Lkp三肽的液相合成方法
阅读说明：本技术 Lkp三肽的液相合成方法 (Liquid phase synthesis method of LKP tripeptide ) 是由 冯议 阮海燕 李健雄 汪黎明 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种LKP三肽的液相合成方法,属于有机合成技术领域。该方法为：通过L-赖氨酸和硫酸铜络合,接着采用Boc酸酐保护ε位的氨基,然后解络合得到H-Lys(Boc)-OH,再通过Fmoc-OSu对H-Lys(Boc)-OH的α位氨基保护得到Fmoc-Lys(Boc)-OH；再与L-脯氨酸甲酯盐酸盐缩合得到Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ome,然后去Fmoc保护得到H-Lys(Boc)-Pro-Ome,再与Boc-Leu-OH缩合得到Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ome,然后水解得到Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH,最后脱Boc保护基得到LKP。(The invention discloses a liquid-phase synthesis method of LKP tripeptide, belonging to the technical field of organic synthesis. The method comprises the following steps: complexing L-lysine and copper sulfate, protecting the amino group at the epsilon position by Boc anhydride, then decomplexing to obtain H-Lys (Boc) -OH, and protecting the amino group at the alpha position of the H-Lys (Boc) -OH by Fmoc-OSu to obtain Fmoc-Lys (Boc) -OH; then condensing with L-proline methyl ester hydrochloride to obtain Fmoc-Lys (Boc) -Pro-Ome, removing Fmoc protection to obtain H-Lys (Boc) -Pro-Ome, condensing with Boc-Leu-OH to obtain Boc-Leu-Lys (Boc) -Pro-Ome, hydrolyzing to obtain Boc-Leu-Lys (Boc) -Pro-OH, and finally removing Boc protection group to obtain LKP.)
技术领域
本发明涉及有机合成
技术领域
，具体涉及一种LKP三肽的液相合成方法。背景技术
高血压是当今流行最为广泛的心血管疾病，同时，高血压又是冠心病、心脏以及肾功能衰竭的最主要的发病因素，被国际上称为“无声杀手”。ACE是肾素-血管紧张素系统中的一个重要调节因子，在血压的调节方面起着重要作用，ACE活力的升高破坏了正常体液中升压和降压体系的平衡。ACE抑制剂通过抑制ACE活性来实现降压的目的。目前合成ACE抑制剂虽能有效的降低高血压，但是临床上有许多不良反应，如降压过度，泌尿系统发生病变、持续性咳嗽、味觉消失和血管神经性水肿等。ACE抑制肽则是一类具有ACE抑制活性的多肽物质，大多含有2-14个氨基酸。这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各不相同，但具有类似的功能。
随着我国经济的不断发展，人民生活水平不断提高，人们的自我保护意识和安全意识也在加强。具有ACE抑制活性的多肽物质，虽没有合成降压药降压作用强，但因无副作用，可长期服用达到预防、控制、缓解和辅助治疗高血压的目的，所以备受人们关注。
自从Ferria首次从南美蝮蛇毒液中发现ACE抑制肽后，ACE抑制肽得到了较快的发展。目前，已从乳蛋白、米糠蛋白、植物蛋白和海洋生物等食物资源中分离出了多种ACE抑制肽。其中来自乳源的IPP和VPP已经广泛用于功能食品。
LKP是具有血管紧张素转化酶抑制活性的三肽之一，该三肽具有血管紧张素转化酶抑制活性，目前还没有LKP相关的合成方法的报道，本发明提供了一种工艺简单，成本较低的液相合成方法。
发明内容
本发明提供了一种工艺简单，收率高，成本较低的LKP三肽的合成方法。所述方案如下：
本发明实施例提供了本发明提供了一种LKP三肽的液相合成方法，其合成的反应式如下：
该方法包括以下步骤：
(1) [Lys(Boc)]2Cu的合成
于水中，碱A、L-赖氨酸单盐酸盐和硫酸铜在室温下反应得到Lys2Cu，再加入碱B，将Boc2O溶于非质子溶剂A中并缓慢滴加（滴加时间为2.0-2.5h），室温下反应（反应时间为16-24h），反应完成后得到[Lys(Boc)]2Cu。L-赖氨酸、五水硫酸铜、碱A、碱B和Boc2O的摩尔比为1.0：0.5-0.6：2.0-2.5：1.0-1.5：1.0-1.5。赖氨酸是含有侧链氨基的氨基酸，属于碱性氨基酸，在多肽合成过程中，必须保护ε位的氨基，硫酸铜可以与赖氨酸形成络合物，保护了羧基和α位氨基，以便于露出ε位的氨基进行保护。
