具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1海藻提取物GV971治疗多囊卵巢综合征的动物实验

1材料与方法

1.1实验小鼠

3周龄雌性C57BL/6小鼠，购自上海杰思捷实验动物有限公司，SPF级。用于生育力实验的雄鼠为10周龄大，生育力正常的雄鼠，购自上海杰思捷实验动物有限公司，SPF级。

1.2小鼠饲养

所有小鼠饲养于上海市内分泌重点实验室动物房，3-5只/笼，饲养温度维持在21-25℃，光照时间为12L:12D的人工昼夜节律，自由摄食饮水。实验中所使用动物均经复旦附属妇产科医院动物伦理委员会审核批准。

1.3PCOS小鼠模型的建立

来曲唑动物模型，21天大小的C57BL/6雌性小鼠颈部埋置直径3mm来曲唑缓释片(50ng/d)21天，对照组埋置配套安慰剂21天。

1.4GV971的灌胃实验

与造模时间同时开始，GV971(国药准字H20190031)按100mg/kg体重灌胃，0.9wt％生理盐水配制，对照组灌胃等量生理盐水，一天一次。

实验产生四组小鼠：安慰剂对照组(C)，来曲唑组(L)，安慰剂小鼠灌胃GV971组(G)，来曲唑小鼠灌胃GV971组(LG)。

1.5小鼠动情周期检测

从造模第7天开始，每日上午9点行阴道涂片，直至造模完成。沾取：将消毒的10ul枪头吸取少量无菌生理盐水，轻轻插入小鼠的阴道内，吹吸数次。涂片：将带有阴道内含物的生理盐水置于载玻片上做成涂片，然后将涂片散在空气中自然干燥(以载玻片上发白为准)。固定：将玻片置于95％乙醇中固定30-60min。染色：吉姆萨染色法染色。结果观察：将涂片置于显微镜下，观察阴道涂片的组织学变化，确定动情周期变化的不同阶段。

动情前期(P)：显微镜下可见阴道涂片中有核上皮细胞占多数，有的是单个的，有的呈片状，可伴有少量白细胞。

动情期(E)：涂片中有很多无核的角化鳞状细胞，细胞大而扁平，边缘不整齐，视野中看不到或很少白细胞与上皮细胞。

动情后期(M)：涂片中角化上皮细胞减少，出现许多白细胞及有核上皮细胞。

动情间期(D)：小鼠阴道粘膜薄，阴道涂片中几乎全是白细胞。

1.6糖耐量试验

(1)将小鼠换入干净的笼子禁食12h(禁食期间保证正常的饮水)后，称取每只小鼠的体重，并逐一对小鼠进行标记，以便在实验过程中能快速辨认所测小鼠。

(2)用剪刀剪去小鼠尾巴末端约1-2mm，轻轻挤压尾巴让血液富集成一滴后，用血糖测试仪测定小鼠血糖水平，记为空腹血糖。

(3)向每只小鼠腹腔注射剂量为2g/kg的葡萄糖溶液。

(4)测定其空腹血糖值及注射葡萄糖后15min，30min，60min，90min，120min采用尾静脉取血的方式测定小鼠的血糖值。

1.7胰岛素抵抗实验

(1)将小鼠换入干净的笼子禁食4h(禁食期间保证正常的饮水)后，称取每只小鼠

的体重，并逐一对小鼠进行标记，以便在实验过程中能快速辨认所测小鼠。

(2)用剪刀剪去小鼠尾巴末端约1-2mm，轻轻挤压尾巴让血液富集成一滴后，用血糖测试仪测定小鼠血糖水平，记为空腹血糖。

(3)向每只小鼠腹腔注射剂量为1.5IU/kg的胰岛素。

(4)测定其空腹血糖值及注射葡萄糖后15min，30min，60min，90min，120min采用尾静脉取血的方式测定小鼠的血糖值。

1.8生育力检测

(1)购买10周龄大雄性C57BL/6小鼠，与无实验用途的性成熟雌鼠1:1合笼，雌鼠见栓后雌雄分开；

(2)确定雌鼠怀孕后，证明与其合笼的雄鼠性能力正常，可以使用，若不能使同笼雌鼠怀孕，则更换雄鼠；

(3)挑选出足够数目的生育力正常的雄鼠，与待检测雌鼠1:1合笼；

(4)待见栓后10天解剖雌鼠，计数子宫内胚胎数。

1.9血清激素、血清及卵巢组织的IL-18检测

将所得血液3000g离心10min，取上层血清分装后-80℃冻存，卵巢组织取出置于含蛋白酶抑制剂的PBS中研磨匀浆分装后-80℃冻存，根据睾酮定量测定试剂盒、LH定量测定试剂盒说明、DHEAS定量试剂盒说明和IL-18定量试剂盒说明，用酶联免疫吸附测定各激素含量。

