具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

实施例1

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

1、生物素光亲和标记结合蛋白质组学鉴定马来酸茚达特罗靶向cGAS-STING通路。具体步骤为：

(1)将马来酸茚达特罗与光交联探针结合。将50mg马来酸茚达特罗(购自上海陶素生化科技有限公司)溶于5mL二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)中，并加入25.8mg探针二丫吡啶(3-(but-3-yn-1-yl)-3-(2-iodoethyl)-3H-diazirine)(购自上海毕得医药科技股份有限公司)及26mg碳酸钾，混匀溶液后在60℃搅拌12小时。反应结束后，加入10mL 超纯水降温，并通过乙酸乙酯萃取(2次，每次10mL)，用10mL盐水结合并洗涤有机层两次，用无水硫酸钠干燥。用闪蒸柱(二氯甲烷:甲醇＝30:1)层析纯化溶剂蒸发后剩余的残渣，得到带上光交联探针的马来酸茚达特罗(7mg)。

(2)活细胞原位标记鉴定马来酸茚达特罗-探针与潜在靶点蛋白的结合。将结直肠癌细胞HT29(购自ATCC)铺入6孔板中，待细胞密度长至80％-90％，去培养基，分别加入含有马来酸茚达特罗-探针浓度为0,7.5,15,30μM的无血清1640培养基(购自GIBCO)，在 37℃/5％CO2培养箱中孵育4.5小时。孵育结束后，去培养基，用预冷PBS洗两次，将6孔板置于冰上，用365nm UV光照10分钟。光照结束后，用RIPA裂解液(购自上海碧云天生物技术有限公司)裂解细胞，每孔100μL，4℃，14000×g离心20分钟后收集蛋白上清，并用BCA试剂(购自Thermo Fisher Scientific)测蛋白浓度。各组取等量蛋白，加入现配的点击化学反应试剂(50μM TAMEA-N3，0.1mM TBTA，1mM TCEP，1mM CuSO4，购自 Sigma-Aldrich及ClickChemistry Tools)，在混匀仪上室温反应两小时。反应结束后，用500μM 预冷丙酮结束反应，在-20℃孵育1小时沉淀蛋白。沉淀的蛋白通过4℃/14000×g离心分离，并用30μL含有1×loading buffer的SDS裂解液重溶，95℃水浴10分钟。各组取等量样品用 10％SDS-PAGE胶跑电泳，电泳结束后的凝胶用Typhoon 9500荧光凝胶扫描仪(Amersham Biosciences)扫描荧光成像，并用考马斯亮蓝染色、拍照。

(3)下拉-质谱联用鉴定马来酸茚达特罗潜在靶点蛋白。

将结直肠癌细胞HT29(购自ATCC)铺入10cm细胞皿中，待细胞密度长至80％-90％，去培养基，分别加入含有马来酸茚达特罗-探针浓度为0,30μM的无血清1640培养基(购自GIBCO)，在37℃/5％CO2培养箱中孵育4.5小时。孵育结束后，去培养基，用预冷PBS洗两次，将细胞皿置于冰上，用365nm UV光照10分钟。光照结束后，用RIPA裂解液(购自上海碧云天生物技术有限公司)裂解细胞，每皿1mL，4℃，14000×g离心20分钟后收集蛋白上清，并用BCA试剂(购自Thermo Fisher Scientific)测蛋白浓度。各组取等量蛋白，加入现配的点击化学反应试剂(50μM Biotin-N3，0.1mM TBTA，1mM TCEP，1mM CuSO4，购自Sigma-Aldrich及Click Chemistry Tools)，在混匀仪上室温反应两小时。反应结束后，用 500μM预冷丙酮结束反应，在-20℃孵育1小时沉淀蛋白。用含1％SDS的PBS重溶蛋白，并与80μL链霉亲和素琼脂糖珠4℃孵育过夜。通过4℃/2500rpm离心10分钟收集琼脂糖珠，并用50μL SDS裂解液裂解蛋白。

