索拉胶在制备治疗急性药物性肝损伤药物中的应用
阅读说明：本技术 索拉胶在制备治疗急性药物性肝损伤药物中的应用 (Application of sorafenib gum in preparation of medicine for treating acute drug-induced liver injury ) 是由 张建法 顾旻昱 高岩 于 2019-11-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了索拉胶在制备治疗急性药物性肝损伤药物中的应用。索拉胶作为急性药物性肝损伤治疗药物使用时,降低对伤肝药物诱导的急性肝损伤中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平,减少肝组织坏死面积,提高GSH水平,从而保护由伤肝药物服用过量所致的急性肝损伤。本发明首次发现索拉胶作为急性药物性肝损伤治疗药物使用时,能够显著提升急性药物性肝损伤后肝脏GSH的含量,降低炎症因子水平,从而达到抗氧化与调节免疫的作用,有效减轻药物引起的急性肝损伤,减少肝脏负荷,改善肝功能,降低肝移植率,降低个体死亡率。(The invention discloses application of sorafen gum in preparing a medicine for treating acute drug-induced liver injury. When the Sorana gum is used as a medicine for treating acute drug-induced liver injury, the levels of glutamic-pyruvic transaminase and glutamic-oxalacetic transaminase in the acute liver injury induced by the liver injury medicine are reduced, the area of necrosis of liver tissues is reduced, and the GSH level is improved, so that the acute liver injury caused by excessive administration of the liver injury medicine is protected. The invention discovers for the first time that when the Soragel is used as the medicine for treating the acute drug-induced liver injury, the content of the GSH of the liver after the acute drug-induced liver injury can be obviously improved, and the level of inflammatory factors can be reduced, so that the effects of resisting oxidation and regulating immunity can be achieved, the acute liver injury caused by the medicine can be effectively reduced, the liver load can be reduced, the liver function can be improved, the liver transplantation rate can be reduced, and the individual mortality can be reduced.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及索拉胶在制备治疗急性药物性肝损伤药物中的应用。
