褐藻胶治疗肝豆状核变性的新用途
阅读说明：本技术 褐藻胶治疗肝豆状核变性的新用途 (New use of algin for treating hepatolenticular degeneration ) 是由 郭云良 张国防 刘英娟 王发合 葛科立 孙占一 张清华 于 2021-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物研究开发领域,具体涉及褐藻胶治疗肝豆状核变性的新用途。通过口服给药体内动物实验研究证明,褐藻胶可以通过络合动物体内的铜离子,增强动物肝细胞铜蓝蛋白表达,提高血清铜蓝蛋白含量,降低尿铜和肝铜含量,降低血清丙氨酸氨基转移酶和门冬氨酸氨基转移酶活性,能够抗肝纤维化和抗肝细胞凋亡,从而在治疗肝豆状核变性中发挥排铜保肝作用。治疗效果很好,有利于市场推广使用。(The invention belongs to the field of research and development of medicines, and particularly relates to a new application of algin in treating hepatolenticular degeneration. The oral administration in vivo animal experiment research proves that the algin can enhance the expression of ceruloplasmin of animal liver cells, improve the content of ceruloplasmin in serum, reduce the content of copper in urine and liver and the activity of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase in serum by complexing copper ions in animal bodies, can resist hepatic fibrosis and hepatic cell apoptosis, and thus plays a role in removing copper and protecting the liver in the treatment of hepatolenticular degeneration. Has good treatment effect and is beneficial to market popularization and application.)
技术领域
：本发明属于药物研究开发领域，具体涉及褐藻胶(Algin)治疗肝豆状核变性(Wilson病)的新用途。
背景技术
：肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration，HLD)也称Wilson病，是一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病，以铜代谢障碍引起的肝硬化、基底节损害为主的脑变性疾病为特点。HLD的世界范围发病率为1/30000～1/100000，致病基因携带者约为1/90。目前，HLD的治疗仍然是综合治疗，通过避免进食含铜高的食物减少铜离子摄入量。
目前以驱铜药物驱铜和阻止铜吸收的药物主要有两大类药物，一是络合剂，能强力促进体内铜离子排出，如青霉胺、二巯丙磺酸钠、二巯丁二酸等；二是阻止肠道对外源性铜的吸收，如锌剂、四硫钼酸盐。中药大黄、黄连、姜黄等由于具有利尿及排铜作用而对HLD有效。但驱铜药物长期服用毒副作用大，锌剂成本太高。上述方法效果均不能收到满意的效果，难以从根本上阻止疾病的发展和逆转疾病的进程。