1.10卵巢形态检测

取卵巢置于4％多聚甲醛中固定24h，按常规梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等，步骤制备石蜡切片，37℃烤干后常温保存备用。二甲苯洗2次，每次5min。100％、95％、90％、80％、70％酒精梯度水化，每梯度5min，2次，结束后用蒸馏水洗两遍。苏木素复染15min后，蒸馏水5min洗2次；1％盐酸酒精浸30s，蒸馏水5min洗2次；1％伊红溶液染色5min后蒸馏水5min洗2次；70％、80％、90％、95％、100％酒精梯度脱水，每梯度5min，2次；二甲苯洗2次，每次5min；中性树胶封片。制片完成后，在光镜下观察卵巢形态，评估各组小鼠卵巢组织的形态结构学变化。

1.11卵巢组织总RNA提取及炎症因子聚合酶-链式反应

(1)将小鼠卵巢组织用PBS洗3次，加入1mlTrizol匀浆；使Trizol和组织充分混匀，静置5-10min，转移入1.5mlEP管，加入Trizol使总体积达到1ml。

(2)按所加Trizol的1/5体积加入氯仿200μl，颠倒混匀，剧烈震荡30s呈乳状。冰上放置5min，可以看到水相和有机相慢慢分离。

(3)4℃，12,000rpm离心10min，吸取上层水相到新的1.5mlEP管(勿接触DNA层)。

(4)按所加等体积的异丙醇混匀，充分混匀，冰上放置10min。

(5)4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，保留管底沉淀RNA。

(6)加入75％乙醇1ml(DEPC水配制)洗涤沉淀，温和振荡离心管悬浮沉淀，4℃，12,000rpm离心5min，弃去上清，尽量减少残留液体。重复1遍。

(7)室温晾干5-10min。加入20ul无菌DEPC水溶解RNA样品。

(8)取1ul测定RNA浓度。OD值定量RNA浓度。

(9)逆转录为cDNA，加入各炎症因子引物进行聚合酶-链式反应。

1.12卵巢组织转录组测序实验

(1)提取total RNA：

从组织样品中提取total RNA，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量≥1ug，浓度≥35ng/μL，OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.0。

(2)Oligo dT富集mRNA：

真核生物mRNA 3’末端具有ploy A尾的结构，利用带有Oligo(dT)的磁珠与ploy A进行A-T碱基配对，可以从总RNA中分离出mRNA，用于分析转录组信息。

(3)片段化mRNA：

Illumina Novaseq 6000平台是针对短序列片段进行测序，富集得到的mRNA是完整的RNA序列，平均长度达几kb，因此需要对其进行随机打断。加入fragmentation buffer，可以将mRNA随机断裂，通过磁珠筛选分离出300bp左右的小片段。

(4)反转合成cDNA：

在逆转录酶的作用下，加入六碱基随机引物(random hexamers)，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，随后进行二链合成，形成稳定的双链结构。

(5)连接adaptor：

双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’端加上一“A”碱基，用于连接Y字形的接头。

(6)Illumina平台上机测序：

①文库富集，PCR扩增15个cycles；

②2％琼脂糖胶回收目的条带；

③TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；

④cBot上进行桥式PCR扩增，生成clusters；

⑤Illumina平台测序(PE文库，读长2×150bp)。

1.13小鼠肠道微生物多样性测序及分析

(1)收集新鲜的小鼠粪便于1.5mlEP管中，液氮快速冷冻后-80℃冻存。

(2)微生物多样性测序：根据soil DNA Kit(Omega Bio-Tek,Norcross,GA)进行微生物群落总DNA抽提，使用NanoDrop 2000NanoDrop UV-vis测DNA浓度、纯度；用1％琼脂糖凝胶电泳测DNA提取质量，用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)(SEQ ID NO:1)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)(SEQ ID NO:2)对16SrRN基因V3-V4区进行PCR扩增(GeneAmp 9700,ABI,Waltham,MA)。将同一样本的PCR产物混合后使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行回收产物纯化，2％琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus^TM Fluorometer(Promega,USA)对回收产物进行检测、定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库。利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序。