背景技术
肝脏是人体中以代谢功能为主的重要器官，有抗氧化、存储肝糖和合成分泌性蛋白质等作用。多种原因会导致肝脏功能的异常，严重或持续的肝损伤最终会导致肝功能衰竭。对乙酰氨基酚(APAP)，也称为对乙酰氨基酚或N-乙酰基对氨基苯酚，它是一种治疗发烧、疼痛和炎症的药物，正常情况下，APAP在正常治疗剂量下使用时，它是安全有效的。APAP应用非常广泛且消费量巨大，在我国，百服宁、白加黑、泰诺、999感冒灵、维c银翘片等日常用药均含有大量的APAP。APAP过量是大多数工业化国家急性肝衰竭(ALF)的主要原因，由于APAP用药的普遍性和广泛性，APAP所致肝毒性一直受到广泛关注和重视。
建立合适的实验性肝损伤动物模型对肝病的防治、发病机制的研究和护肝药物的筛选都有着十分重要的意义。其中各类肝损伤模型机理是不同的，具体介绍如下：
药物性肝损伤：APAP在肝内的主要代谢产物是葡萄糖醛酸和硫酸盐偶联物，少量被CYP2E1转化为一种具有高度活性的毒性代谢产物N-乙酰-对苯醌亚胺(NAPQI)。正常情况下，NAPQI由于肝中谷胱甘肽(GSH)的减少而被迅速激活，然后在胆汁和尿液中排泄为半胱氨酸和巯基酸。APAP摄取过多时，葡萄糖醛酸内酯和硫酸盐途径饱和，过量的APAP通过CYP系统代谢产生大量的NAPQI，消耗肝中的GSH，未与GSH共价结合的NAPQI还可以与细胞蛋白硫醇共价结合，促进肝细胞氧化，降低肝抗氧化能力，导致急性肝坏死。APAP诱导的小鼠肝损伤模型组织形态学表现以小叶中心区域坏死为特征，这是APAP毒性的标志。该模型方便、廉价，代谢机理接近临床，因此逐渐成为近年来研究过量服用解热镇痛药导致急性肝损伤的治疗药物筛选的动物模型。
化学性肝损伤：CCl4是一种常见的化学诱导剂，被广泛用于建立肝损伤动物模型。CCl4通过细胞色素P4502E1(CYP2E1)在肝中代谢，产生高反应活性的三氯甲基自由基，干扰肝中的氧化还原稳态，引起氧化应激。自由基还可通过与细胞中的不饱和脂肪酸氧化反应促进脂质过氧化，诱导肝细胞中DNA损伤，引起肝细胞凋亡和坏死，最终造成肝细胞损伤。CCl4诱导的小鼠肝损伤模型在病理生理等方面与人类肝脏疾病相似，且易于复制，是理想的小鼠肝损伤模型。然而CCl4毒性较强，不仅损害肝，还危害其它脏器，并且CCl4肝损伤属于中毒性肝损伤，与机体免疫调节反应关联性不强，因此该模型不适用于免疫调节类护肝药物的筛选以及免疫机制方面的研究。
酒精性肝损伤：这是级联事件的结果，临床上首先导致酒精性脂肪肝，然后主要通过酒精性脂肪性肝炎或可能导致肝硬化的酒精性肝炎和肝细胞癌。酒精80％～90％在肝脏代谢。由于酒精被氧化时，产生大量的还原型辅酶Ⅰ，而成为合成脂肪酸的原料，从而促进脂肪的合成。乙醛和大量还原型辅酶Ⅰ可以抑制线粒体的功能使脂肪酸氧化发生障碍，导致脂肪肝的形成。经过肝细胞浆内的乙醇脱氢酶的催化，氧化为乙醛，再经乙醛脱氢酶催化转成乙酸，最终形成二氧化碳。在乙醇氧化过程中脱下大量的氢离子与辅酶Ⅰ结合。辅酶Ⅰ被还原成为还原型辅酶Ⅰ，则使其与辅酶Ⅰ的比值上升，从而使细胞的氧化、还原反应发生变化，造成依赖于还原型辅酶Ⅰ/辅酶Ⅰ的物质代谢发生改变，而成为代谢紊乱和致病的基础。同时乙醛对肝细胞有直接毒性作用。酒精引起高乳酸血症，通过刺激脯氨酸羟化酶的活性和抑制脯氨酸的氧化，而使脯氨酸增加，从而使肝内胶原形成增加，加速肝硬化过程。并认为高乳酸血症和高脯氨酸血症，是可作为酒精性肝病肝纤维化生成的标志。
目前各种保肝降酶药物种类繁多，如抗病毒治疗药物、免疫调节药物，而且很多药物需长期服用且剂量较高，尚没有能完全阻断肝损伤发生的药物，因此无法有效防止因大面积肝细胞坏死所造成的急性肝衰竭，导致急性肝衰竭死亡率一直难以降低。制药工业界迫切需要寻找一种药物用来减轻伤肝药物引起的急性肝损伤。
发明内容
针对现在药物性肝损伤的高发病率，本发明提供索拉胶在制备治疗急性药物性肝损伤药物中的应用。
本发明所述的急性药物性肝损伤是指由各类伤肝药物诱导的急性肝损伤，例如由对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤。
