蛋白酪氨酸磷酸酶shp2抑制剂在制备治疗骨关节炎药物中的应用
阅读说明：本技术 蛋白酪氨酸磷酸酶shp2抑制剂在制备治疗骨关节炎药物中的应用 (Application of protein tyrosine phosphatase SHP2 inhibitor in preparation of medicine for treating osteoarthritis ) 是由 孙洋 徐强 刘倩倩 王美晶 于 2020-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一类可用于治疗骨关节炎的SHP2的变构抑制剂SHP099。针对DMM模型及自然衰老诱导的小鼠骨关节炎的疾病模型,SHP099均能有效抑制小鼠膝关节软骨缺损并促进软骨的修复效果。在细胞水平,SHP099显著降低IL-1β刺激下的软骨降解酶的水平并促进软骨合成基因的表达,从而实现对软骨合成和分解代谢的双重调控。此外,SHP099还具有浓度梯度的促进软骨细胞分化作用。(The invention discloses an allosteric inhibitor SHP099 of SHP2 for treating osteoarthritis. Aiming at a DMM model and a disease model of osteoarthritis of mice induced by natural aging, SHP099 can effectively inhibit cartilage defect of knee joints of the mice and promote the cartilage repair effect. At the cellular level, SHP099 significantly reduces the level of cartilage degrading enzymes under IL-1 β stimulation and promotes the expression of cartilage synthesis genes, thereby achieving dual regulation of cartilage synthesis and catabolism. In addition, SHP099 has concentration gradient effect in promoting chondrocyte differentiation.)
一、技术领域
本发明属于制药技术领域。
二、背景技术
骨关节炎(OA)是中老年最常见的关节疾病，其病理特征为软骨结构的破 坏，关节间隙变窄，软骨下骨的硬化及边缘骨赘的形成并伴随着滑膜的炎症的发 生。OA早期的主要症状包括关节疼痛、晨僵和压痛等短暂的关节运动障碍，随 后会发展成为关节肿胀以及关节畸形等，严重影响了病人的生活质量。据统计， 60岁以上的人中发病率为50％，而在75岁老人中发病率高达80％。但到目前为 止，还没有公认的能改变骨关节炎疾病进程的的有效治疗策略，现有的治疗技术 主要是提供一些药物用于对骨关节炎患者疼痛症状的缓解。目前，在骨关节炎的 药物治疗中，首选药物依然是非甾体抗炎药。特异性的COX-2抑制剂如塞来昔 布罗非昔布等胃肠道安全性虽然优于传统的非甾体抗炎药，但经过长期研究表 明，长时间使用特异性COX-2抑制剂也可能增加心血管事件的风险，如心肌梗 塞、心血管血栓，受到FDA的警告。
SHP099作为蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的变构抑制剂于2016年被开发，对该 化合物的研究主要集中在抗肿瘤方面。关于其治疗骨疾病，尤其是治疗骨关节炎 的独特药理作用方面，迄今未见报道。本发明主要发现了SHP099对小鼠骨关节 炎模型具有显著的改善作用。
SHP099结构式如下：
三、
发明内容
为了解决现有的临床治疗骨关节炎药物均用来消炎镇痛，还没有一种逆转改 变OA进程的药物，本发明案例提供了一种蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂SHP099可用于骨关节炎相关疾病的治疗。
