酸组成，其具体氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。将其与NCBIblastp中的序列比较表明数据库中已经存在该酶的序列，但没有相关的表征。蛋白质保守结构域的比较表明酶B17_2的结构由属于GH42家族的β-半乳糖苷酶(氨基酸序列25-398)和β-半乳糖苷酶形成几种聚合物的结构域(氨基酸序列411-622)组成(图2)。

将B17_2的一级序列与GH42家族的其他β-半乳糖苷酶的一级序列进行比较(图3)，后者的序列属于碳水化合物数据库的GH42家族且属于双歧杆菌。比对结果显示存在一系列保守的氨基酸残基，P28、D39、A46、G47、N49、W58、D75、D78、T93、P97、W99、P106、G114、G120、R122、P130、N160、E161、N193、A195、W201、P214、F235、D238、T262、D288、Y290、W329、G339、A350、G352、D354、E369、G393、W424、D457、P460、Y468、P474、G494、G495、D507、P518、G530、A601、G610、L619和G658，它们是100％保守的。在这些绝对保守的氨基酸残基中，E161是关键催化位点，E321也是关键催化位点。此外，与ABI35985.1(来自嗜热栖热菌Thermusthermophiles的β-半乳糖苷酶)相比表明R122和N160可能是结合位点，Y170可能是金属结合位点，N332可能是催化点(图4)，同时ABE95118.1与B17_2的相似度为86.90％。

实施例3：重组β半乳糖苷酶B17_2水解活性

将1min内水解ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷，作为β-半乳糖苷酶的底物)释放1μmol ONP(邻硝基酚)的酶量作为一个活力单位1U。组β半乳糖苷酶B17_2和商业β-半乳糖苷酶(Diamond，China)，酶浓度分别为0.87μg/mL和0.044mg/mL，加入含2mmol/L ONPG的PBS缓冲溶液反应体系中，于不同温度下反应，测定温度对酶活力的影响。重组β-半乳糖苷酶B17_2和商业β-半乳糖苷酶，加入含2mmol/L不同pH值的oNPG的缓冲溶液反应体系中，于最适温度下反应，测定pH值对酶活力的影响。在最适pH条件下，重组β半乳糖苷酶B17_2和商业β-半乳糖苷酶在不同温度下保温不同时间后，加入含2mmol/L的oNPG溶液反应体系中，于最适温度下测定酶的温度稳定性。在最适温度条件下，重组β-半乳糖苷酶B17_2和商业β-半乳糖苷酶加入不同pH缓冲溶液保温30min后，加入含2mmol/L oNPG的各自最适pH缓冲溶液反应体系中，测定酶的酸碱耐受性。以PBS缓冲液中oNP的410nm处的吸光度制作标准曲线。

结果表明β-半乳糖苷酶B17_2的最适温度为45℃，最适pH＝5.5(图5A，B)，有良好的pH耐受性(将酶原液与不同pH值的缓冲溶液37℃保温30min后测定残留酶活)，特别是在pH＝4.0～9.0的范围内几乎都能保持80％及以上的活性(图5E)。β-半乳糖苷酶B17_2水解ONPG(图6A)，比活力为3826.28±137.56U/mg，Km为1.75±0.2mmol/L，kcat为5127±183s-1，kcat/Km为2928mM·s-1。而商业β-半乳糖苷酶最适温度为45℃，最适pH＝7.0(图5A，B)，对酶反应温度敏感(图5C)且对pH不耐受。商业β-半乳糖苷酶水解ONPG(图6B)，比活力57.02±1.50U/mg，Km为0.34±0.04mmol/L。

实施例4：重组β半乳糖苷酶B17_2对牛乳和酸性乳清中的乳糖降解率

重组β半乳糖苷酶B17_2，加入牛乳或酸性乳清，在45℃下反应10min。采用3，5-二硝基水杨酸DNS法测定酶活力。将1min水解乳糖产生1μmol还原糖的酶量作为一个活力单位1U。

结果表明重组β半乳糖苷酶B17_2在牛乳中降解乳糖的比活力为2.34±0.19U/mg，在酸性乳清(pH＝3.6)中的比活力为4.84±0.78U/mg。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一种源于双歧杆菌的β-半乳糖苷酶及其应用