本发明所述的索拉胶为保藏编号为CCTCC NO：M2010020的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)ZX09分泌产生的胞外β-葡聚糖，参见中国专利201010146371.2。
本发明所述的治疗急性药物性肝损伤药物中，索拉胶的使用剂量为20mg/kg.b.w以上，优选为40mg/kg.b.w。
本发明所述的应用对象，即患有急性药物性肝损伤的群体，为包括人在内的哺乳动物。
本发明首次发现水溶性的β-葡聚糖，索拉胶作为急性药物性肝损伤治疗药物使用时，能够显著提升急性药物性肝损伤后肝脏GSH的含量，降低炎症因子水平，从而达到抗氧化与调节免疫的作用，有效减轻药物引起的急性肝损伤，减少肝脏负荷，改善肝功能，降低肝移植率，降低个体死亡率。
附图说明
图1为低剂量与高剂量索拉胶减轻对乙酰氨基酚(APAP，300mg/kg)诱导的肝损伤结果示意图，A图为APAP诱导肝损伤24小时后，低剂量与高剂量索拉胶组的小鼠血清ALT水平结果图，B图为APAP诱导肝损伤24小时后，低剂量与高剂量索拉胶组的小鼠血清AST水平结果图。
图2为索拉胶对肝细胞坏死的影响结果图。
图3为低剂量与高剂量索拉胶对APAP(300mg/kg)所诱导的小鼠急性肝衰竭模型的肝脏相关基因表达量的影响结果图，A图为APAP诱导肝损伤24小时后，小鼠肝脏Tnf-αmRNA表达量，B图为APAP诱导肝损伤24小时后，小鼠肝脏IL-6mRNA表达量。
图4为低剂量与高剂量索拉胶对APAP(300mg/kg)所诱导的小鼠急性肝衰竭模型的肝脏中GSH和MDA含量的变化图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所述的索拉胶作为治疗急性药物性肝损伤药物使用，适用对象为包括人在内的哺乳动物，适用情况为大量服用对乙酰氨基酚等肝毒性药物引发的急性药物性肝损伤的情况。“肝损伤”是在病理学上可辨别的肝实质细胞的坏死或凋亡，肝损伤产生的并发症有感染性并发症、肝创面胆漏、继发性出血、急性肝肺功能障碍；“肝衰竭”指多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。
本发明所述的索拉胶(Salecan)是由保藏编号为CCTCC NO：M2010020的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)ZX09分泌产生的胞外β-葡聚糖，参见中国专利201010146371.2，其分子结构由以下重复单元组成：
→3)-β-D-Glcp-(1→3)-[β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→3)]3-α-D-Glcp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→。
作为治疗急性药物性肝损伤药物使用时，索拉胶的低剂量为20mg/kg.b.w，高剂量为40mg/kg.b.w。
本发明中，索拉胶保护急性药物性肝损伤的反应机理为：APAP过量服用时，大量的APAP由CYP450酶氧化形成N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)，NAPQI导致谷胱甘肽(GSH)耗竭，动物实验测得索拉胶能显著提升动物急性肝损伤后肝脏GSH含量，降低炎症因子水平，从而达到抗氧化与调节免疫的作用。
实施例1
1.动物模型
实验动物：八周龄的雄性C57BL/6(WT)小鼠。在标准实验条件下饲养：12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。