(2) Fmoc-Lys(Boc)-OH的合成
于水与非质子溶剂B的混合溶剂中，[Lys(Boc)]2Cu与8-羟基喹啉在室温下反应（反应时间为2-4h）得到H-Lys(Boc)-OH，加入碱C和Fmoc-Osu，室温下反应（反应时间为2-4h），反应完成后，过滤除去绿色不溶物，得到棕色滤液，滤液加酸调节pH至2-3，过滤得到Fmoc-Lys(Boc)-OH。[Lys(Boc)]2Cu、8-羟基喹啉、碱C和Fmoc-OSu的摩尔比为1.0：2.0-3.0：2.0-4.0：2.0-3.0；赖氨酸有两个氨基要进行保护，选择不同的保护基进行选择性保护，以便于后续的选择性脱除，采用自制的Fmoc-Lys(Boc)-OH（较贵）能降低较大成本。
(3)Fmoc-Lys(Boc)-Pro-OMe的合成
Fmoc-Lys(Boc)-OH和L-脯氨酸甲酯盐酸盐缩合得到Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ome。
(4)H-Lys(Boc)-Pro-OMe的合成
Fmoc-Lys(Boc)-Pro-OMe脱去Fmoc保护基得到H-Lys(Boc)-Pro-Ome。
(5)Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OMe的合成
H-Lys(Boc)-Pro-OMe和Boc-Leu-OH缩合得到Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ome。
(6)Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH的合成
Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OMe水解得到Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH。
(7)LKP的合成
Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH脱去Boc保护基得到LKP。
其中，在步骤(1)和步骤(2)中，碱A、碱B和碱C（碱A、碱B和碱C相同或不同）选自碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙胺等有机碱或无机碱，优选采用碳酸氢钠。
其中，在步骤(1)和步骤(2)中，非质子溶剂A和非质子溶剂B（非质子溶剂A和非质子溶剂B相同或不同）选自丙酮、四氢呋喃、乙腈、DMF或DMSO等，优选为丙酮。
进一步地，步骤(1)还包括：反应完成后采用溶剂法进行纯化，纯化溶剂为醇类溶剂（如甲醇或乙醇等）。步骤(2)还包括：反应完成后，过滤，滤液用盐酸（具体可以采用浓度为1N的盐酸）调节pH至2-3，过滤，滤饼重结晶得到Fmoc-Lys(Boc)-OH。
其中，步骤(3)具体包括：于非质子溶剂C中，在催化剂A、三乙胺和缩合剂A的作用下，Fmoc-Lys(Boc)-OH和L-脯氨酸甲酯盐酸盐在室温下进行缩合反应得到Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ome。Fmoc-Lys(Boc)-OH、L-脯氨酸甲酯盐酸盐、三乙胺和缩合剂A的摩尔比为1.0：1.0-1.1：1.0-1.5：1.0-1.5，催化剂A与Fmoc-Lys(Boc)-OH的质量比为0.005-0.01：1.0。其中，非质子溶剂C选自二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或四氢呋喃等，优选为二氯甲烷；催化剂A选自DMAP等；缩合剂A选自DCC、DIC、EDCI、DCC与HOBT的混合物或者DIC与HOBT的混合物等，优选为DCC与HOBT的混合物。
其中，步骤(4)具体包括：于有机溶剂A中，在脱Fmoc试剂作用下和室温下，Fmoc-Lys(Boc)-Pro-OMe脱去Fmoc保护基得到H-Lys(Boc)-Pro-Ome。其中，有机溶剂A选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或DMF等，优选为四氢呋喃；脱Fmoc试剂选自哌啶、乙醇氨、环己胺吗啡啉、吡咯烷酮或DBU等，优选为哌啶。脱Fmoc试剂与有机溶剂A配制成体积浓度为15-20%的溶液。
其中，步骤(5)具体包括：于非质子溶剂D中，在催化剂B和缩合剂B的作用下， H-Lys(Boc)-Pro-OMe和Boc-Leu-OH在室温下进行缩合反应得到Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ome。H-Lys(Boc)-Pro-OMe、Boc-Leu-OH和缩合剂B的摩尔比为1.0：1.0-1.1：1.0-1.5，催化剂B和H-Lys(Boc)-Pro-OMe的质量比为0.005-0.01：1.0。其中，非质子溶剂D选自二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或四氢呋喃等，优选为二氯甲烷；催化剂B选自DMAP等；缩合剂B选自DCC、DIC、EDCI、DCC与HOBT的混合物或DIC与HOBT的混合物等，优选为DCC。