各组加入等体积的8M尿素溶液，加入终浓度为50mM的DTT溶液，37℃水浴反应1 小时。加入终浓度为150mM的IAA溶液，室温避光反应30分钟。将反应后的溶液加入预先用50mMTEAB(购自Sigma-Aldrich)润洗的30kD超滤管中，并用分别用200μL尿素润洗两次，用200μLTEAB润洗五次。在超滤管中加入20μg质谱级胰酶(购自北京华利世科技有限公司)，37℃孵育过夜。酶解后的肽段溶液通过MonoTIPTM C18除盐柱(购自GL Sciences)除盐，并用Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer质谱仪(购自Thermo Fisher Scientific)进行质谱分析，原始数据用Spectronaut软件(Omicsolution Co.,Ltd.)进行搜库。

2、体外水平验证马来酸茚达特罗靶向cGAS。具体步骤为：

(1)下拉-蛋白质印迹法联用验证马来酸茚达特罗靶向cGAS。

将结直肠癌细胞HT29(购自ATCC)铺入10cm细胞皿中，待细胞密度长至80％-90％，去培养基，分别加入含有马来酸茚达特罗-探针浓度为0,30μM的无血清1640培养基(购自GIBCO)，在37℃/5％CO2培养箱中孵育4.5小时。孵育结束后，去培养基，用预冷PBS洗两次，将细胞皿置于冰上，用365nm UV光照10分钟。光照结束后，用RIPA裂解液(购自上海碧云天生物技术有限公司)裂解细胞，每皿1mL，4℃，14000×g离心20分钟后收集蛋白上清，并用BCA试剂(购自Thermo Fisher Scientific)测蛋白浓度。各组取等量蛋白，加入现配的点击化学反应试剂(50μM Biotin-N3，0.1mM TBTA，1mM TCEP，1mM CuSO4，购自Sigma-Aldrich及Click Chemistry Tools)，在混匀仪上室温反应两小时。反应结束后，用 500μM预冷丙酮结束反应，在-20℃孵育1小时沉淀蛋白。用含1％SDS的PBS重溶蛋白，并与80μL链霉亲和素琼脂糖珠4℃孵育过夜。通过4℃/2500rpm离心10分钟收集琼脂糖珠，并用50μL含1×loadingbuffer的SDS裂解液裂解蛋白。各组取等量样品用10％SDS-PAGE 胶跑电泳进行蛋白印迹实验，用目标蛋白cGAS抗体孵育条带并显影。

(2)细胞水平敲除cGAS验证马来酸茚达特罗靶向cGAS。

用sgcGAS质粒构建敲除内源cGAS蛋白的HT29细胞株。sgcGAS质粒购自广州艾基生物技术有限公司，sgRNA片段为CGCATCCCTCCGTACGAGAA，质粒载体为lentiCRISPRv2。取对数期的293T细胞(购自ATCC)以50％的密度接种到6孔板中，培养12小时；在opti-MEM (购自Thermo Fisher Scientific)中将sgcGAS质粒与包装质粒PSPAX2(购自Addgene)及 PMD2G(购自Addgene)分别混合，并加入p3000(购自Life Science)，同时另取一管opti-MEM 加入Lipo3000(Life science)，两管分别混匀静置5分钟后，混匀静置20分钟；将293T细胞换液，并加入上述混合好的转染试剂，置于培养箱中培养6小时后更换新鲜的完全培养基培养48小时，收集细胞上清离心去除细胞碎片，并用0.45μm滤器过滤彻底去除碎片。将过滤后的上清加入到提前1天以30％的密度接种好HT29细胞的6孔板中感染24小时，去除含病毒培养基换成新鲜培养基。48小时后加入嘌呤霉素(1μg/mL)进行筛选，每两天换一次液，筛选一周后更换成正常培养基培养，检测cGAS蛋白敲除情况，保种备用。

敲除cGAS的HT29细胞及对照组细胞分别裂解取蛋白，用BCA法测浓度后取等量加入5×loading buffer制样，用10％SDS-PAGE凝胶进行蛋白印迹实验，转膜后的条带孵育cGAS 抗体(购自ABclonal)检测cGAS敲除情况。将对照组及敲除cGAS组的HT29细胞分别铺入96孔板中，每孔3000个细胞。培养12小时后，去培养基，两组各分两个马来酸茚达特罗处理浓度(0,15μM)处理24小时，用CCK8试剂(购自上海陶素生化科技有限公司)检测细胞增殖。