对DMM手术诱导的小鼠骨关节炎模型，腹腔给药SHP099 10mg/kg能显 著降低OARSI评分。该化合物在软骨细胞上具有双向调控，一方面能抑制 Mmp13、Mmp3等用于降解软骨基质的基质金属蛋白酶的表达，从而抑制软骨 细胞的降解；另一方面还可以促进软骨合成marker如Aggrecan、Col2a1的表达 从而促进软骨合成。
以上结果提示，SHP099能改善小鼠骨关节炎的相关症状，尤其对软骨细胞 具有明显的作用，故其可在骨关节炎的治疗药物中得到应用。
附图说明
图1SHP099抑制DMM手术诱导的小鼠软骨损伤。
图1-A为SHP099给药治疗DMM手术诱导的OA模型下的番红固绿染色结 果；图1-B为SHP099给药治疗DMM手术诱导的OA模型下的OA关节软骨损 伤评分结果；图1-C为SHP099给药治疗DMM手术诱导的OA模型下的关节软 骨组织中的OA相关marker的表达的IHC和IF结果；图1-D为SHP099给药治 疗DMM手术诱导的OA模型下的关节软骨组织中的OA相关marker表达的统 计结果。给药治疗后结果以平均数±标准差表示。*：P<0.05，**：P<0.01，***： P<0.001vs DMM(Student’s-t test)。
图2SHP099促进自然衰老条件下的小鼠软骨损伤修复。
图2-A为SHP099给药治疗衰老小鼠(20M)6周后的关节部位番红固绿染 色结果；图2-B为SHP099给药治疗老年小鼠6周后的关节软骨厚度；图2-C为 SHP099给药治疗后老年小鼠关节软骨组织中的OA相关marker表达的IHC结果； 结果以平均数±标准差表示；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001vs PBS组 (Student’s-t test)。
图3在细胞水平上，SHP099抑制软骨降解，促进软骨合成。
图3：A-F分别为IL-1β诱导条件下SHP099对软骨降解相关基因Mmp3、 Mmp13、Adamts5和软骨合成相关基因Sox9、Col2a1、Acan等基因的mRNA水 平影响。图3-G为IL-1β诱导条件下SHP099对MMP3、MMP13、SOX9等蛋白 水平影响。图3-H为SHP099对软骨细胞存活的影响。结果以平均数±标准差表 示；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001vs IL-1β(Student’s-t test)。
图4SHP099促进OA病人软骨外植体ECM的合成。
图4:A-B为SHP099作用下OA病人软骨外植体的番红固绿染色结果。结 果以平均数±标准差表示：**：P<0.01，***：P<0.001vs 0(Student’s-t test)。
图5SHP099促进软骨细胞分化。
图5-A为SHP099对原代软骨细胞分化的阿尔新蓝染色结果；图5:B-D为 SHP099对原代软骨细胞过程中软骨合成相关基因Sox9、Col2a1、Acan的mRNA 水平影响。结果以平均数±标准差表示：**：P<0.01，***：P<0.001vs DM (Student’s-t test)。
具体实施方式
SHP099购自MCE。
实施例1：SHP099抑制DMM手术诱导的小鼠软骨损伤
技术方法：内侧半月板失衡(DMM)手术诱导的小鼠骨关节炎模型[1]、免疫组 织化学染色、免疫荧光、番红固绿染色
取野生的C57BL/6雄性小鼠，8-10周龄，饲养于SPF级动物房，21±2℃， 自由饮水取食，12h昼夜交替。用阿弗丁(350ul-400ul)麻醉小鼠后，将小鼠右腿 膝关节毛发刮去，暴露膝关节，用手术刀片切断内侧半月板-胫骨韧带，游离内 侧半月板。第二天，将小鼠随机分为3组，正常组(Sham组)，模型组(DMM 组)，SHP099(10mg/kg)组。DMM+SHP099组按腹腔给药，每天一次，每次 100μl，正常组和模型组给予等量PBS。给药治疗42天后，最后实验动物进行 安乐死，取其右腿进行固定脱水包埋切片，进行番红固绿染色观察其软骨损伤修 复情况，对其胫骨损伤进行评分，评分标准按照国际骨关节炎研究协会(OARSI，Osteoarthritis Research Society International)制定的骨关节炎软骨病理评价体系OARSI Score system[1]来进行。