其中，步骤(6)具体包括：于水中，在碱D的作用下和室温下，Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OMe水解得到Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH。Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OMe和碱D的摩尔比为1.0：1.0-2.0。其中，碱D选自氢氧化钠或氢氧化锂等，优选为氢氧化钠。
其中，步骤(7)具体包括：于有机溶剂B中，在脱Boc试剂作用下和室温下，Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH脱去Boc保护基得到LKP。Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH和脱Boc试剂的摩尔比为1.0：1.0-10.0。其中，有机溶剂B选自二氯甲烷等，脱Boc试剂选自三氟乙酸等。
进一步地，本发明实施例提供的LKP三肽的液相合成方法包括以下步骤：
(1) [Lys(Boc)]2Cu的合成
于水中，碱A、L-赖氨酸单盐酸盐和硫酸铜在室温下反应得到Lys2Cu，再加入碱B，将Boc2O溶于非质子溶剂A中并缓慢滴加，室温下反应，反应完成后，采用溶剂法进行纯化得到[Lys(Boc)]2Cu。L-赖氨酸、五水硫酸铜、碱A、碱B和Boc2O的摩尔比为1.0：0.5-0.6：2.0-2.5：1.0-1.5：1.0-1.5。其中，碱A和碱B选自碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙胺等，非质子溶剂A选自丙酮、四氢呋喃、乙腈、DMF或DMSO等，纯化溶剂为醇类溶剂。
(2) Fmoc-Lys(Boc)-OH的合成
于水与非质子溶剂B的混合溶剂中，[Lys(Boc)]2Cu与8-羟基喹啉在室温下反应得到H-Lys(Boc)-OH，加入碱C和Fmoc-Osu，室温下反应，反应完成后，过滤，滤液用盐酸调节pH至2-3，过滤，滤饼重结晶得到Fmoc-Lys(Boc)-OH。[Lys(Boc)]2Cu、8-羟基喹啉、碱C和Fmoc-OSu的摩尔比为1.0：2.0-3.0：2.0-4.0：2.0-3.0。其中，碱C选自碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙胺等，非质子溶剂B选自丙酮、四氢呋喃、乙腈、DMF或DMSO等。
(3)Fmoc-Lys(Boc)-Pro-OMe的合成
于非质子溶剂C中，在催化剂A、三乙胺和缩合剂A的作用下，Fmoc-Lys(Boc)-OH和L-脯氨酸甲酯盐酸盐在室温下进行缩合反应得到Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ome。Fmoc-Lys(Boc)-OH、L-脯氨酸甲酯盐酸盐、三乙胺和缩合剂A的摩尔比为1.0：1.0-1.1：1.0-1.5：1.0-1.5，催化剂A与Fmoc-Lys(Boc)-OH的质量比为0.005-0.01：1.0。其中，非质子溶剂C选自二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或四氢呋喃等，催化剂A选自DMAP等，缩合剂A选自DCC、DIC、EDCI、DCC与HOBT的混合物或者DIC与HOBT的混合物等。
(4)H-Lys(Boc)-Pro-OMe的合成
于有机溶剂A中，在脱Fmoc试剂作用下和室温下，Fmoc-Lys(Boc)-Pro-OMe脱去Fmoc保护基得到H-Lys(Boc)-Pro-Ome。其中，有机溶剂A选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈或DMF等，脱Fmoc试剂选自哌啶、乙醇氨、环己胺吗啡啉、吡咯烷酮或DBU等。
(5)Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OMe的合成
于非质子溶剂D中，在催化剂B和缩合剂B的作用下， H-Lys(Boc)-Pro-OMe和Boc-Leu-OH在室温下进行缩合反应得到Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-Ome。H-Lys(Boc)-Pro-OMe、Boc-Leu-OH和缩合剂B的摩尔比为1.0：1.0-1.1：1.0-1.5，催化剂B和H-Lys(Boc)-Pro-OMe的质量比为0.005-0.01：1.0。其中，非质子溶剂D选自二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或四氢呋喃等，催化剂B选自DMAP等，缩合剂B选自DCC、DIC、EDCI、DCC与HOBT的混合物或DIC与HOBT的混合物等。
