具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

本发明提出了一种刺梨抗氧化寡肽及其制备方法、应用和抗氧化制品，下面将分别对其进行详细描述。

刺梨抗氧化寡肽

在本发明的一个方面，本发明提出了一种刺梨抗氧化寡肽。根据本发明的实施例，该刺梨抗氧化寡肽具有如SEQ ID NO：1、2或3所示的氨基酸序列。在研究过程中，发明人发现，刺梨中具有超高含量及活性的SOD，在刺梨贮藏过程中，无法从刺梨中分离纯化刺梨SOD，但是却检测出较高的SOD活性。进而，推测刺梨SOD可能降解为具有SOD活性的肽段。进一步地，发明人通过对刺梨中的寡肽进行提取，获得上述刺梨抗氧化寡肽，其抗氧化能力强，且具有的较高的超氧阴离子，羟自由基及DPPH自由基清除能力。

SEQ ID NO：1为Leu-Cys-Ser；

SEQ ID NO：2为Gly-Cys-Met；

SEQ ID NO：3为Ala-Cys-Gly。

制备上述刺梨抗氧化寡肽的方法

在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备上述刺梨抗氧化寡肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包含如下步骤：将刺梨鲜果进行打浆和第一离心处理，收集第一上清液；将第一上清液进行蛋白沉降及第二离心处理，收集沉淀；将沉淀进行纯化处理，以便得到上述刺梨抗氧化寡肽。上述制备方法操作简单，生产成本低。

根据本发明的实施例，打浆处理之前，将缓冲液与刺梨鲜果进行混合。通过缓冲液的加入，防止蛋白质变性，保证刺梨中抗氧化物质的稳定性。

根据本发明的实施例，刺梨鲜果与缓冲液的质量体积比为1：(0.5～2)(例如1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.7、1:1.9)，单位为g/mL，缓冲液的pH值为8.5～9.5(例如8.5、8.7、8.9、9.1、9.3、9.5)，打浆时间为2～5min(例如2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min、5min)。采用上述缓冲液的添加量和pH值，能够保证刺梨中蛋白质的稳定性，防止蛋白质变性；并且，采用上述打浆条件能更好的提出刺梨鲜果中的浆液。

根据本发明的实施例，进行第一离心处理之前，将打浆处理所得浆液于0～25℃(例如0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃)放置2～6h(例如2h、2.5h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h)，再将所得浆液进行过滤处理，收集滤液。通过上述低温放置，可使刺梨抗氧化中的寡肽完全渗透于浆液中，方便后期对刺梨鲜果中的抗氧化物质的提取。

根据本发明的实施例，第一离心处理的离心力为10000～12000g(例如10000g、10500g、11000g、11500g、12000g)，时间为10～20min(例如10min、12min、14min、16min、18min、20min)，温度为0～4℃(例如0℃、1℃、2℃、3℃、4℃)。由此，以便达到分离蛋白的目的，使得上清液中蛋白含量和纯度高。

根据本发明的实施例，蛋白沉降处理采用的沉降剂选自硫酸铵，所述硫酸铵的饱和度为60～80％，反应温度为0～4℃(例如0℃、1℃、2℃、3℃、4℃)，时间为6～12h(例如6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h)。通过上述蛋白沉降条件，使刺梨中的蛋白质完全析出，达到纯化蛋白质的目的。

根据本发明的实施例，第二离心处理的转速为10000～12000g(例如10000g、10500g、11000g、11500g、12000g)，时间为10～20min(例如10min、12min、14min、16min、18min、20min)，温度为0～4℃(例如0℃、1℃、2℃、3℃、4℃)。采用上述的离心条件，刺梨蛋白沉降液中的蛋白质完全沉淀，能够更好地将蛋白质分离出来。

根据本发明的实施例，纯化处理包括：将沉淀进行复溶和透析处理，收集透过液；将透过液进行除杂、酶解和超滤离心处理，收集过滤液，得到含有刺梨抗氧化寡肽的混合物。由此，将沉淀中的杂质去除，对沉淀中的蛋白质进行纯化，同时，蛋白质可酶解为肽段，方便后期得到高纯度的刺梨抗氧化寡肽。

