具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

本发明公开了朝藿定C防治急性酒精中毒的应用，所述的用于防治急性酒精中毒的化合物朝藿定C是一种分布于淫羊藿属植物中的黄酮类化合物单体，分子式为C₃₉H₅₀O₁₉。本发明实施例所用朝藿定C标准品(CAS号：110642-44-9；批号：111780-201905)购自中国食品药品检定研究院。

下面结合实施例对本发明做进一步详细描述：

实施例1：朝藿定C气雾剂的制备

有效成分：朝藿定C；

主要辅料：成膜剂(羟丙甲基纤维素)、液体石蜡、抛射剂(丙丁烷)、壳聚糖；

制备工艺：取朝藿定C(分子式：C₃₉H₅₀O₁₉；CAS号：110642-44-9；批号：111780-201905；由中国食品药品检定研究院提供)与(65±3)％乙醇溶液按照固液比1:3～1:4混匀浸润，密闭放置23～25小时，用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取滤液加入(2.0±0.1)％壳聚糖溶液和适量液体石蜡(预先测试)。将混合液与抛射剂按照1:8～1:10的比例罐装，即得朝藿定C气雾剂。

实施例2：朝藿定C纳米颗粒剂的制备

有效成分：朝藿定C；

主要辅料：乙基纤维素；

制备工艺：将乙基纤维素溶于乙醇，制得(2.0±0.1)％乙基纤维素溶液。加入适量朝藿定C(预先测试加入量)，使用高速分散器分散2～4分钟，在50MPa、70MPa和90MPa压强下各均质1次，制得有机相溶液。将有机相溶液制成乳化液，用旋转蒸发仪在(40±5)℃条件下浓缩并去除乙醇，之后进行真空冷冻干燥，悬浮液分散后抽真空，充注氮气至大气压，预冷至(8±1)℃，1小时后再次抽真空，然后降温使溶液冷结成冰块状固体，3～5小时后通入氮气，保温5～7小时。最后制得朝藿定C纳米颗粒剂。

以下通过试验例进一步阐明本发明所述的朝藿定C对急性酒精中毒的防治作用：

一、朝藿定C与乙醛脱氢酶(ALDH)的分子对接

1实验方法

1.1受体蛋白处理方法：选择乙醛脱氢酶(PDB ID：1O04)作为受体蛋白，蛋白质晶体结构从Protein Data Bank数据库中获得，经加氢、准备、赋予力场后，定义原配体(朝藿定C单体化合物)的位置为活性位点，根据原配体大小，定义活性口袋的半径为9.627148。

1.2配体小分子处理方法：分别以朝藿定C、淫羊藿苷、葛根素、大豆苷4种黄酮类化合物单体为配体分子，利用Discovery Studio软件生成化合物的立体结构，经加氢、赋予力场后，保存为SD格式备用。

1.3分子对接方法：采用Discovery Studio平台的CDocker模块分别将朝藿定C、淫羊藿苷、葛根素、大豆苷4种黄酮类化合物单体和乙醛脱氢酶进行分子对接，根据其对接位点数和对接亲和能的大小进行打分。

2实验结果与分析

由表1可知，朝藿定C、淫羊藿苷、葛根素、大豆苷4种黄酮类化合物单体与乙醛脱氢酶均具有一定的亲和活性，对接效果由强到弱依次为：朝藿定C＞淫羊藿苷＞葛根素＞大豆苷。朝藿定C与乙醛脱氢酶的对接模式如图1所示。朝藿定C能够与酶蛋白的氨基酸残基LYS127、GLN289形成分子间氢键，与氨基酸残基VAL120、ASP123、MET124、LYS127、PHE292、VAL458形成疏水作用，配体与蛋白质所形成的复合物结合稳定，相互作用能量打分较好(表1)。酒精进入人体后，首先在乙醇脱氢酶作用下氧化成乙醛，乙醛在乙醛脱氢酶的作用下进一步氧化为乙酸，这是酒精代谢最主要的途径。乙酸对人体无毒，但是乙醛可以导致染色体损伤和干细胞突变，因此提高乙醛脱氢酶活性对于防治急性酒精中毒显得尤为重要。分子对接实验结果提示朝藿定C在急性酒精中毒防治中具有较好的潜在用途。

