Nrf2激活剂在制备抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解药物中的应用
阅读说明：本技术 Nrf2激活剂在制备抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解药物中的应用 (Application of Nrf2 activator in preparation of medicine for resisting osteolysis induced by artificial joint wear particles ) 是由 徐以明 马金忠 桑伟林 朱力波 王聪 陆海明 薛松 钟毅鸣 毛信杰 陈宏杰 于 2021-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了Nrf2激活剂在制备抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解药物中的应用,研究表明人工关节假体磨损颗粒能够抑制细胞内核因子E-2-相关因子2(Nrf2)的表达,降低Nrf2下游调控的抗氧化反应元件(ARE)活性,细胞内控制氧化还原反应的能力下降,导致成骨细胞内活性氧(ROS)与脂质过氧化产物丙二醛(MDA)增加,使得ROS生成与降解稳态失调,抑制了成骨细胞活性,打破了破骨细胞与成骨细胞之间的平衡。加入Nrf2激活剂Oltipraz后,可以明显降低细胞内ROS的含量,抑制脂质过氧化产物MDA的生成。此外通过将CoCrMo纳米磨损颗粒植入小鼠颅骨皮下建立小鼠颅骨溶解模型,腹腔注射Oltipraz施加有效干预,体内实验进一步证实Oltipraz对人工关节磨损颗粒所诱导的骨溶解存在显著的抑制效应。(The invention discloses application of an Nrf2 activator in preparation of an anti-artificial joint wear particle induced osteolysis drug, and researches show that artificial joint prosthesis wear particles can inhibit expression of an intracellular nuclear factor E-2-related factor 2(Nrf2), reduce activity of an Antioxidant Response Element (ARE) regulated and controlled at the downstream of Nrf2, reduce capacity of controlling redox reaction in cells, increase active oxygen (ROS) in osteoblasts and Malondialdehyde (MDA) which is a lipid peroxidation product, enable the ROS to generate and degrade homeostatic disorder, inhibit activity of the osteoblasts, and break balance between osteoclasts and the osteoblasts. After the Nrf2 activator Octopraz is added, the content of ROS in cells can be obviously reduced, and the generation of lipid peroxidation product MDA can be inhibited. In addition, a mouse skull dissolution model is established by implanting CoCrMo nano wear particles into the mouse skull under the skin, and effective intervention is exerted by intraperitoneal injection of the Octopraz, and in vivo experiments further prove that the Octopraz has a remarkable inhibition effect on osteolysis induced by artificial joint wear particles.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及Nrf2激活剂在制备抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解药物中的应用。