APAP用以建立小鼠急性肝衰竭模型，通过灌胃给药APAP(300mg/kg.b.w)。WT小鼠随机分成四组，第一组为对照组(Saline)，在实验过程中给予对应药物介质(生理盐水)处理；第二组为APAP组(APAP)，灌胃给药APAP；第三组为低剂量组(APAP+LS)，将索拉胶(20mg/kg.b.w)与相应剂量APAP混为混合溶液灌胃给药。第四组为高剂量组(APAP+LS)，将索拉胶(40mg/kg.b.w)与相应剂量APAP混为混合溶液灌胃给药。APAP灌胃24小时后，取血、肝脏用于评价肝损伤情况。
2.血清酶活性测定
收集全血后，待其常温自然凝血，3000r/min离心15min后，取血清测定谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)酶活性。AST和ALT的酶活性用酶显色定量分析方法测定，按照试剂盒说明书中的操作步骤进行，最后在340nm波长下进行比色测定其浓度。
图1为低剂量与高剂量索拉胶减轻对乙酰氨基酚(APAP，300mg/kg)诱导的肝损伤结果示意图。A图数据表明APAP诱导肝损伤24小时后，小鼠血清ALT水平明显上升：而低剂量索拉胶组(APAP+LS)小鼠血清ALT水平与APAP模型组组相比有所下降，但无显著性区别。高剂量索拉胶组(APAP+HS)小鼠血清ALT水平与APAP模型组相比有显著性下降。B图数据表明APAP诱导肝损伤24小时后，小鼠血清AST水平明显上升：而低剂量索拉胶组(APAP+LS)小鼠血清AST水平与APAP模型组组相比有所下降，但无显著性区别。高剂量索拉胶组(APAP+HS)小鼠血清AST水平与APAP模型组相比有显著性下降。综上，C57BL/6WT小鼠通过灌胃对乙酰氨基酚(APAP，300mg/kg)建立急性肝衰竭模型。APAP建模24小时后，相比于对照组，APAP组小鼠血清AST，ALT酶活性显著升高；相比于APAP组，低剂量索拉胶组小鼠血清AST，ALT酶活性下降约三分之一，高剂量索拉胶组较低剂量索拉胶组稍有下降。
3.肝脏组织学分析
肝组织用10％福尔马林固定，然后石蜡包埋切片，再用苏木精-伊红HE染色。通过显微镜观察肝细胞的坏死情况。
图2索拉胶对肝细胞坏死的影响结果图。C57BL/6WT小鼠通过灌胃对乙酰氨基酚(APAP，300mg/kg)建立急性肝衰竭模型。APAP建模24小时后，检测肝组织病变。肝组织病理切片H&E染色(100×)显示，APAP建模24小时后，相比于对照组，APAP组小鼠肝细胞呈现严重坏死；相比于APAP组，低剂量索拉胶组(APAP+LS)小鼠肝细胞坏死程度明显减轻，高剂量索拉胶组(APAP+HS)小鼠肝细胞坏死程度较低剂量组稍有减轻。
4.GSH的测定
(1)肝脏样本的前处理
肝脏10％匀浆样的制备：准备称取组织重量，按重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下用电动匀浆机匀浆，2500r/min，离心10min，取10μl至1.5ml Eppendorf管-80℃保存，用于BCA测蛋白，其余上清液进行后续GSH测定。
(2)肝脏中的GSH测定步骤
参考南京建成生物工程研究所的GSH试剂盒的protocol，具体步骤如下：
(2.1)上清液的制备：取待测样品0.1ml，加入试剂一应用液0.4ml混匀(相当于稀释5倍)，3500-4000r/min离心10min，取上清液0.2ml进行显色反应。
(2.2)显色反应：
混匀，静置5min，用酶标仪在450nm测定O.D.值。
(2.3)计算：
按标准品计算：
(3)BCA试剂盒测蛋白含量
参考凯基BCA试剂盒测定蛋白含量的protocol。
(3.1)从-80℃取出蛋白样，常温融化，加入90μl ddwater，再加入4μl 10％SDS，沸水浴30s-1min。
(3.2)对于肝组织蛋白样，加入400μl超纯水稀释50倍。取10μl用于后续测定。
(3.3)蛋白标准样按比例稀释，参考2.1.2.7(4)
(3.4)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
(3.5)加入100μl BCA工作液37℃水浴30min。
(3.6)用酶标仪在562nm测定O.D.值。
5.MDA的测定
(1)肝脏的样本前处理