褐藻胶是广泛存在于各种褐藻中的一类多糖物质，其主要成分为多聚甘露糖醛酸和多聚古罗糖醛酸所构成的高分子化合物。近年来，通过多种降解方法制备的褐藻胶寡糖显示出诸多生理药理学活性。褐藻胶寡糖具有良好的抗氧化活性，且具有天然无毒的优点，应用于氧化应激相关疾病的防治具有一定的效果。
体外实验研究证明，褐藻胶与重金属铜离子具有极高的亲和力。而 HLD正是由于血清中过多的游离铜大量沉积于肝脏造成小叶性肝硬化。当肝细胞溶酶体无法容纳时，铜即通过血液向各个器官散布和沉积。基底节的神经元和其正常酶的转运对无机铜的毒性特别敏感，大脑皮质和小脑齿状核对铜的沉积也产生症状。
由于褐藻胶其本身具有大量的羧基和羟基等带负电荷的基团，对带正电荷的金属离子有明显的吸附作用，可以形成稳定的盐结构。且其对重金属离子的结合作用显著大于钙等人体所需的金属离子，也不影响其在人体内的吸收和分布。
因此，褐藻胶与铜离子的高亲和力这一特性，使其有望成为治疗 HLD的有效措施，研发一种治疗HLD的药物，具有重要的临床应用价值。
发明内容
：本发明的目的在于克服现有技术的不足，经口服给药体内动物实验研究，阐明褐藻胶(Algin)组合物在制备治疗肝豆状核变性(Wilson 病)药物中的新应用及其作用机制，并进行剂量和疗程优化。
为实现上述目的，本发明采用了下述技术方案：
褐藻胶可以通过络合动物体内的铜离子，增强动物肝细胞铜蓝蛋白表达，提高血清铜蓝蛋白含量，降低尿铜和肝铜含量，降低血清丙氨酸氨基转移酶和门冬氨酸氨基转移酶活性，能够抗肝纤维化和抗肝细胞凋亡，从而在治疗肝豆状核变性中发挥排铜保肝作用。
其中：褐藻胶的分子式如下：
优选的，所述褐藻胶为褐藻酸或褐藻酸钠，褐藻胶的的制备方法如下：
(1)将褐藻原料加水浸泡、洗涤，然后与碱剂混合均匀，得到糊状褐藻胶；
(2)将所述糊状褐藻胶加水稀释并过滤，然后与氯化钙溶液反应，得到海藻酸钙；
(3)将所述海藻酸钙加入盐酸进行脱钙，得到海藻酸；
(4)将所述海藻酸进行压榨脱水，然后加入碳酸钠进行固相中和，得到中和后的海藻酸钠；
(5)将所述中和后的褐藻胶加入乙醇和无水硫酸钠混合均匀、捏合造粒并烘干得到成品褐藻胶；
优选的，所述褐藻原料为海带、裙带菜、泡叶藻、马尾藻或巨藻中的一种或多种。
其中，褐藻胶的成分比例为：β-D-甘露糖醛酸(G):α-L-古罗糖醛酸(M)＝(0.8～1):1，粘度为50～100S，pH为5～8，分子量为70～300kDa。优选的，所述褐藻胶的成分比例为：β-D-甘露糖醛酸(G):α-L-古罗糖醛酸(M)＝1:1，粘度为75S，pH＝7.04，分子量为80kDa。
其中，褐藻胶的制备过程如下，褐藻原料为海带、裙带菜、泡叶藻、马尾藻或巨藻中的一种或多种，经过浸泡、切碎、消化、稀释、过滤、洗涤、钙析、盐酸脱钙、碱溶、乙醇沉淀、过滤、烘干、粉粹、成品等工序制备而成。
具体包括如下步骤：
(1)将褐藻加水浸泡、洗涤，然后与碱剂混合均匀，得到糊状褐藻胶；浸泡时间为1～4h，水用量为所述褐藻质量的5～10倍；所述碱剂包括碳酸钠和/或氢氧化钠，所述碱剂用量为所述褐藻质量的10％～50％，消化温度为45～70℃，消化时间为1～3h。
(2)将所述糊状褐藻胶加水稀释并过滤，然后与氯化钙溶液反应，得到海藻酸钙；所述糊状褐藻胶与水质量比为1:(3～10)，将糊状褐藻胶稀释，后经过滤之后，达到冲稀粘度为50～100S，将滤液用盐酸调整到pH至5～8，加入0.1～2倍纯碱重量的氯化钙钙析，氯化钙的质量分数为 9％～13％，氯化钙溶液用量为稀释后的褐藻胶质量的10％，反应时间为25～30min。
(3)将所述海藻酸钙加入盐酸进行脱钙，得到海藻酸；使用2％～10％的稀盐酸酸化脱钙30min，使用的盐酸为海藻酸钙质量的5～10倍。