背景技术
人工关节置换术是治疗晚期骨性关节炎的重要手段之一，取得了不错的近远期疗效，但人工关节置换术后假体周围骨溶解仍是困扰临床医生的一大难题。在长期使用人工关节假体的过程当中会产生磨损颗粒(如钛，聚乙烯，陶瓷等)，这些磨损颗粒会聚集在骨骼与假体之间的界膜上，刺激假体周围组织发生各种炎症反应，进而导致破骨增强而成骨减弱，致使骨吸收与骨生成失衡，不可避免地发生人工关节无菌性松动。随之而来的翻修手术更加复杂并且昂贵，大大加重社会负担。因此，针对人工关节置换术后假体周围骨溶解所导致的人工关节无菌性松动研发具体有效的治疗方法是当下亟需解决的重要难题。
Nrf2(由NFE2L2基因编码)调节涉及细胞稳态的约250个基因，包括抗氧化剂蛋白，解毒酶，药物转运蛋白和许多细胞保护蛋白。Nrf2靶向与细胞防御相关的基因，其中包含抗氧化反应元件，药物代谢酶，分子伴侣DNA修复酶和蛋白酶体亚基。Nrf2的激活诱导细胞保护和解毒基因的转录，增强了先天免疫系统的活性，从而减弱或消除了许多细菌和病毒病原体
Oltipraz又名毗嘎硫酮，是一种合成的二硫代乙硫酮，具有抗氧化、抗癌和再生等多种活性，是强效的Nrf2激活剂。研究表明，Oltipraz可以通过Nrf2/NQO1信号通路预防高糖诱导的氧化应激和细胞凋亡，预防糖尿病性周围神经病变。
中国专利文献CN112535684A公开了Oltipraz可以通过Nrf2途径降低紫外线导致的光损伤成纤维细胞中ROS的表达水平，即在皮肤紫外线防护、抗光损伤中具有重要作用，但其在人工关节磨损颗粒诱导骨溶解的作用机制目前还不明确。中国专利文献CN112972475A公开了奥替普拉在制备防治骨质疏松产品中的应用。所述应用包括如下任一项：1)制备用于防治活性维生素D缺乏引起的骨质疏松产品；2)制备用于防治雌激素缺乏导致的骨质疏松产品；3)制备用于防治维生素D受体缺失导致的骨质疏松产品。但关于本发明Nrf2激活剂Oltipraz在制备抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解药物中的应用目前还未见报道。Oltipraz的结构式如下：
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供Nrf2激活剂在制备抗人工关节磨损颗粒所诱发的骨溶解药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
第一方面，提供了Nrf2激活剂在制备抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解药物中的应用。
在本发明的另一方面，提供了Nrf2激活剂在制备改善人工关节磨损颗粒诱导成骨细胞内抗氧化反应元件下调药物中的应用。
在本发明的另一方面，提供了Nrf2激活剂在制备改善人工关节磨损颗粒诱导成骨细胞内ROS清除能力药物中的应用。
在本发明的另一方面，提供了Nrf2激活剂在制备抑制人工关节磨损颗粒诱导成骨细胞内脂质过氧化产物过量积累药物中的应用。
优选地，所述的抗氧化反应元件包括HO-1和NQO-1。
优选地，所述的脂质过氧化产物包括MDA。
如上任一所述的Nrf2激活剂为Oltipraz。
在本发明的另一方面，提供一种抗人工关节磨损颗粒诱导假体周围骨溶解药物组合物，所述的药物组合物以Nrf2激活剂Oltipraz为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种改善人工关节磨损颗粒诱导成骨细胞内抗氧化反应元件下调药物组合物，所述的药物组合物以Nrf2激活剂Oltipraz为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种改善人工关节磨损颗粒诱导成骨细胞内ROS清除能力药物组合物，所述的药物组合物以Nrf2激活剂Oltipraz为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种抑制人工关节磨损颗粒诱导成骨细胞内脂质过氧化产物过量积累药物组合物，所述的药物组合物以Nrf2激活剂Oltipraz为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。
优选地，如上任一所述药物组合物的剂型为外用剂型或内用剂型。
更优选地，所述药物组合物的剂型为贴剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、巴布剂、喷雾剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、口服液或注射液。