肝脏10％匀浆样的制备：准备称取组织重量，按重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例，加入9被体积的生理盐水，冰水浴条件下用电动匀浆机匀浆，2500r/min，离心10min，取10μl至1.5ml Eppendorf管-80℃保存，用于BCA测蛋白，其余上清液进行后续MDA测定。
(2)肝脏的MDA测定步骤
参考南京建成生物工程研究所的MDA试剂盒的protocol，具体步骤如下：
(2.1)工作液的配制：试剂一：试剂二：试剂三＝0.1ml：0.9ml：0.3ml，用多少配多少，配好后当天测定。
(2.2)操作加试剂的比例：
空白管
标准管
测定管
无水乙醇(ml)
0.1
10nmol/L MDA标准品
0.1
测试样品(ml)
0.1
工作液(ml)
1.2
1.2
1.2
(2.3)涡旋混匀器混匀，Eppendorf管的盖子盖紧，将尖锐的长针用酒精灯烧红，将管盖上扎2-3个小孔以防煮的时候爆开，用锅开盖煮沸40min。
(2.4)取出后流水冷切，然后3500-4000r/min离心10min。
(2.5)取上清100μl用酶标仪在532nm测定OD值。
(2.6)计算：
按标准品计算：
6.肝脏中相关基因表达量的测定
小鼠肝脏RNA抽提:取小鼠肝脏组织(约重50mg)，加入TRIzol试剂600μL，高速匀浆。向匀浆液中加入120μL氯仿，剧烈摇晃15s。静置10min后，离心11000g，15min，4℃。吸取约300μL上清液加入到无菌的1.5mL EP管中(注意不要吸到蛋白层)，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀。静置10min后，离心11000g，10min，4℃。
弃去上清液。分别加入1mL用DEPC水配制的75％乙醇洗涤，弹起沉淀，离心7000g，5min，4℃。轻轻倒去上清液，加入100μL DEPC水充分溶解沉淀，然后加入4μL 5M NaCl，250μL无水乙醇(根据沉淀多少，加入的比例为100:4:250即可)，置于-80℃保存。
逆转录:利用M-MLV逆转录酶以mRNA为模板、在随机引物(Oligo dT18)的引发下合成与模板互补的单链DNA(cDNA)。具体步骤如下：将保存的RNA从-80℃取出，混匀，取10μL加入1.5mL EP管中，离心13000g，10min，4℃。完全吸去上清。向EP管中加入12μL的mix1，包含7μL DEPC水，1μL oligo dT18和4μL 2.5nM dNTPs，混匀后金属浴65℃，5min，然后放在冰上使之冷却。向EP管中加入8μL的mix2，包含4μL 5×First buffer，1μL DEPC水，2μL 0.1M的DTT和1μL逆转录酶M-MLV，混匀。将EP管置于37℃孵育50min，70℃金属浴加热15min，灭活剩余逆转录酶后-20℃保存。
PCR扩增及荧光定量PCR:将所得cDNA作为模板，进行普通PCR扩增。PCR反应采用引物β-actin，由上海桑尼生物科技有限公司合成。20μL PCR反应体系如下表所示。
PCR反应体系
PCR扩增反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s，40个循环；72℃延伸10min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，确认产物是否符合实验结果。将逆转录得到的cDNA稀释30倍后用于RT-PCR分析。20μL RT-PCR反应体系下表所示。
RT-PCR反应体系
RT-PCR反应条件为：50℃，2min；95℃，10min；95℃15s，60℃1min，40个循环；95℃，15s；60℃，30s；95℃，15s。
目标基因相对表达量用方法分析，选用β-actin为内参。基因引物序列如下表所示。
引物序列
统计方法：所有数据均采用平均值±标准误差均值的方法来表示。两组数据之间的误差，采用一维方差分析的Student’s t检验方法，当p<0.05时为两组数据有明显区别。