表1单体化合物与乙醛脱氢酶蛋白质的分子对接实验结果

二、朝藿定C对急性酒精中毒小鼠肝脏指数的影响

1实验材料

1.1实验动物：昆明种雄性小鼠56只，4-5周龄，体重18-22g，由西安交通大学实验动物中心提供，并通过伦理学审查。

1.2试剂和仪器：化学试剂包括朝藿定C标准品(批号：111780-201905；由中国食品药品检定研究院提供)、水飞蓟素胶囊(批号：B0902641；由德国MADAUS公司提供)、52°白酒(食品级)以及其他常规化学试剂；试剂盒主要包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TC)、总胆固醇(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)试剂盒；仪器主要包括全波长酶标仪、高效液相色谱仪、冷冻干燥机、紫外可见分光光度计、高速冷冻离心机和超低温冰箱。

2实验方法

2.1小鼠模型的制备和分组处理方法：采用实验动物普通饲料适应性饲养小鼠1周后，逐一称重，随机分成5组：正常组(NC组)、模型组(MC组)、水飞蓟素组(PC组)(阳性对照)、低剂量朝藿定C组(EC20组)和高剂量朝藿定C组(EC50组)。其中，低、高剂量朝藿定C组的剂量分别为20、50mg/kg·bw。除正常组、模型组外，其余各组每日灌胃相应的药物连续30天，于末次灌胃12小时后，经口一次性给予小鼠52°白酒(12ml/kg·bw)诱导急性酒精中毒模型。

2.2肝脏指数测算方法：取小鼠肝脏，按照下列公式测算肝脏指数：肝脏指数＝肝脏质量/体重*100％。

2.3统计学处理方法：使用SPSS 13.0软件进行组内、组间实验数据的统计分析，实验结果以平均数(mean)表示，组间比较采用One-Way ANOVA分析方法，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，P＞0.05表示差异不显著。

3实验结果与分析

肝脏指数是肝脏湿质量与体质量之间的比例。通常，肝脏受到损伤时，肝脏指数会随之增大。由表2和图2可以看出，MC组小鼠的肝脏指数极显著高于NC组(P＜0.01)，说明白酒引起了小鼠的肝损伤。朝藿定C灌胃后，急性酒精中毒小鼠的肝脏指数相对于MC组有一定程度的下降，说明朝藿定C对急性酒精中毒小鼠的肝脏有一定的保护作用。

表2朝藿定C对小鼠肝脏指数的影响

注：同列中数字右侧的不同字母上标表示差异显著。

三、朝藿定C对急性酒精中毒小鼠行为的影响

1实验材料与方法

实验材料以及小鼠模型的制备和分组处理方法同前文。观察并记录小鼠的精神状态、行为和死亡情况等，测量并记录小鼠的活动量、饮食量等，测算并记录小鼠的翻正反射表现、醒酒时间、嗜睡时间以及醉酒潜伏期等指标。

2实验结果与分析

灌胃白酒后，各组小鼠均无死亡，模型组小鼠出现翻正反射消失以及行动迟缓、少动嗜睡、活跃度明显降低等醉酒表现。与模型组相比，给药组小鼠的醒酒时间(小鼠恢复翻正反射时间)缩短，醉酒潜伏期延长，嗜睡时间缩短。

四、朝藿定C对急性酒精中毒小鼠肝功能的影响

1实验材料与方法

取小鼠血清，按照试剂盒说明书方法测定血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力。其余实验材料、实验方法同前文。

2实验结果与分析

ALT和AST是评价肝功能的2个重要指标。由图3可以看出，MC组的ALT活力水平极显著高于NC组(P＜0.01)，MC组的AST活力也高于NC组(P＞0.05)，说明酒精对小鼠的肝功能造成了严重不良影响。朝藿定C处理后，急性酒精中毒小鼠的ALT、AST活力相对于MC组都有所下降，并且EC20组小鼠的AST、ALT活力下降程度超过了PC组，说明朝藿定C能够保护急性酒精中毒小鼠的肝功能。