(6)Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH的合成
于水中，在碱D的作用下和室温下，Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OMe水解得到Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH。Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OMe和碱D的摩尔比为1.0：1.0-2.0。其中，碱D选自氢氧化钠或氢氧化锂等。
(7)LKP的合成
于有机溶剂B中，在脱Boc试剂作用下和室温下，Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH脱去Boc保护基得到LKP。Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH和脱Boc试剂的摩尔比为1.0：1.0-10.0。其中，有机溶剂B选自二氯甲烷等，脱Boc试剂选自三氟乙酸等。
本发明以廉价易得的L-赖氨酸，Boc-Leu-OH和L-脯氨酸甲酯盐酸盐为原料，为LKP三肽提供了一种工艺简单，成本较低的液相合成方法。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1：[Lys(Boc)]2Cu的合成
四口烧瓶中加入100.0g L-赖氨酸单盐酸盐，92.0g碳酸氢钠和1000.0g水，搅拌溶清，然后缓慢分批加入75.20g五水硫酸铜；然后再加入46.0g碳酸氢钠，室温下155.3gBoc2O溶于650.0g丙酮，然后滴加入反应瓶中，滴毕搅拌过夜，然后加入126.7g甲醇搅拌两小时，过滤得[Lys(Boc)]2Cu蓝色固体，烘干得到138.3g，收率91.2%。
实施例2：Fmoc-Lys(Boc)-OH的合成
四口烧瓶中加入实施例1中的138.3g [Lys(Boc)]2Cu固体，79.5g 8-羟基喹啉，1000.0g水和500.0g丙酮，室温下搅拌反应2h，蓝色反应逐渐变为绿色，过滤除去不溶物，滤饼用少量水漂洗得滤液，然后加入62.9g碳酸氢钠，202.1gFmoc-OSu溶于500g丙酮中，滴加入反应液中，滴毕继续反应2-4h，盐酸调节pH至2-3，析出固体，过滤得粗品，乙酸乙酯和石油醚精制得到212.0.g Fmoc-Lys(Boc)-OH，收率90.6%。
实施例3：Fmoc-Lys(Boc)-Pro-OMe的合成
四口烧瓶中加入1000.0g二氯甲烷，74.9g L-脯氨酸甲酯盐酸盐，68.7g三乙胺和91.7g HOBT，然后再加入实施例2中的212.0g Fmoc-Lys(Boc)-OH，将112.0g DCC溶于200.0g二氯甲烷中，然后室温缓慢滴加上述DCC的二氯甲烷溶液，滴毕搅拌2-3，反应毕过滤除去析出的副产物DCU，滤饼用少量二氯甲烷漂洗依次，然后滤液用水洗涤一次，减压浓缩得到Fmoc-Lys(Boc)-Pro-OMe，收率按100%计。
实施例4：H-Lys(Boc)-Pro-OMe的合成
四口烧瓶中加入20%哌啶的四氢呋喃溶液1000.0g，和实施例3中的Fmoc-Lys(Boc)-Pro-OMe，室温反应1-2h，反应毕减压浓缩至干，加入乙腈和水纯化，得到H-Lys(Boc)-Pro-OMe，收率按100%计。
实施例5：Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OMe的合成
四口烧瓶中加入1000.0g二氯甲烷，实施例4中的H-Lys(Boc)-Pro-OMe、45.8g三乙胺和0.8g DMAP，然后再加入112.8gBoc-Leu-OH，将112.0g DCC溶于200g二氯甲烷中，然后室温缓慢滴加上述DCC的二氯甲烷溶液，滴毕搅拌2-3，反应毕过滤除去析出的副产物DCU，滤饼用少量二氯甲烷漂洗依次，然后滤液用水洗涤一次，减压浓缩得到Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OMe，收率按100%计。
实施例6：Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH的合成
四口烧瓶中加入实施例5中的Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OMe，1000.0g水和10%的氢氧化钠溶液217.2g，室温反应2-3h，反应毕过滤除去杂质，滤液调节pH至2-3，乙酸乙酯萃取得有机层，减压浓缩至干得到213.1g Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH，收率约为84.6%。
实施例7：LKP的合成
四口烧瓶中加入213.1g Boc-Leu-Lys(Boc)-Pro-OH，1000.0g二氯甲烷和218.2g三氟乙酸，室温反应5-6h，反应毕浓缩除去三氟乙酸和二氯甲烷，加入无水乙醚析料，过滤，烘干得到155.9g白色固体LKP，收率约为86.6%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：棕榈酰三肽-1的制备方法