(4)将所述海藻酸进行压榨脱水，然后加入碳酸钠进行固相中和，得到中和后的海藻酸钠；进行压榨脱水后的海藻酸的含水量为 75％～80％，固相中和添加海藻酸和碳酸钠进行中和，中和时间为5～7min，碳酸钠用量为海藻酸质量的2％～20％，pH为6～8。
(5)将所述中和后的褐藻胶加入乙醇和无水硫酸钠混合均匀、捏合造粒并烘干得到成品褐藻胶；其中：乙醇浓度为75％～95％，乙醇用量为海藻酸质量的5％～20％；无水硫酸钠用量为海藻酸质量的5％～10％。所述半成品褐藻胶的含水量为12％。
建立昆明小鼠肝豆状核变性动物模型，经口服给药体内动物实验，高剂量褐藻胶治疗4周后，肝细胞铜蓝蛋白(CER)表达水平较模型组显著升高(P<0.05)，尿铜和肝铜含量较模型组均显著降低(P<0.05)，肝功能指标血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST) 活性较模型组显著降低，而血清CER含量显著升高(P<0.05)，肝细胞变性指数、肝纤维化程度和凋亡细胞指数较模型组均显著减少 (P<0.05)，基底节神经细胞核转录因子-κB(NF-κB)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达水平较模型组均显著减弱(P<0.05)，神经变性细胞指数和凋亡细胞指数较模型组均显著降低(P<0.05)，小鼠的肝脏功能、精神状态、神经行为功能等较模型组显著改善。
本发明经过研究后发现，褐藻胶在针对肝豆状核变性(Wilson病) 的治疗有非常好的治疗效果，目前还没有其他学院或机构在此方向上有所研究，本发明方案的技术进步性较大，有利于市场推广。
附图说明
：图1为各组小鼠肝组织病理改变(HE染色)；本发明涉及的褐藻胶可显著改善HLD小鼠肝细胞的形态结构。其中：a,b,c,d,e,f:对照组，模型组，阳性药组，褐藻胶低、中、高剂量组，×100；A,B,C,D,E,F:对照组，模型组，阳性药组，褐藻胶低、中、高剂量组，×400。
图2为各组小鼠肝组织纤维增生病理改变(MASSON染色)；本发明涉及的褐藻胶可显著抑制HLD小鼠肝纤维化的程度。其中：a,b,c,d,e,f: 对照组，模型组，阳性药组，褐藻胶低、中、高剂量组，×100；A,B,C,D,E,F: 对照组，模型组，阳性药组，褐藻胶低、中、高剂量组，×400。
图3为各组小鼠肝细胞凋亡变化(TUNEL染色)；本发明涉及的褐藻胶可显著抑制HLD小鼠肝细胞的凋亡。其中：a,b,c,d,e,f:对照组，模型组，阳性药组，褐藻胶低、中、高剂量组，×100；A,B,C,D,E,F:对照组，模型组，阳性药组，褐藻胶低、中、高剂量组，×400。
图4为各组小鼠肝细胞CER表达水平的变化(IHC-DAB染色)；本发明涉及的褐藻胶可显著增强HLD小鼠肝细胞CER的表达。其中： a,b,c,d,e,f:对照组，模型组，阳性药组，褐藻胶低、中、高剂量组，×100； A,B,C,D,E,F:对照组，模型组，阳性药组，褐藻胶低、中、高剂量组，×400。
图5为各组小鼠基底节豆状核神经细胞形态结构比较，甲苯胺蓝 (TB)染色；本发明涉及的褐藻胶可显著改善HLD小鼠基底节豆状核神经细胞形态结构。其中：A,B,C,D,E,F:对照组、模型组、阳性药组、低、中、高剂量组，×100；a,b,c,d,e,f:对照组、模型组、阳性药组、低、中、高剂量组，×400；↑变性细胞。
图6为各组小鼠基底节豆状核神经细胞凋亡比较，TUNEL染色；本发明涉及的褐藻胶可显著抑制HLD小鼠基底节豆状核神经细胞凋亡。其中：A,B,C,D,E,F:对照组、模型组、阳性药组、低、中、高剂量组，×100； a,b,c,d,e,f:对照组、模型组、阳性药组、低、中、高剂量组，×400；↑凋亡细胞。