3、体外水平验证马来酸茚达特罗激活cGAS-STING通路。具体步骤为：

(1)cGAMP酶联免疫吸附法鉴定马来酸茚达特罗处理后结直肠癌细胞内cGAMP水平。将HT29细胞铺入6孔板中，每孔1.2×106个细胞，培养12小时。更换含有马来酸茚达特罗浓度分别为0,15,30μM的1640完全培养基培养48小时。处理结束后，去培养基，用PBS洗两次，用M-PER MAMMALIAN PROTEIN EXTRACTION REAGENT裂解液(购自Thermo FisherScientific)裂解细胞，用cGAMP ELISA试剂盒(购自Cayman Chemical)检测胞内的 cGAMP水平。

(2)蛋白质印迹法鉴定马来酸茚达特罗处理后cGAS-STING下游蛋白水平。将HT29细胞铺入6孔板中，待细胞密度达到60％后，分别加入含有马来酸茚达特罗浓度分别为0,15,30 μM的1640完全培养基培养48小时。处理结束后，各组细胞分别裂解取蛋白，用BCA法测浓度后取等量加入5×loading buffer制样，用10％SDS-PAGE凝胶进行蛋白印迹实验，转膜后的条带孵育pSTING抗体、pTBK1抗体、pIRF3抗体(均购自ABcloncal)及β-Actin抗体(购自Bioworld)检测cGAS-STING通路下游激活情况。

(3)IFNβ酶联免疫吸附法鉴定马来酸茚达特罗处理后结直肠癌细胞上清中IFNβ水平。将HT29细胞铺入6孔板中，每孔1.2×106个细胞，培养12小时。更换含有马来酸茚达特罗浓度分别为0,15,30μM的无血清1640培养基培养48小时。处理结束后，收集细胞上清， 4℃/1000×g离心去除细胞碎片，用Human IFN-βELISA试剂盒(购自杭州联科生物技术股份有限公司)检测细胞培养上清中的IFNβ水平。

生物素光亲和标记结合蛋白质组学鉴定马来酸茚达特罗靶向cGAS-STING通路。

马来酸茚达特罗与光交联探针结合后的核磁共振氢谱如图1A所示，结果显示二者成功结合。活细胞原位标记实验结果如图1B所示，在荧光成像(左)中，随着马来酸茚达特罗- 探针浓度的增加，其下拉的蛋白量也呈现递增趋势，考马斯亮蓝染色的全蛋白(右)作为内参，表明马来酸茚达特罗-探针能够下拉与其结合的潜在靶点蛋白。如图1C所示，通过下拉 -质谱联用分析，cGAS是在马来酸茚达特罗-探针能够下拉检测到，而对照组中检测不到的马来酸茚达特罗潜在靶点蛋白。

体外水平验证马来酸茚达特罗靶向cGAS。

如图2A所示，在对照组及马来酸茚达特罗-探针组的全蛋白裂解液中，均能够检测到等量的cGAS蛋白，而在对照组和用马来酸茚达特罗-探针下拉的蛋白裂解液中，仅有后者能够检测到cGAS蛋白，说明马来酸茚达特罗-探针能够与cGAS蛋白特异性结合并将其下拉。如图2B所示，通过蛋白印迹法检测敲除内源cGAS蛋白的HT29细胞株及对照组细胞株的cGAS蛋白表达情况，cGAS内源蛋白敲除成功；如图2C所示，敲除cGAS的HT29细胞较对照组细胞对于马来酸茚达特罗的敏感性更弱，在同样浓度同样时间的马来酸茚达特罗处理下，敲除cGAS的HT29细胞生存能力更强，说明马来酸茚达特罗抑制HT29细胞生长是通过cGAS 进行的。

体外水平验证马来酸茚达特罗激活cGAS-STING通路。

如图3A所示，随着马来酸茚达特罗处理浓度的升高，细胞内的cGAMP水平也呈现递增趋势，说明马来酸茚达特罗能够靶向激活cGAS产生cGAMP，cGAMP进一步激活STING及下游通路。如图3B所示，随着马来酸茚达特罗处理浓度的升高，cGAS-STING通路STING、 TBK1、IRF3蛋白的激活形式pSTING、pTBK1、pIRF3蛋白量均呈现递增趋势，说明马来酸茚达特罗能够激活cGAS-STING通路。如图3C所示，随着马来酸茚达特罗处理浓度的升高，细胞上清中的IFNβ水平也呈现递增趋势，说明马来酸茚达特罗处理能够激活cGAS-STING通路进而激活下游I型干扰素的生成。

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上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。