实施例3：SHP099促进自然衰老模型下的软骨损伤修复。
技术方法：自然衰老模型、番红固绿染色
野生的C57BL/6雄性小鼠，饲养至20个月大，生长条件同上。将小鼠随机 分为2组，PBS组和SHP099(10mg/kg)组。给药治疗42天后，最后实验动物 进行安乐死，取其右腿进行固定脱水包埋切片，进行番红固绿染色观察其软骨损 伤修复情况，对其胫骨损伤进行评分，
实施例4：在细胞水平上，SHP099抑制软骨降解，促进软骨合成。
技术方法：软骨细胞体外培养、qRT-PCR
取出生三天之内的野生C57小鼠的软骨细胞用胰酶消化30分钟后，继续用 0.2％二型胶原酶消化2h以上,分批收细胞，加入含10％血清的DMEM/F12置于 CO2恒温培养箱中培养。在体外培养至F1代后接种在24孔板中。临用前SHP099 用DMSO稀释成10mmol的母液，分装每管50ul,至于-20℃保存，避免反复冻融， 检测其他软骨分解代谢相关基因。SHP099提前预处细胞2h后,体外加10ng/ml IL-1β刺激软骨细胞模拟骨关节炎的炎症反应，12h后用Trizol收细胞提取细胞 中RNA反转成cDNA并进行qRT-PCR检测Mmp13、Mmp3和Adamts5等用于 降解软骨的基因的表达。
实施例5：SHP099促进OA病人软骨细胞外基质(ECM)的合成。
技术方法：软骨外植体培养实验、番红固绿染色
将进行关节置换手术的骨关节炎病人的膝关节软骨样本切割成1cm左右的 小块，置于24孔板中；饥饿24h后加入1ml含10％血清的DMEM/F12培养基， 培养基中包含了不同浓度的SHP099,在培养7天后将软骨外植体进行固定脱钙包 埋；进行番红固绿染色观察其软骨细胞外基质的合成情况。
实施例6：SHP099促进软骨细胞分化
技术方法：软骨细胞分化实验、阿尔新蓝染色、qRT-PCR
小鼠原代软骨细胞在增殖培养基(含10％血清的DMEM/F12)中培养待细胞长 满后接板至24孔板中，培养液换成软骨分化培养基(软骨分化培养基配方：ITS1x、 10ng/ml TGFβ3、地塞米松100nM、维生素C 50μg/ml、脯氨酸40μg/ml、丙酮 酸钠1mM)。并且在分化培养基的条件下加入不同浓度梯度的SHP099药物,培 养1.3.7后后进行阿尔新蓝染色，并收集分化培养两天后细胞提取RNA并反转 成cDNA并进行qRT-PCR，检测细胞中Sox9、Col2a1和Acan的表达情况。
SHP099药理实验结果分析
1)SHP099对DMM诱导的小鼠骨关节炎模型的影响
如图1所示，正常组(Sham组)相比，模型组(DMM组)OARSI评分明 显升高；给药SHP099 10mg/kg后显著降低OARSI评分。
如图1所示，与正常组相比，模型组的胫骨MMP13、MMP3、COLX等软 骨降解和肥大相关蛋白的表达明显增多，软骨合成相关基因SOX9表达下降，免 疫荧光及免疫组化染色结果显示，SHP099能明显抑制软骨降解酶的表达及软骨 细胞的肥大，并促进软骨合成因子SOX9的表达。
2)SHP099对自然衰老条件下的小鼠软骨退变模型的影响
如图2所示，与衰老组相比，给予SHP099治疗能明显促进软骨厚度的增加
3)SHP099对体外IL-1β诱导的小鼠骨关节炎模型的影响
如图3所示，在细胞水平上，SHP099抑制软骨降解，促进软骨合成
4)SHP099对自然衰老条件下的小鼠软骨退变模型的影响
如图3所示，与衰老组相比，给予SHP099治疗能明显促进软骨厚度的增加
5)SHP099对体外IL-1β诱导的小鼠骨关节炎模型的影响
如图4所示，在细胞水平上，SHP099抑制软骨降解，促进软骨合成SHP099 对自然衰老条件下的小鼠软骨退变模型的影响。
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