图7为褐藻胶对小鼠基底节豆状核神经细胞NF-κB表达的影响， ICH-DAB染色；本发明涉及的褐藻胶可显著抑制HLD小鼠基底节豆状核NF-κB的表达。其中：A,B,C,D,E,F:对照组、模型组、阳性药组、低、中、高剂量组，×100；a,b,c,d,e,f:对照组、模型组、阳性药组、低、中、高剂量组，×400；↑阳性细胞。
图8为褐藻胶对小鼠基底节豆状核神经细胞MMP-9表达的影响， ICH-DAB染色；本发明涉及的褐藻胶可显著抑制HLD小鼠基底节豆状核 MMP-9的表达。其中：A,B,C,D,E,F:对照组、模型组、阳性药组、低、中、高剂量组，×100；a,b,c,d,e,f:对照组、模型组、阳性药组、低、中、高剂量组，×400；↑阳性细胞。
具体实施方式
：
以下结合附图(表)和具体实施方式对本发明的技术方案作具体说明。应理解，这些实施例是示例性的，不是限制性的。这些实施例不会以任何方式限制本发明的范围。
本发明按照国际公认的方法，评价了褐藻胶组合物在制备治疗肝豆状核变性药物中的新用途及其作用机制，并进行剂量和疗程优化。
实施例1：褐藻胶的制备工艺。
褐藻胶的制备过程如下，褐藻原料为海带、裙带菜、泡叶藻、马尾藻或巨藻中的一种或多种，经过浸泡、切碎、消化、稀释、过滤、洗涤、钙析、盐酸脱钙、碱溶、乙醇沉淀、过滤、烘干、粉粹、成品等工序制备而成。
褐藻胶的制备过程包括如下步骤：
(1)将褐藻加水浸泡、洗涤，然后与碱剂混合均匀，得到糊状褐藻胶；浸泡时间为2h，水用量为所述褐藻质量的8倍；所述碱剂包括碳酸钠和氢氧化钠，所述碱剂用量为所述褐藻质量的25％，消化温度为 60℃，消化时间为2h。
(2)将所述糊状褐藻胶加水稀释并过滤，然后与氯化钙溶液反应，得到海藻酸钙；所述糊状褐藻胶与水质量比为1:5，将糊状褐藻胶稀释，后经过滤之后，达到冲稀粘度为75S，将滤液用盐酸调整到pH至7.04，加入1倍纯碱重量的氯化钙钙析，氯化钙的质量分数为10％，氯化钙溶液用量为稀释后的褐藻胶质量的10％，反应时间为28min。
(3)将所述海藻酸钙加入盐酸进行脱钙，得到海藻酸；使用6％的稀盐酸酸化脱钙30min，使用的盐酸为海藻酸钙质量的6倍。
(4)将所述海藻酸进行压榨脱水，然后加入碳酸钠进行固相中和，得到中和后的海藻酸钠；进行压榨脱水后的海藻酸的含水量为78％，固相中和添加海藻酸和碳酸钠进行中和，中和时间为6min，碳酸钠用量为海藻酸质量的10％，pH为7.04。
(5)将所述中和后的褐藻胶加入乙醇和无水硫酸钠混合均匀、捏合造粒并烘干得到成品褐藻胶；其中：乙醇浓度为85％，乙醇用量为海藻酸质量的10％；无水硫酸钠用量为海藻酸质量的8％。所述半成品褐藻胶的含水量为12％。
褐藻胶的成分比例为：β-D-甘露糖醛酸(G):α-L-古罗糖醛酸(M) ＝1:1，粘度为75S，pH＝7.04，分子量为80kDa。
实施例2：褐藻胶可显著促进体内铜离子的排出。
本实施例采用的是实施例1所得的褐藻胶。
1.成年健康雄性昆明小鼠70只，由济南朋悦实验动物繁育公司提供，SCXK(鲁)20190003。小鼠体重25g～30g，SPF级。实验前将动物放置于25±2℃的动物实验室适应性饲养1周，自由进食、饮水，12h/12h 自然光照。随机选取只10作为对照组，普通饲料常规饲养。其余60只应用硫酸铜负荷饮食法建立小鼠HLD模型。适应性饲养7天后，喂饲含硫酸铜(1g/kg)的饲料和(0.185％)硫酸铜的水，连续喂养28天后，将小鼠置于代谢笼，连续留取24h尿液，应用电感耦合等离子体质谱法检测尿铜含量。以尿铜含量达到或大于100μg/L为WD模型成功的标志，未达标或死亡10只小鼠。动物模型成功率为83.3％。将成功的WD动物模型 50只纳入统计范围，随机分组，干预治疗：
(1)对照组10只：常规饲养，每日给予等量1mL生理盐水灌胃28 天。
(2)模型组10：硫酸铜负荷饮食法造模，同步给予等量1mL生理盐水灌胃28天。