根据本发明的实施例，复溶处理使用的复溶剂选自Tris-Hcl溶液，pH值为8.5-9.5(例如8.5、8.7、8.9、9.1、9.3、9.5)。采用上述复溶剂，能够将第二离心处理得到的沉淀进行溶解，使蛋白质溶解于复溶剂中，方便后期对刺梨抗氧化寡肽进一步提纯；并且，该复溶剂的添加，能够保证蛋白质的稳定性。

根据本发明的实施例，透析处理采用的滤膜孔径为1-10KDa(例如1KDa、3KDa、5KDa、10KDa)。采用上述孔径的滤膜，将蛋白质完全分离出来，以提高刺梨抗氧化寡肽的提取率。

根据本发明的实施例，除杂处理包括将活性炭与透过液进行混合，活性炭与透过液的重量体积比为(0.05～0.1):1(例如0.05:1、0.06:1、0.07:1、0.08:1、0.09:1、0.1:1)，混合时间为2～4h(例如2h、2.5h、3h、3.5h、4h)，再将所得混合液于0～4℃(例如0℃、1℃、2℃、3℃、4℃)、5000～10000g(例如5000g、6000g、7000g、8000g、9000g、10000g)的条件下离心10～20min(例如10min、12min、14min、16min、18min、20min)，收集上清液。发明人通过实验发现，刺梨汁中有大量多酚，多酚易氧化变色，通过活性炭能够去除包多酚等杂质，可防止后期存在的多酚对实验的影响。寡肽根据本发明的实施例，酶解处理采用的酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶的至少之一，酶活力为50～100U/g。采用上述的酶对蛋白质进行酶解，获得肽段，提高肽段得率。

根据本发明的实施例，酶解处理的反应温度为40～55℃(例如40℃、44℃、48℃、51℃、55℃)，反应时间为2～6h(例如2h、3h、4h、5h、6h)。由此，酶解处理的效果好，能将蛋白质完全酶解，使寡肽或者多肽获取率高。

根据本发明的实施例，超滤离心处理采用的超滤膜孔径为1-3KDa(例如1KDa、3KDa)。采用上述孔径的超滤膜，能够将刺梨抗氧化寡肽完全分离出来。

刺梨抗氧化寡肽的应用

在本发明的又一方面，本发明提出了一种如上述刺梨抗氧化寡肽或上述方法制备的寡肽在制备抗氧化制品中的应用。本发明的刺梨抗氧化寡肽的抗氧化能力强，可应用于医疗卫生行业、食品保健、化妆品等众多行业。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗氧化寡肽所描述的特征和优点，同样适用于该刺梨抗氧化寡肽的应用，在此不再赘述。

抗氧化制品

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗氧化制品。根据本发明的实施例，包括：刺梨抗氧化寡肽。上述的抗氧化制品可为但不限于药品、食品、化妆品等。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗氧化寡肽所描述的特征和优点，同样适用于该抗氧化制品，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：刺梨抗氧化寡肽的制备

如图1所示，刺梨抗氧化寡肽通过如下步骤制备：

1)将缓冲液加入至新鲜刺梨果中进行打浆处理，其中，缓冲液为50mM Tris-Hcl，pH值为8.8，刺梨鲜果1000g：缓冲液mL＝1：1，采用打浆机打浆5min，然后将打浆处理得到的浆液于25℃条件下浸提6h；

2)将浸提获得的浆液采用四层纱布进行过滤，然后于4℃、离心力为10000g条件下离心20min，收集上清液，上清液为粗酶提取物；

3)将步骤2)中的上清液于0℃条件下缓慢加入硫酸铵，直至硫酸铵的饱和度为70％，然后再硫酸铵充分溶解后于0℃条件下沉降12h，收集沉降液；

4)将沉降液于4℃、转速为10000g条件下离心20min，收集沉淀；

5)将pH值为8.8的50mM Tris-Hcl复溶液加入到沉淀中，然后采用10KDa滤膜透析24h，更换缓冲液6次；

6)将活性炭加入到透析液中除杂4h，然后于4℃、离心力为10000g条件下离心20min，收集沉淀，其中，活性炭添加量为透过液体积10％；

7)将质量比为1:1木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶加入到步骤7)的沉淀中，酶活力为100U/g，然后于50℃条件下酶解4h，得到酶解产物；