(3)序列拼接及注释：Fastp软件对原始测序序列进行质控，Flash软件进行拼接。Usearch软件根据97％的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier对每条序列与Silva数据库(SSU132)进行比对，设置比对阈值为70％，得到物种分类注释结果。

(4)数据分析：Alpha多样性分析、物种组成分析、物种比较分析、物种差异分析，明确特征性上调菌属。

(5)基于OTU arcsin-square根转换计数数据，使用加权基因共表达网络分析(WGCNA)生成共现网络，输入大于15个样本的数据，包括OTU根转化技术数据、体重、血清T、LH、FSH、E2、P以及DHT值，以及是否为PCOS动物模型(以0或1表示)；选择构建一个有向网络，并选择合适的power值，即要使构建的网络符合无标度网络特征；层级聚类树显示各个模块；利用定义为模块第一主成分的模块本征otu计算模块与代谢性状之间的皮尔逊相关，绘制模块之间相关性图。相关性的显著性由渐近p值决定的。使用snaR包中的gplot函数实现网络的可视化，找到与疾病相关的微生物种类biomarker。

2 实验结果

2.1 基础指标

图1至图5说明了来曲唑诱导小鼠出现了体重增加、卵巢重量增加、性腺旁脂肪垫增加、糖耐量损害以及胰岛素抵抗等代谢异常表型，在给予葡萄糖或注射胰岛素后，L组小鼠的血糖水平较对照组有明显升高，且血糖下降较慢。而通过GV971的灌胃处理后，以上代谢异常表型得到改善。(注：图1至图3，与L组比较，^★P＜0.05，^★★P＜0.01，^★★★P＜0.001；图4和图5，C组与L组比较，^★P＜0.05，^★★P＜0.01，^★★★P＜0.001，L组与LG组比较，^#P＜0.05)。

2.2动情周期

图6至图9体现了四组小鼠的动情周期。安慰剂组小鼠的典型动情周期(图6)，来曲唑组小鼠的典型动情周期(图7)，安慰剂灌胃GV971组小鼠的典型动情周期(图8)，来曲唑组小鼠灌胃GV971组的典型动情周期(图9)。其中P为动情前期、E为动情期、M为动情后期、D为动情间期)。动情周期是评价小鼠性周期的一个重要指标，正常小鼠的动情为4-5天，动情前期(P)、动情期(E)、动情后期(M)及动情间期(D)重复出现，动情周期紊乱是PCOS小鼠的一个重要特征。

图7中体现出来曲唑小鼠长期处于动情间期，而经过GV971灌胃的来曲唑小鼠的动情周期表现出各个动情时期的重复出现，GV971灌胃的安慰剂组小鼠与对照组无明显差异。

2.3性激素水平

图10至图12体现了四组小鼠的血清性激素的水平。来曲唑组小鼠血清的睾酮水平明显升高(图10)，脱氢睾雄酮的水平以及黄体生成素的水平也明显升高(图11，图12)，而雄激素水平升高也是PCOS的一个重要病理表现和诊断标准。而经过GV971干预的来曲唑小鼠与来曲唑小鼠相比，睾酮水平明显降低，LH水平也显著降低。(注：与L组比较，^★P＜0.05，^★★P＜0.01，^★★★P＜0.001)

2.4生育力

图13体现了四组小鼠的生育力实验。来曲唑组小鼠的妊娠胚胎数较对照组显著减少，GV971的干预使来曲唑小鼠的妊娠胚胎数增加，生育力得到改善，说明GV971改善了来曲唑小鼠的卵巢排卵异常。(注：与L组比较，^★P＜0.05，^★★P＜0.01)