(3)阳性药对照组10只：硫酸铜负荷饮食法造模，每日同步给予二巯丁二酸钠(根据成人剂量2mg/kg体重换算，动物剂量为20mg/kg 体重，用生理盐水溶解成1mL)灌胃，每日1次，连续28天。
(4)低剂量治疗组10只：硫酸铜负荷饮食法造模，每日同步给予等体积的褐藻胶(1mL，50mg/kg/d)灌胃，每日1次，连续28天。
(5)中剂量治疗组10只：硫酸铜负荷饮食法造模，每日同步给予等体积的褐藻胶(1mL，100mg/kg/d)灌胃，每日1次，连续28天。
(6)高剂量治疗组10只：硫酸铜负荷饮食法造模，每日同步给予等体积的褐藻胶(1mL，200mg/kg/d)灌胃，每日1次，连续28天。
2.褐藻胶干预治疗28天后，观察以下指标，进行疗效评价：
(1)尿铜含量：将小鼠(每组10只)置代谢笼中，连续留取24h 尿液，通过电感耦合等离子体质谱仪检测尿酮含量(μg/L)。治疗4周后组间比较，阳性药对照组和褐藻胶低、中、高剂量治疗组小鼠的尿铜含量较模型组尿铜含量均有所降低，其中阳性药对照组下降最为显著， t＝7.16，P<0.01；高剂量组次之，t＝2.67，P<0.01。但低剂量组、中剂量组较差，与模型组比较均未见显著性差异，t＝1.46～1.93，P>0.05。
(2)肝铜含量：取肝组织100mg，剪碎、研磨，加预冷细胞裂解液(每mL裂解液含10μLPMSF)1mL，充分研磨，置于冰上裂解15min，移至1.5mL离心管中，12,000rpm 4℃离心10min，取上清50μL，电感耦合等离子体质谱仪检测肝酮含量(μg/L)。治疗4周后组间比较，模型组小鼠肝铜含量较对照组显著升高，t＝12.76，P<0.01。阳性药对照组和褐藻胶低、中、高剂量治疗组小鼠的肝铜含量较模型组均降低，其中阳性药对照组下降最为显著，t＝6.17，P<0.01；高剂量组次之，t＝4.71，P<0.01。但低、中剂量组与模型组比较均未见显著性差异，t＝1.21～1.64， P>0.05。
(3)血铜含量：每组取5只小鼠，应用10％水合氯醛腹腔注射(300 mg/kg)麻醉小鼠，经心脏取血1mL，静置10min，4000rpm离心10min，留取血清，电感耦合等离子体质谱仪检测肝酮含量(μg/L)。治疗4周后组间比较，模型组小鼠血铜含量较对照组略升高，但无显著性差异， t＝0.56，P>0.05。阳性药对照组和褐藻胶低、中、高剂量治疗组小鼠血清铜含量与模型组血清铜含量比较，均未见显著性差异，t＝0.67～1.25， P>0.05。
表1治疗后各组小鼠尿、血、肝铜水平的比较(x±s，μg/L)
*P<0.01vs对照组；#P<0.05vs模型组
实施例3：褐藻胶可改善肝脏功能。
本实施例采用的是实施例1所得的褐藻胶。
本实施例采用的是实施例2所得的数据分析。
采用褐藻胶干预28天后，从对照组、模型组、阳性药对照药组、低剂量治疗组、中剂量治疗组和高剂量治疗组每组取5只小鼠，应用10％水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉小鼠，经心脏取血1mL，静置10min， 4000rpm离心10min，留取血清。
(1)ALT和AST活性：取上述储存的血清标本50μL，应用CS-800 型全自动生化分析仪检测肝功指标：丙氨酸氨基转移酶(ALT，U/L)、门冬氨酸氨基转移酶(AST，U/L)、总蛋白(TP，g/L)、白蛋白(ALB， g/L)。造模后，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性较对照组均显著升高，tALT＝7.15，tAST＝5.23，P<0.01；治疗4周后，阳性药对照组和褐藻胶治疗组小鼠的血清ALT和AST活性与模型组比较均有所降低，但仅阳性药对照组和高剂量治疗组存在显著性差异，tALT＝4.78、2.98，tAST＝3.86、3.59，P<0.05。褐藻胶低、中剂量治疗组均为未见显著性差异，tALP＝0.79～1.56，tAST＝1.10～1.63，P>0.05。