<130> 8.13

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 719

<212> PRT

<213> 双歧杆菌

<400> 1

Met Thr Thr Arg Arg Thr Phe Arg Trp Pro Ser Leu Leu Thr Glu Ser

1 5 10 15

Gly Arg Gly Ile Ala Phe Gly Gly Asp Tyr Asn Pro Asp Gln Trp Ser

20 25 30

Glu Glu Thr Leu Asp Glu Asp Ile Arg Leu Met Val Gln Ala Gly Val

35 40 45

Asn Thr Val Ala Leu Ala Ile Phe Ser Trp Asp Lys Ile Glu Pro Arg

50 55 60

Glu Gly Glu Phe Thr Phe Glu Trp Leu Asp His Val Ile Asp Lys Leu

65 70 75 80

Gly Ala Ala Gly Ile Ala Val Asp Leu Ala Ser Ala Thr Ala Thr Ala

85 90 95

Pro Leu Trp Leu Tyr Glu Arg His Pro Glu Val Leu Pro Ile Asp Arg

100 105 110

Tyr Gly His Val Val Asn Ala Gly Ser Arg Gln Ser Trp Gln Pro Thr

115 120 125

Ser Pro Val Leu Lys Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Cys Arg Lys Leu Ala

130 135 140

Glu His Tyr Lys Asp Asn Pro Tyr Val Thr Ala Trp His Met Gly Asn

145 150 155 160

Glu Tyr Gly Trp Asn Asn Arg Tyr Asp Tyr Ser Asp Asn Ala Leu Ala

165 170 175

Ala Phe Arg Thr Trp Cys Glu Ala Lys Tyr Gly Thr Val Asp Ala Leu

180 185 190

Asn Glu Ala Trp Gly Thr Ala Phe Trp Ser Gln His Val Asn Ser Phe

195 200 205

Asp Glu Val Leu Leu Pro Arg His Met Gly Gly Asp Ser Met Val Asn

210 215 220

Pro Pro Gln Gln Leu Asp Tyr Glu Arg Phe Gly Asn Asp Met Leu Leu

225 230 235 240

Asp Phe Tyr Lys Ala Glu Arg Asp Ala Ile Glu Glu Ile Cys Pro Gly

245 250 255

Lys Pro Phe Thr Thr Asn Phe Met Val Ser Thr Asp Gln Cys Thr Met

260 265 270

Asp Tyr Ala Gln Trp Ala Asn Glu Val Asp Phe Val Ser Asn Asp His

275 280 285

Tyr Phe His Glu Gly Glu Ser His Leu Asp Glu Leu Ala Cys Ser Asp

290 295 300

Ala Leu Met Asp Ser Leu Ala Leu Gly Lys Pro Trp Tyr Val Met Glu

305 310 315 320

His Ser Thr Ser Ala Val Gln Trp Lys Pro Leu Asn Met Arg Lys Arg

325 330 335

Ala Gly Glu Leu Met Arg Asp Ser Leu Ala His Val Ala Met Gly Ala

340 345 350

Asp Ala Ile Asn Phe Phe Gln Trp Arg Gln Ser Ala Ser Gly Ala Glu

355 360 365

Ala Phe His Ser Ala Met Val Pro His Ala Gly Ser Asp Thr Lys Leu

370 375 380

Phe Arg Gly Val Cys Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Thr Leu Ser Asp