五、朝藿定C对急性酒精中毒小鼠血清胆红素的影响

1实验材料与方法

取小鼠血清，按照试剂盒说明书方法测定血清中总胆红素的含量。其余实验材料、实验方法同前文。

2实验结果与分析

肝脏在胆红素代谢中发挥摄取、结合和排泄功能，其中任何一种功能的障碍都可能引起黄疸。血清总胆红素(TBiL)的含量能够反映黄疸情况进而显示肝脏健康状况。由图4可以看出，MC组总胆红素含量极显著高于NC组(P＜0.01)，说明酒精对肝脏胆红素代谢造成严重负面影响，加大了黄疸风险；EC20、EC50组相对于MC组有效降低了血清总胆红素含量，且呈现出剂量依赖关系，表明朝藿定C可以改善急性酒精中毒小鼠的肝脏胆红素代谢，预防黄疸产生。

六、朝藿定C对急性酒精中毒小鼠血清TC和TG的影响

1实验材料与方法

取小鼠血清，按照试剂盒说明书方法测定血清中TC和TG的含量。其余实验材料、实验方法同前文。

2实验结果与分析

血脂异常是过量饮酒最常见的反应之一。酒精代谢对血脂代谢的主要影响是高甘油三酯血症和高胆固醇血症，血清中甘油三酯、胆固醇含量与肝脏健康紧密相关。由图5可知，MC组TG含量极显著高于NC组(P＜0.01)，TC含量显著高于NC组(P＜0.05)，说明小鼠在酒精作用下出现了明显的血脂异常；与MC组相比，EC20、EC50组的TG含量显著降低(P＜0.05)，TC含量略有下降(P＞0.05)。由此推断，朝藿定C能够调节急性酒精中毒小鼠的肝脏脂质代谢，缓解酒精引起的血脂异常。

七、朝藿定C对急性酒精中毒小鼠肝脏抗氧化能力的影响

1实验材料与方法

取小鼠肝脏，按照试剂盒说明书方法测定肝脏SOD、GSH-Px活力以及GSH、MDA含量。其余实验材料、实验方法同前文。

2实验结果与分析

急性酒精中毒与肝脏氧化应激状态密切相关。氧化应激诱导产生自由基和抗氧化防御体系之间的不平衡状态，可引起组织器官损伤，在急性酒精中毒的发病机制中起着重要的作用。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原型谷胱甘肽等组成机体重要的抗氧化防御体系。MDA也是评价氧化应激水平常用的指标。由图6可知，与NC组相比，MC组小鼠肝脏中的MDA含量显著升高(P＜0.05)，SOD活力显著降低(P＜0.05)，GSH-Px活力极显著降低(P＜0.01)，GSH含量显著下降(P＜0.05)，说明急性酒精中毒小鼠肝脏处于较严重的氧化应激状态；朝藿定C干预后，同MC组相比，SOD活力显著升高(P＜0.05)，GSH-Px活力极显著升高(P＜0.01)，MDA含量有所减少，GSH含量有所增加，其中EC50组的GSH含量显著高于MC组(P＜0.05)；EC50组的GSH含量也显著高于EC20组(P＜0.05)，呈现出明显的剂量依赖关系。以上结果说明朝藿定C可以改善急性酒精中毒小鼠肝脏的氧化应激状态。

八、朝藿定C干预急性酒精中毒小鼠肝脏病理切片分析

1实验材料与方法

取小鼠肝脏，固定后用不同浓度的乙醇溶液进行梯度脱水，然后依次进行二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色(HE染色)，最后在400倍光镜下观察、拍照。其余实验材料、实验方法同前文。