(2)血清CER含量：取上述血清50μL，按ELISA试剂盒说明操作。加标准品和样品、温育、反应、显色、终止反应。调整酶标仪波长在450 nm处，按照之前标记好的顺序测量每个孔的吸光度(OD)值。加终止液后15min以内进行检测，以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中的CER浓度(μg/L)。治疗4 周后组间比较，模型组小鼠血清CER含量较对照组显著降低，t＝8.12， P<0.01。阳性药对照组和褐藻胶治疗组小鼠的血清CER含量与模型组比较有所降低，但仅阳性药对照组和高剂量治疗组存在显著性差异， t＝4.65、3.17，P<0.01。褐藻胶低、中剂量治疗组均未见显著性差异， t＝0.98～1.83，P>0.05。
表2各组小鼠肝功指标的比较(x±s)
*P<0.01vs对照组；#P<0.05vs模型组
实施例4：褐藻胶可改善肝脏的形态结构。
本实施例采用的是实施例3所得的数据分析。
采用褐藻胶干预28天后，从对照组、模型组、阳性药对照药组、低剂量治疗组、中剂量治疗组和高剂量治疗组每组取5只小鼠，应用10％水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉小鼠，开胸，经心脏灌注生理盐水50mL和多聚甲醛固定50mL后，取肝组织依次置于20％蔗糖溶液和30％蔗糖溶液中4h。然后取出肝组织，常规梯度乙醇脱水，采用二甲苯透明、石蜡包埋，连续切片，厚度为7μm，每隔3张抽取1张，贴于多聚赖氨酸处理的切片，自然晾干，4℃保存。
(1)肝细胞形态结构：HE染色显示：低倍×100下观察，对照组动物的肝小叶结构完整，肝细胞板围绕中央静脉整齐排列，呈放射状；高倍×400下显示，肝小叶中央静脉内皮细胞光滑完整，肝细胞轮廓清晰，胞浆充足，胞核居中，圆形或椭圆形，核仁清晰。模型组肝小叶中央静脉内皮细胞破坏，肝细胞板排列紊乱，肝细胞轮廓模糊，核固缩，染色质凝聚，着色加深，细胞浆嗜酸性着色，变性坏死细胞的数量较对照组显著增多。治疗4周后肝细胞的形态结构较模型组均有不同程度的改善，其中阳性药对照组和褐藻胶高剂量组的变性细胞指数(DCI)较模型组显著降低(P<0.05)(图1)。
(2)肝细胞纤维化：Masson染色显示，对照组肝小叶结构完整，肝细胞板围绕中央静脉呈放射状整齐排列，肝细胞内少量散在红色糖原样变性颗粒沉积，无纤维结缔组织增生。模型组肝小叶结构损坏，肝细胞板排列紊乱，肝细胞轮廓模糊，肝细胞内有大量红色糖原样变性颗粒沉积，胶原纤维增生，从而形成不规则的假小叶；中央静脉扩大，内皮细胞粗糙，管壁增厚，周围存在纤维化。治疗4周后，组肝细胞内糖原样变性颗粒沉积较模型组显著减少，胶原纤维较模型组细薄，胶原纤维着色较模型组明显变浅，其中阳性药对照组和褐藻胶高剂量的平均光密度值(MOD)较模型组显著降低(P<0.05)(图2)。
(3)肝细胞凋亡：TUNEL染色显示，肝细胞凋亡呈棕黄色，细胞核为蓝色。对照组肝小叶结构完整，肝细胞板围绕中央静脉呈放射状整齐排列整齐，有少量散在凋亡细胞，着色较浅。模型组肝细胞板排列紊乱，肝细胞轮廓模糊，出现大量凋亡细胞，部分细胞核固缩，细胞质棕黄色颗粒增加(P<0.05)，着色加深。治疗后，阳性药对照组细胞棕黄色强度及凋亡细胞指数(ACI)较模型组显著降低(P<0.05)。褐藻胶不同浓度干预4周后，肝细胞棕黄色颗粒减少，随着浓度增加，棕黄色颗粒越来越少，褐藻胶高剂量组ACI较模型组显著降低(P<0.05)，但中、低低剂量组与模型组比较未见显著性差异(图3)。