385 390 395 400

Ala Gly Val Gln Asp Thr Glu Leu Lys Arg Ala Asp Thr Ala Ile Leu

405 410 415

Phe Ser Ala Glu Ser Glu Trp Ala Thr Arg Ser Glu Thr Leu Pro Ser

420 425 430

Met Lys Leu Asn His Trp His Asp Val Arg Asp Trp Tyr Arg Gly Tyr

435 440 445

Leu Asp Ala Gly Ala Arg Ala Asp Val Val Pro Leu Ala Tyr Asp Trp

450 455 460

Ser Gly Tyr Gln Thr Ile Val Leu Pro Thr Val Ile Ala Leu Ser Asp

465 470 475 480

Glu Asp Thr Arg Arg Ile Ala Asp Phe Ala Glu Asn Gly Gly Thr Val

485 490 495

Ile Val Gly Tyr Ala Thr Gly Leu Ile Asp Glu His Phe His Ile Gly

500 505 510

Leu Gly Gly Tyr Pro Gly Ala Gly Asn Gly Leu Leu Arg Asp Met Leu

515 520 525

Gly Ile Arg Ser Glu Glu Phe Asn Ile Leu Gly Glu Glu Ala Glu Asp

530 535 540

Glu Pro Ala Glu Ile Gly Leu Ser Asn Gly Leu Thr Thr Arg Leu Trp

545 550 555 560

Gln Asn Asp Val Thr Ser Val Ala Pro Asp Thr Arg Val Leu Ala Thr

565 570 575

Tyr Val Gly Thr Ala Ala Ala Asp Trp Glu Leu Asp Gly Val Pro Ala

580 585 590

Ile Thr Ser His Pro His Gly Gln Gly Ala Ala Ile Tyr Val Gly Cys

595 600 605

Asp Leu Gly Arg His Asp Ile Thr His Leu Leu Lys Glu Leu Asn Thr

610 615 620

Thr Ala Pro Ser Asp Glu Arg Ala Pro Asp Gln Arg Pro Gly Gly Gly

625 630 635 640

Glu Ile Asn Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Thr His Asp Pro

645 650 655

Arg Ile Leu His Thr Ile Arg Gln Ser Ser Asp Gly Thr Ile Arg Phe

660 665 670

Asp Phe Tyr Leu Asn Arg Ser Lys Gln Pro Val Ala Val Asn Gly Val

675 680 685

Glu Gly Asp Pro Ile Ile Ala His Arg Cys Glu Thr Asp Ala Val Gly

690 695 700

Tyr Thr Leu Asn Arg Asn Ala Ile Leu Ile Ala Lys Thr Ser Cys

705 710 715

<210> 2

<211> 2160

<212> DNA

<213> 双歧杆菌

<400> 2

atgactactc gtagaacgtt caggtggccg tccctgctga ctgaatccgg tcgtggcatc 60

gcgttcggcg gcgactacaa tccggaccag tggtccgagg agacgctgga cgaggacatc 120

cgcctgatgg tccaagccgg cgtcaacacc gtggccctcg ccatcttcag ctgggacaag 180

atcgaaccgc gcgagggcga gttcacgttc gagtggcttg accacgtgat cgacaagctc 240

ggcgcggcag gcatcgccgt ggacctggca tcggccactg ccacggcccc gttgtggctg 300

tacgagcgtc atcctgaggt gctgccaatc gatcggtacg gccatgtggt caatgcgggc 360

tcacgccagt cgtggcagcc cacaagcccg gtgctcaagg aatacgcgct gcgcctgtgc 420

cgcaaacttg ccgaacacta caaggacaat ccatacgtga cggcctggca catgggcaac 480

gaatacggct ggaacaaccg ctacgactac tccgacaacg ccttggccgc gttccgcacg 540

tggtgcgagg ccaaatacgg gaccgtcgac gcgttgaacg aagcgtgggg cacggccttc 600

tggtcccagc acgtgaacag cttcgacgag gtgttgctgc ctcgccacat gggcggcgac 660

agcatggtca acccgcccca gcagttggat tacgagcggt tcggcaacga catgctgctc 720

gacttctaca aggccgaacg cgacgccatc gaagaaatct gccccggcaa gccgttcacc 780

acgaacttca tggtctccac cgaccaatgc accatggact acgcgcaatg ggcaaacgaa 840

gtggacttcg tgtccaacga tcactacttc catgagggcg aatcccatct ggacgaactc 900

gcctgctcgg acgcgctcat ggactcgctc gcgctcggca agccgtggta cgtgatggag 960

cactccacct ccgccgtcca atggaagccg cttaacatgc gcaagcgcgc cggcgagctc 1020

atgcgcgact ccttggccca cgtggccatg ggtgccgacg ccatcaactt cttccaatgg 1080

agacaatccg catcgggtgc cgaggcgttc cactccgcga tggtgcccca cgcgggctcc 1140

gatacgaaac tgtttcgagg agtgtgcgaa ctcggcgccg cgctgaagac gctgtccgac 1200

gcgggtgtgc aagacacgga actgaagcgc gcggacacgg cgattctgtt tagtgcggaa 1260

tccgaatggg ccactcgctc cgagaccctg cccagcatga aactcaatca ctggcatgac 1320

gtacgcgact ggtatcgcgg atatctcgat gccggagcgc gcgcggacgt ggtcccgctc 1380

gcctacgatt ggagcggcta ccagactatc gtgctgccca ccgtgatcgc cctgtccgac 1440

gaggataccc gtcgcatcgc ggactttgcc gaaaacggcg gtacggtcat cgtcggctat 1500

gccaccggcc tgatcgacga acacttccac atcggtctcg gcggataccc cggcgccggc 1560

aacggacttc tgcgcgacat gctcggcatc cgctccgaag aattcaacat cctcggagaa 1620

gaagccgaag acgaaccggc cgaaatcggt ttgtcgaatg gactcacgac acgtctgtgg 1680

cagaatgacg tgacctcggt cgctccagac actcgcgtgc ttgccacgta cgtgggtaca 1740

gccgctgctg actgggagct cgacggcgtc cccgccatca ccagtcaccc ccacggccaa 1800

ggcgccgcca tctacgtggg ctgcgatctt ggccgccacg acatcaccca cttgctcaag 1860

gaactcaaca caacagcccc ctccgacgaa agggctcccg accaaaggcc gggtggggga 1920

gagatcaacg ccgcaactac gaccgcagca gccacgactc atgacccccg catcctgcac 1980

accatccgcc aatcctcaga cggtaccatc cgcttcgatt tctatctgaa ccgttcgaag 2040

cagcccgttg ccgtcaacgg tgtggaaggt gatcccatca tcgcccaccg ttgcgagact 2100

gacgccgttg gatatacact gaaccgcaac gccattctta tcgctaaaac gtcctgctaa 2160