2实验结果与分析

图7是朝藿定C干预急性酒精中毒小鼠肝脏病理切片的代表性照片。可以看出，NC组肝脏组织为小鼠正常肝脏结构，肝细胞排列整齐，肝索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞形态及结构正常。经过急性酒精暴露后的MC组肝细胞排列紊乱，肝索及肝细胞结构受到破坏，大量肝细胞发生脂肪变性，类似乳滴的空泡现象较多，部分肝细胞发生坏死等病理改变。相对于MC组，朝藿定C干预后的小鼠肝脏组织空泡变形较少，肝索、肝窦排列趋于规则，病理损伤明显减轻，EC20组局部仍存在变性的肝细胞，而EC50组的防治效果较好。可以看出，朝藿定C能阻碍急性酒精中毒小鼠肝脏组织的病变进程，对肝脏组织、细胞具有较好的保护作用。

九、朝藿定C对急性酒精中毒小鼠蛋白质组学的影响

1实验材料与方法

1.1蛋白质组学研究所需蛋白质的提取与定量：在干冰上取NC组、EC20组小鼠组织，加入RIPA工作液(50mM Tris，150mM NaCl，1％Trition X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS以及钒酸钠)，加入钢珠后匀浆，超声破碎，离心取上清液。使用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质含量。

1.2蛋白质的丙酮沉淀、重溶、还原与烷基化：取样品蛋白质，稀释后加入预冷的丙酮(-20℃)，混匀后过夜沉淀。离心除上清液，向沉淀中加入蛋白复溶液，溶解沉淀，再加入DTT震荡孵育以还原二硫键，加入IAA进行烷基化反应。

1.3蛋白质的酶解、肽段除杂与脱盐：按一定比例将Trypsin与样品充分混匀，孵育12小时，加入TFA后混匀，高速离心后取上清液。加入TFA，离心提取沉淀的多肽。活化C18柱，加入样品，收集流出液，冲洗后洗脱，除盐，真空干燥。

1.4液相色谱质谱联用检测：取样品总肽，用超高效液相色谱进行分离后，联用配备钠升离子源的质谱仪进行数据采集。色谱分离采用C18反相色谱柱，流动相采用乙腈-水-甲酸体系，梯度洗脱。质谱分析使用数据依赖性采集(DDA)模式，总分析时长为2小时，采取正离子检测模式。一级扫描(Full scan)范围为350-1600m/z，AGC为3E6，最大离子注入时间为50ms，一级扫描中强度最高的离子经四极杆筛选后使用HCD裂解后进行碎片离子扫描。

1.5蛋白质的定性、定量与生物信息学分析：使用无标记定性定量软件MaxQuantNo.1.5.2.8搜索质谱原始文件以获得相应的肽和蛋白质。一级质谱精度：4.5ppm，二级质谱精度：20ppm，酶解时最大允许漏切的数目：2个，数据库：Uniprot-Swissprot；定量计算方法：基于iBAQ强度的绝对定量。使用Uniprot-Swissprot数据库对MC组、EC20组小鼠蛋白质样品进行分析，筛选出急性酒精中毒小鼠与低剂量朝藿定C组小鼠之间的差异表达蛋白，并进行其他生物信息学分析。

2实验结果与分析

2.1质谱鉴定与差异表达蛋白的筛选

本研究质谱系统稳定可靠，所得原始数据使用Proteome Discoverer软件(PD)和内置的Sequest HT搜索引擎进行分析，得到定性、定量结果(图8)。在数据过滤处理后共获得多肽、蛋白质3万多个。在朝藿定C组与模型组比对(EC20 vs MC)中，差异表达蛋白有256个，其中包含91个上调蛋白，165个下调蛋白。这些表达差异的蛋白质可能与朝藿定C抗急性酒精中毒的发生机制密切相关。