在本发明的另一方面，提供Nrf2激活剂Oltipraz作为靶点在筛选抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解药物、改善人工关节磨损颗粒诱导成骨细胞内抗氧化反应元件下调药物、改善人工关节磨损颗粒诱导成骨细胞内ROS清除能力药物或抑制人工关节磨损颗粒诱导成骨细胞内脂质过氧化产物过量积累药物中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明实验结果表明：(1)Oltipraz能够改善人工关节磨损颗粒诱导假体周围成骨细胞内Nrf2的表达能力，提升下游抗氧化反应元件的活性；(2)Oltipraz能够改善CoCrMo磨损颗粒诱导脂质过氧化产物堆积，抑制细胞内ROS的产生；(3)在体内水平Oltipraz干预后，能够有效延缓CoCrMo磨损颗粒诱导的小鼠颅骨溶解程度，进一步证实Oltipraz在延缓磨损颗粒诱导的骨溶解疾病中的有效性，为人工关节磨损颗粒诱导假体周围骨溶解所导致的无菌性松动提供了新的治疗策略，实用性强，应用前景广。
附图说明
图1.Western Blot检测提纯后的成骨细胞总蛋白中Nrf2相关蛋白的表达情况。
图2.流式细胞术检测磨损颗粒诱导的成骨细胞内ROS含量以及分光光度仪检测细胞内脂质过氧化产物MDA的情况。
图3.CCK8检测不同处理组中成骨细胞活性变化情况。
图4.Western Blot检测提纯后的不同处理组中Nrf2相关蛋白的表达情况。
图5.流式细胞术检测不同处理组中成骨细胞内ROS含量以及分光光度仪检测细胞内脂质过氧化产物MDA的情况。
图6.透射电镜检测不同处理组中成骨细胞形态及线粒体超微结构改变情况。
图7.激光共聚焦显微镜检测不同处理组中Nrf2的表达情况。
图8.Micro CT检测不同处理组中颅骨溶解程度及骨骼参数情况。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1 Nrf2激活剂Oltipraz在制备抗人工关节磨损颗粒诱导骨溶解体内外研究
1材料和方法
1.1小鼠成骨细胞系的培养
小鼠成骨细胞系MC3T3-E1购于中科院生化细胞所，使用α-MEM培养基(含有10％的胎牛血清和1％的青链霉素)，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱内培养。
1.2人工关节磨损颗粒的制备
CoCrMo磨损颗粒由南京凯斯特金属制品有限公司研磨而成，CoCrMo颗粒在180℃下灭菌6小时，浸入75％乙醇中48小时，按40mg/ml然后将CoCrMo颗粒充分分散于无菌磷酸盐缓冲液PBS(Solarbio，中国)，保存在4℃环境中。每次使用前将CoCrMo颗粒悬浮液超声处理30分钟。
1.3 Western blot
不同组间处理完成后，使用细胞核/质蛋白分离提取试剂盒提纯细胞质蛋白以及细胞核蛋白，分别将蛋白经过BCA法测量蛋白浓度，进一步在总蛋白裂解液中加入适量5×Loading Buffer缓冲液，所得体系经过加热变性后冷却，即可进行SDS-PAGE蛋白电泳实验。所涉及的蛋白指标包括Nrf2、keap1、NQO-1及HO-1等。
1.4 ROS检测(DCFH-DA试剂盒)
提前用α-MEM将DCFH-DA探针稀释10μmol/ml，4℃避光保存备用。将MC3T3-E1细胞以1×106/ml接种于六孔板中，于细胞培养箱中培养36h，细胞完全贴壁后，不同组间分别加入含有不同浓度的CoCrMo颗粒培养基(0，50，100μg/ml)处理后24h。弃去上层旧培养基，使用1×PBS缓冲液洗涤两次，加入1.5ml稀释好的DCFH-DA探针，使之能充分覆盖培养皿底部，37℃孵育30min。用1×PBS溶液充分洗涤细胞，以充分去除未进入细胞的探针。通过荧光酶标仪在488nm处检测荧光强度。
1.5 MDA含量检测
将MC3T3-E1细胞以1×106/ml接种于六孔板中，于细胞培养箱中培养36h，细胞完全贴壁后，不同组间分别加入含有不同浓度的CoCrMo颗粒培养基(0，50，100μg/ml)处理24h。处理结束后，用1×PBS缓冲液清洗2次，每个培养基中加入1ml胰蛋白酶消化2分钟，将细胞悬液移入1.5ml EP管中，3000r/min离心10分钟，收集沉淀细胞，再加入0.4ml 1×PBS缓冲液悬浮细胞，在对照组中加入100μl的RIPA裂解液作为阴性对照，其他组中加入200μl的MDA检测工作液。1000g离心15min后，各管分别取上清200μl加入酶标板中，检测酶标仪在532nm处测定吸光度。
1.6 CCK8检测细胞活性
将MC3T3-E1细胞以每孔8×103个铺于96孔板内，待细胞贴壁后吸掉细胞培养基上清，分别加入100μg/ml的CoCrMo颗粒培养基和梯度浓度Oltipraz(0，10，20μM/ml)预处理12小时后，加入含10％CCK8的培养基，孵育1小时，使用紫外分光光度计于450nm波长处测定吸光度。
1.7透射电镜检测细胞形态及线粒体超微结构
不同浓度的CoCrMo颗粒(0，50μg/ml)以及梯度浓度Oltipraz(0，10μM/ml)预处理MC3T3-E1细胞12h，使用1ml 0.25％胰蛋白酶消化各组细胞，1×PBS缓冲液清洗2次，使用戊二醛固定液与4℃固定4h，制备透射电镜扫描切片，最后在透射电镜下观察细胞线粒体超微结构并拍照。