2.5卵巢形态、卵泡数及黄体数

图14至图17体现了对照组、来曲唑组小鼠及安慰剂灌胃GV971小鼠以及来曲唑灌胃GV971小鼠的卵巢形态。图14为对照组小鼠的典型卵巢HE染色，图15为来曲唑组小鼠的典型卵巢HE染色，图16为安慰剂灌胃GV971组小鼠的典型卵巢HE染色，图17为来曲唑灌胃GV971小鼠的典型卵巢HE染色，图18为四组小鼠卵巢黄体数，图19为四组小鼠囊泡状卵泡数(其中，*表示黄体，#表示囊状卵泡，与L组比较，^★P＜0.05，^★★P＜0.01)。

图14至图17中体现了来曲唑小鼠的黄体计数较对照组明显减少，而囊泡状卵泡数明显增多，说明来曲唑诱导小鼠出现了卵巢多囊样的形态变化，而经过GV971干预后，黄体数增加，囊状卵泡明显减少，说明GV971改善了PCOS模型鼠的卵巢形态异常和排卵异常。

2.6卵巢转录组测序分析

图20体现了四组小鼠的卵巢转录组测序的聚类模型的热图。可以看到LG组小鼠与L组小鼠分别都自成一个聚类，而C组和G组聚类模式相似(左侧前三列分别为样本LG1、LG3、LG6，此三列相关基因表达明显上调，呈现与另三组不同的聚类模式；可见L13、L12、L7此三组呈现相同聚类模式；C18、G22、C15、C16聚类模式更接近)。

图21体现了四组小鼠的卵巢转录组测序的聚类PCA图。可以看出LG组小鼠自成一个聚类模式。

图22和图23体现了C与L、L与LG之间的差异基因火山图。可以看出L组较C组上调表达的基因包括IL-17rb、IL-33、IL-13ra2等促炎症因子，还包括Col6a5、Col4a3、Vcam1、Fads1等与卵巢血管合成及组织增生相关的功能基因，和Hsd17b3、Cyp27a1、Cyp17a1等芳香酶类促进雄激素合成相关基因。说明来曲唑组小鼠的卵巢局部呈现免疫激活、雄激素合成激活的状态(图22)。而经过GV971的干预后的LG组Cyp17a1的表达下调，促炎症因子IL-17rb、IL-34，以及卵巢功能基因Col6a5、Vcam1、Fads1等表达也下调，说明GV971的干预改善了PCOS样小鼠卵巢局部的免疫激活状态，改善了其卵巢组织结构增生的表现(图23)。

通过图24和图25，C与L、L与LG差异基因的KEGG富集分析，体现了L组较C组的炎症及免疫相关通路激活，以及代谢通路激活(图25)；而GV971的干预使L组的卵巢局部炎症相关通路的激活改善，尤其注意其中肠道免疫通路的下调(图26)。

图26和图27体现了GV971的干预使L组的卵巢局部IL-18的表达量下调(图26)，以及血清IL-18的水平明显下调(图27)。(注：与L组比较，^★P＜0.05，^★★P＜0.01，^★★★P＜0.001)

2.7肠道菌群

图28至图31体现了四组小鼠的肠道菌群变化情况。可以看出，来曲唑组小鼠的肠道菌群α多样性较对照组明显降低，而肠道菌群α多样性的降低是在PCOS中的变化已经达成了共识，而GV971的干预使α多样性得到了恢复(图28注：与L组比较，^★P＜0.05)。来曲唑小鼠肠道菌群β多样性的聚类模式与LG组不同，而C组与G组的聚类模式大致相同，说明GV971的干预使PCOS样小鼠的肠道β多样性发生了改变(图29)。通过对四组小鼠的肠道菌群属水平的差异菌属的分析，可以看出来曲唑小鼠的norank_f_Muribaculaceae菌属的丰度较对照组升高，而GV971的干预使该菌属的丰度下调(图30注：组间差异^★P＜0.05)。并且将小鼠血清IL-18与差异性菌属进行Spearman相关性分析中，发现IL-18水平与上述的norank_f_Muribaculaceae丰度水平呈现正相关性(图31注：^★P＜0.05，^★★P＜0.01，单元格颜色越深，说明相关性越强)。

以上结果说明，GV971可以改善来曲唑小鼠的代谢及生殖异常表型，并且这种改善作用是通过调节肠道菌群的失调，进而改善了卵巢局部炎症激活状态而实现的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属妇产科医院

<120> 海藻提取物GV971在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用

<130> /

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggactachvg ggtwtctaat 20