2.2差异表达蛋白功能分析

为了进一步明确DEPs在酒精中毒过程中发挥的作用，对DEPs进行了功能聚类，结果发现这些DEPs涉及神经系统发育、氧化应激、钙离子结合、脂质代谢(含脂肪酸β-氧化、花生四烯酸代谢)、维生素代谢(水溶性维生素代谢为主)、糖代谢和嘌呤代谢等。其中，DPYLS2通过与钙通道的相互作用在突触信号传导中发挥重要作用，可能与多种神经系统疾病有关，如神经元蜡样脂褐质沉积症和阿尔茨海默病；SERPINA3编码的蛋白质属于serpin蛋白质家族成员，其变异可能与阿尔茨海默病、帕金森病有关；CAT编码过氧化氢酶，是机体抵御氧化应激的关键酶，其主要作用是将活性氧类过氧化氢转化为水和氧气，使细胞免于遭受相关自由基的伤害；LMNB2参与脂质代谢，可能与癫痫、脂肪代谢障碍等存在密切关系；SHC1也参与脂质代谢，可能与硬化性肝癌等疾病相关；ACACB参与脂肪酸氧化过程，可能与生物素缺乏症或脂肪肝有关；PFKL是糖酵解的限速酶，催化果糖-6-磷酸变成果糖-1,6-双磷酸的不可逆反应；TIGAR可能参与果糖、甘露糖等的代谢过程；HMGA1可能与胰岛素抵抗或2型糖尿病等有关。通过差异表达蛋白功能分析可知，急性酒精中毒可能引起多种蛋白质表达异常，对神经系统、消化系统、新陈代谢(如糖代谢、脂肪代谢)、氧化应激等产生负面影响，导致机体处于氧化应激状态，干扰机体多种代谢过程，并造成不同程度的神经受损。朝藿定C可能对这些急性酒精中毒症状具有一定的调整作用。

2.3差异蛋白互作分析

通常情况下蛋白质是通过与其他蛋白质的相互作用来发挥自身功能的。差异表达蛋白的网络互作分析发现，EC20 vs MC的主要节点蛋白质包括CAT、ADSL、PSMA7、PSMB3、NUDC、MRPL41、RPL37、ATP5ME、MRPS7、RPL18A、MIA3、ACLY、SRSF5和RPL36A等。其中，NUDC可能在神经发生和神经元迁移过程中发挥重要作用，推测酒精中毒可能会引起大脑神经损伤；酒精性神经病变与MIA3密切相关，推测长期或大量饮酒会对中枢神经系统造成损害，产生精神症状，并常伴有各种内脏器官的严重病变；PSMB3可能与某些神经系统疾病有关，典型的有癫痫等；ADSL可能与癫痫、反应迟缓等神经系统障碍密切相关；癫痫的发生还可能与ATP5ME相关，并可能涉及嘌呤核苷酸的生物合成、ATP合成等；与ACLY相关的生理生化过程可能包括脂质代谢和乙酰胆碱的生物合成；CAT与机体抵御氧化应激过程密切相关，推断酒精对机体过氧化氢酶表达影响较大，急性酒精中毒的发生可能与CAT表达变化存在紧密联系；PSMA7可能与缺氧或肝炎等有关；MRPL41是线粒体核糖体大亚基的组成部分，参与细胞凋亡与细胞循环调控；RPL37与mRNA翻译、RNA合成密切相关；SRSF5相关蛋白质为富含丝氨酸/精氨酸的前mRNA剪接因子家族成员，对mRNA的剪接至关重要；RPL36A属于核糖体蛋白家族，可能与mRNA的转录与复制有关。据此推测，急性酒精中毒可能与细胞凋亡、转录翻译、氧化应激、神经受损以及代谢失调(如糖代谢紊乱)等有关。朝藿定C可能通过调节这些DEPs的表达从而发挥防治急性酒精中毒的作用。

综上可知，朝藿定C对乙醛脱氢酶蛋白质具有分子对接亲和活性，能够缩短急性酒精中毒实验动物醒酒时间与嗜睡时间，延长醉酒潜伏期，降低肝脏指数，降低血清总胆红素、总胆固醇和甘油三酯水平，减小血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活力水平，提升超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力，增加还原型谷胱甘肽含量，降低丙二醛含量，维护肝脏组织、细胞正常形态和结构，调节急性酒精中毒小鼠蛋白质组表达，修复神经系统受损，改善机体氧化应激状态，缓解糖代谢、脂质代谢紊乱，具有防治急性酒精中毒的作用。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。