(4)肝细胞铜蓝蛋白表达水平：免疫组化染色显示，肝细胞CER 阳性表达呈棕黄色，细胞核为蓝色。对照组肝小叶结构完整，肝细胞板围绕中央静脉呈放射状整齐排列整齐，肝细胞CER高表达，着色较深。模型组肝细胞板排列紊乱，肝细胞CER表达强度较对照组显著降低 (P<0.05)，着色较浅，提示铜离子影响了CER的合成。治疗后，阳性药对照组CER表达强度以及阳性细胞指数(PCI)较模型组均显著升高 (P<0.05)。褐藻胶不同浓度干预4周后，肝细胞CER表达均增强，但只有褐藻胶高剂量组的PCI较模型组显著升高(P<0.05)，中、低低剂量组均无显著性差异(图4)。
实施例5：褐藻胶可改善基底节豆状核神经细胞结构。
本实施例采用的是实施例3所得的数据分析。
采用褐藻胶干预28天后，每组取5只小鼠，应用10％水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉小鼠，开胸，经心脏灌注生理盐水50mL和多聚甲醛固定50mL后，取脑组织依次置于20％蔗糖溶液和30％蔗糖溶液中4h。然后取出脑组织，常规梯度乙醇脱水，采用二甲苯透明、石蜡包埋，连续切片，厚度为7μm，每隔3张抽取1张，贴于多聚赖氨酸处理的切片，自然晾干，4℃保存。
(1)基底节豆状核神经细胞结构：甲苯胺蓝染色显示，对照组小鼠基底节豆状核神经细胞排列规整、轮廓清晰、结构正常。模型组小鼠神经细胞数量减少，排列紊乱，细胞固缩、细胞周隙增宽，染色质凝聚、着色加深，变性细胞指数DCI较对照组显著升高，t＝11.35，P<0.01。阳性药对照组和褐藻胶治疗组细胞形态结构较模型组均有不同程度的改善，变性细胞指数减低，但仅阳性药对照组和高剂量治疗组有显著性差异，t＝4.98、4.22，P<0.05；且阳性药对照组更为显著，t＝2.15，P<0.05。褐藻胶低、中、高剂量治疗组之间比较，均未见显著性差异，t＝0.18～1.41， P>0.05(图5)。
(2)基底节豆状核神经细胞凋亡：TUNEL染色显示，对照组小鼠基底节豆状核区可见少量呈红色着色的凋亡神经细胞。模型组小鼠凋亡细胞数量(凋亡细胞指数ACI)较对照组显著增多，t＝11.03，P<0.01。阳性药对照组和褐藻胶治疗组小鼠的凋亡细胞数较模型组均有不同程度地减少，但仅阳性药对照组和高剂量治疗组有显著性差异，t＝5.02、 4.45，P<0.05；且阳性药对照组减少更为显著，t＝2.73，P<0.05。褐藻胶低、中、高剂量治疗组之间比较，均未见显著性差异，t＝0.46～1.43，P>0.05 (图6)。
(3)基底节豆状核NF-κB表达水平：免疫组化染色显示，对照组小鼠基底节豆状核可见少量呈棕黄色的NF-κB阳性细胞。模型组小鼠的阳性细胞指数PCINF-κB较对照组显著增高，t＝12.27，P<0.01。阳性药对照组和褐藻胶治疗组小鼠阳性细胞数量均有不同程度地减少，但仅阳性药对照组和高剂量治疗组有显著性差异，t＝5.21、3.11，P<0.05；且阳性药对照组减少更显著，t＝2.70，P<0.05。褐藻胶低、中、高剂量治疗组之间比较，均未见显著性差异，t＝0.75～1.89，P>0.05(图7)。
(4)基底节豆状核MMP-9表达水平：免疫组化染色显示，对照组小鼠的基底节豆状核区可见少量棕黄色MMP-9阳性神经细胞。模型组小鼠的阳性细胞数量(阳性细胞指数PCIMMP-9)较对照组显著增多，t＝10.67， P<0.01。阳性药对照组和褐藻胶治疗组小鼠的阳性细胞数量均有所减少，但仅阳性药对照组和高剂量治疗组有显著性差异，t＝4.56、2.67， P<0.05，且阳性药对照组减少更为显著，t＝2.59，P<0.05。褐藻胶低、中、高剂量治疗组比较，均未见显著性差异，t＝0.12～1.13，P>0.05(图8)。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。