1.8激光共聚焦显微镜
不同处理组后，使用4％多聚甲醛室温下固定细胞20-30分钟，使用0.5％TritonX-100破膜15分钟后，加入1％BSA牛血清蛋白孵育30分钟，结束后使用相应的抗体在4℃环境下孵育过夜。使用1×PBS缓冲液洗涤三次，每次10分钟，使用荧光二抗孵育1小时。接着使用DAPI染色15分钟，用1×PBS缓冲液洗涤一次后在应该显微镜下拍照。
1.9磨损颗粒诱导的颅骨溶解模型建立及干预措施
将C57BL/6J小鼠麻醉后，固定在固定板上，然后小鼠颅骨皮肤从正中切开并剔除骨膜，将40mg/ml的CoCrMo纳米颗粒注射至皮下，小心缝合好皮肤。待小鼠完全苏醒后，将小鼠放回笼内饲养。术后三天进行小鼠腹腔注射给药实验。
本实验主要分为4组(每组5只)，主要分组如下：第一组为空白处理组(每组5只)；第二组为模型组，即在小鼠颅骨建立磨损颗粒诱导的溶解模型；第三组为低浓度Oltipraz干预组：在小鼠颅骨溶解模型建立后，每个三天进行一次腹腔注射低浓度Oltipraz(1mg/kg)；第四组为高浓度Oltipraz干预组：在小鼠颅骨溶解模型建立后，每隔三天进行一次腹腔注射高浓度Oltipraz(2mg/kg)。术后第14天取小鼠颅骨，使用4％多聚甲醛固定后进行MicroCT检测。
2结果
2.1 Western blot检测不同处理组中蛋白的表达情况
图1表示不同浓度CoCrMo磨损颗粒诱导的成骨细胞内细胞质和细胞核中Nrf2的含量以及下游ARE中NQO-1、HO-1蛋白的表达情况；随着磨损颗粒浓度的逐渐增加，胞内和核内Nrf2蛋白含量以及ARE蛋白含量表达逐渐下降。
2.2 ROS生成情况以及MDA生成含量
图2表示不同浓度CoCrMo磨损颗粒刺激的成骨细胞后，成骨细胞内ROS含量与MDA含量均显著增加。(*示意p＜0.05，**示意p＜0.01，均与Ctrl组比较)
2.3 CCK8检测不同处理组成骨细胞活性
图3表示在CoCrMo颗粒刺激成骨细胞后，成骨细胞数量与活性明显下降，而在CoCrMo颗粒刺激成骨细胞前梯度浓度Oltipraz，0，10，20μmol/ml)预处理成骨细胞12小时，显著延缓CoCrMo颗粒对成骨细胞的活性抑制作用。
2.4不同处理组中蛋白的表达情况
图4表示CoCrMo颗粒刺激成骨细胞前用梯度浓度Oltipraz(0，5，10，20μmol/ml)预处理成骨细胞12小时，可以显著提高CoCrMo颗粒诱导的成骨细胞内的Nrf2含量及ARE表达情况。
2.5不同处理组ROS生成情况以及MDA生成含量
图5表示梯度Oltipraz(0，10，20μmol/ml)预处理成骨细胞12小时后，可以显著抑制CoCrMo颗粒诱导成骨细胞内ROS的含量，并且可以明显抑制成骨细胞内MDA生成，提升了成骨细胞抗氧化反应的能力。(*示意p＜0.05，**示意p＜0.01，与CoCrMo组比较)
2.6透射电镜显示成骨细胞在不同处理后线粒体的超微结构变化
图6表示50μg/ml的CoCrMo颗粒处理MC3T3-E1细胞24小时后，成骨细胞膜断裂，线粒体变小，线粒体嵴减少或消失，线粒体外膜断裂，而20μmol/ml Oltipraz预处理成骨细胞12小时可以显著抑制CoCrMo颗粒对成骨细胞的损害作用。
2.7激光共聚焦显微镜显示不同处理组中Nrf2的含量
图7表示激光共聚焦检测不同处理组(Ctrl、CoCrMo颗粒处理组和CoCrMo颗粒处理组+梯度浓度Oltipraz处理组)Nrf2的表达情况，梯度Oltipraz(10，20μmol/ml)预处理成骨细胞12小时后，可以显著提高CoCrMo颗粒诱导的成骨细胞内的Nrf2含量。
2.8 MicroCT检测不同处理组中颅骨溶解程度
图8表示CoCrMo磨损颗粒诱导组中颅骨溶解程度显著增加，该组的BV/TV、Tb.N、Tb.Th和SMI参数显著降低，而Tb.Sp显著增加，但当在颅骨溶解模型中加入梯度浓度的Oltipraz(10，20μmol/ml)后，BV/TV、Tb.N、Tb.Th和SMI参数逐渐上升、Tb.Sp则逐渐降低(*示意p＜0.05，**示意p＜0.01，与Ctrl组比较；#示意p＜0.05，##示意p＜0.01，与CoCrMo+Oltipraz(1mg/kg)组比较)。
3结论
综上所述：CoCrMo纳米磨损颗粒能够抑制成骨细胞内核因子E-2-相关因子2(Nrf2)的表达，降低Nrf2下游调控的抗氧化反应元件(ARE)活性，细胞内控制氧化还原反应的能力下降，导致成骨细胞内ROS与脂质过氧化产物MDA增加，使得ROS生成与降解稳态失调，抑制了成骨细胞活性；进一步研究发现加入Nrf2激活剂Oltipraz后，显著抑制上述病理过程；此外，在体内水平施加Oltipraz的有效干预，可以显著减缓CoCrMo磨损颗粒所诱导的体内颅骨溶解。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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