8)分别采用孔径为30KDa、10KDa、3KDa的超滤膜对酶解产物进行超滤，得到抗氧化肽组合1、抗氧化肽组合2、抗氧化肽组合3；

9)对3个抗氧化肽组合分别进行UPLC-ESI-QTOF-MS/MS结构鉴定，其中，色谱条件为采用Welch Ultimate UPLC XB-C18色谱柱(100mm x 2.1mm,1.8um)，UV检测波长220nm，柱温：40℃，流动相：0.1％TFA水溶液-乙睛，进样2μL，流速：0.3ml/min，梯度洗脱：0min，10％B；15min，15％B；30min，40％B；31min，95％B；35min，10％B；

质谱正离子模式检测条件；毛细管电压(Capillary Voltage)3000vV；离子源温度：500℃，雾化器：40psi，加热器：50psi，碰撞能量：6eV；一级相对分子质量扫描范围为：100～1500Da：二级相对分子质量扫描范围为：50～1500Da；

质谱产生的原始数据采用Mascot软件进行分析，结果通过检索Momordica-charantia.fasta数据库比对，共检测出了来自刺梨的28种肽段；

10)通过对上述28种肽段进行分析，通过多肽数据库比对，对推断具有一定的抗氧化活性的5种刺梨寡肽进行生物合成，合成由“北京博奥森生物技术有限公司”经固相合成、脱盐、纯化和转盐(转为醋酸根)处理，合成量20mg，纯度90％以上，具体参见图2；

其中，5种刺梨寡肽分别为：

SEQ ID NO：1为Leu-Cys-Ser；

SEQ ID NO：2为Gly-Cys-Met；

SEQ ID NO：3为Ala-Cys-Gly；

SEQ ID NO：4为Asp-Cys-Glu；

SEQ ID NO：5为Glu-Cys-Ala。

11)对生物合成后的5种刺梨寡肽进行体外超氧阴离子清除率、羟自由清除率、DPPH清除率检测，具体结果参见表1。

其中，超氧阴离子清除率测定：取2950μL pH8.2的Tris-Hcl缓冲液，加50μL连苯三酚溶液，迅速混合，开始计时，每隔30s读数325nm波长处吸光度(A₁)，至300s时为止(A₂)，计算ΔA₀＝A₁－A₂；取样品溶液，加Tris-Hcl缓冲液，再加连苯三酚溶液迅速混合，开始计时，每隔30s读数325nm波长处吸光度(A样1)，至300秒时为止(A样2)，计算ΔA样＝A样1－A样2。超氧阴离子清除率计算公式：

羟自由基清除测定：取1.0mL浓度为1.865mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液，分别加入浓度为0.2mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲液2mL和1mL不同质量浓度的样品，充分混匀后加入1.0mL浓度为1.865mmol/L的FeSO₄·7H₂O溶液，再次混匀后加入1.0mL 0.03％(V/V)的H₂O₂，于37℃恒温水浴，60min后，在532nm波长处分别测量各组混合溶液的吸光度得A_S，以蒸馏水代替样品作为空白组测吸光度得Ab，以蒸馏水替代H₂O₂作为损伤组，测光度An。·OH清除率的计算公式：

DPPH自由基清除测定：取DPPH溶液2mL，加95％乙醇(或无水乙醇)1mL，充分混合，测517nm波长处吸光度(A₀)；取DPPH溶液2mL，加样品液，再加95％乙醇(或无水乙醇)，混合，静置30min后，测517nm波长处吸光度(A)。DPPH自由基清除率计算见公式：

表1五种刺梨寡肽抗氧化性

上表中的对比序列为谷胱甘肽，由上表可知，本发明制得的刺梨寡肽的抗氧化性与谷胱甘肽的抗氧化性相近，因此，本发明得到的三种刺梨寡肽中均具有类似谷胱甘肽的抗氧化活性肽，其可作为谷胱甘肽的替代物。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。