图3为低剂量与高剂量索拉胶对APAP(300mg/kg)所诱导的小鼠急性肝衰竭模型的肝脏相关基因表达量的影响结果图。A图数据表明APAP诱导肝损伤24小时后，小鼠肝脏-αmRNA表达相比对照组有所上升：低剂量索拉胶组(APAP+LS)小鼠肝脏TNf-TNf-αmRNA表达与APAP模型组相比有下降的趋势，但两者无显著性区别，高剂量索拉胶组(APAP+HS)小鼠TNf-αmRNA表达与APAP模型组相比有所下降，但两者无显著性区别；B图数据表明APAP诱导肝损伤24小时后，小鼠肝脏IL-6mRNA表达相比对照组有所上升：而低剂量索拉胶组(APAP+LS)小鼠肝脏IL-6mRNA表达与APAP模型组组相比有下降的趋势，但两者无显著性差别；高剂量索拉胶组(APAP+HS)小鼠肝脏IL-6mRNA表达与APAP模型组相比有显著性下降。
图4为低剂量与高剂量索拉胶对APAP(300mg/kg)所诱导的小鼠急性肝衰竭模型的肝脏中GSH和MDA含量的变化图。A图数据表明APAP诱导的小鼠急性肝损伤0至4h，APAP诱导的急性肝损伤的小鼠肝脏GSH含量迅速降低，4h时小鼠肝脏GSH含量不足正常小鼠肝脏GSH数值的1/2；而索拉胶组(APAP+HS)小鼠肝脏GSH在4h时已基本恢复正常小鼠肝脏GSH数值。B图数据表明APAP诱导肝损伤24小时后，小鼠肝脏MDA含量相比对照组有所上升：低剂量索拉胶组(APAP+LS)小鼠肝脏MDA含量与APAP模型组相比有下降的趋势，但两者无显著性区别，高剂量索拉胶组(APAP+HS)小鼠Tnf-αmRNA表达与APAP模型组相比有所下降，但两者无显著性区别。
7.数据分析
多组之间的比较用ANOVA统计学方法进行统计分析。P＜0.05被认为有显著性区别。
8.急性肝衰竭时肝受损情况
APAP灌胃24h后可产生急性肝衰竭症状，并伴随血清AST和ALT酶活性的强烈升高，以及肝脏组织结构的变化，经HE染色显微可见明显的肝实质细胞坏死提示，APAP能产生明显的肝损伤。
9.急性肝衰竭时腺苷改善肝损伤的效力
用腺苷同APAP混合后进行处理WT小鼠，可缓解APAP所致肝损伤。观察到血清AST、ALT酶活性的显著降低、肝实质细胞坏死面积的减小及肝细胞的GSH的恢复。
表1索拉胶在保护对乙酰氨基酚急性肝损伤的指标对比
组别
ALT下降比例(％)
AST下降比例(％)
低剂量索拉胶/模型组
24.80
23.99
高剂量索拉胶/模型组
43.70
40.91
五味子醇提取物组/模型组
7.93
4.19
黑木耳多糖组/模型组
6.31
3.65
配伍高剂量组/模型组
21.28
19.89
表1为索拉胶在保护对乙酰氨基酚急性肝损伤的指标对比。在徐秀卉、杨波等人的《黑木耳多糖和五味子醇提物对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的保护作用》(以下用A组进行表示、B组为本专利)中，我们进行了如下对比：1.ALT下降比例：高剂量索拉胶组(APAP+LS)数值最高，其次是低剂量索拉胶组(APAP+LS)，接下来分别是配伍高剂量组、五味子醇提取物组、黑木耳多糖组。2.AST下降比例：同ALT。具体数值见表1。2.给药剂量与方式：剂量区别如下：A组APAP浓度为200mg/kg，五味子醇提取物组浓度为200mg/kg，黑木耳多糖组浓度为250mg/kg，配伍高剂量组浓度为五味子醇提物200mg/kg+黑木耳多糖250mg/kg，B组APAP浓度为300mg/kg，低剂量索拉胶组浓度仅为20mg/kg，高剂量索拉胶组浓度为40mg/kg；给药方式：A组每日按计量灌胃给药，连续10d，末次给药后1h除对照组外腹腔注射APAP造模；B组无需提前，当天各组均为灌胃给药。从表1可以看出，与五味子醇提取物组、黑木耳多糖组、配伍高剂量组三组对比，低剂量和高剂量的索拉胶对APAP诱导的急性肝损伤的作用更好，且剂量要求更低，无需提前给药。
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