具体实施方式

下面结合附图通过具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1，大肥菇菌丝体胞内多糖(ABSP)对巨噬细胞活性增殖能力的影响

采用CCK-8法检测多糖对RAW 264.7细胞活力的影响。RAW 264.7细胞用含有1％双抗(青霉素和链霉素)和10％的胎牛血清的RPMI1640培养液培养。培养条件为37℃，5％CO2，隔天传代。细胞冻存时用10％DMSO/RPMI1640细胞冻存液，保存在液氮罐中。复苏时37℃、1min内融化，1000r/min离心5min，弃上清，更换新鲜RPMI1640培养液，二氧化碳培养箱内培养。收集对数生长期细胞，调整细胞悬液的浓度为5×10⁴cell/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL。将载有细胞的96孔板置于二氧化碳恒温培养箱中，37℃、5％CO2条件下培养24h。弃上清，PBS洗涤2次后，加入用RPMI1640培养液稀释的不同浓度的多糖(25、50、100、200、400、800、1000μg/mL)100μL，阴性对照组仅加入细胞培养基；阳性对照组加入终质量浓度为1μg/mL的LPS，培养24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，培养箱孵育1h。用酶标仪于450nm处测各孔的吸光度。按下述公式计算细胞活力：

Cell viability％＝(ODsample－ODblank/ODcontrol－ODblank)×100％

如图1所示，用不同浓度的大肥菇菌丝体胞内多糖(ABSP)处理细胞24h后，ABSP(>400μg/mL)可以明显促进RAW 264.7细胞的增殖。巨噬细胞的增殖情况是反应机体免疫动态的重要指标，其增殖能力的提高对机体的免疫系统具有积极的影响。机体发生感染时，免疫系统被激活，巨噬细胞可以从血液中被招募至感染部位而后迅速增殖，或者在感染部位原位被激活并快速增殖，从而发挥抗感染效应。ABSP能够呈剂量依赖性地促进细胞增殖，说明ABSP具有增强机体免疫功能的活性。

实施例2，ABSP对巨噬细胞形态的影响

细胞的形态可直接反应细胞的活力，进而可以由此判断药物对细胞的毒性作用。RAW 264.7细胞经ABSP处理24h后，进行显微观察，显微照片如图2所示。对照组的细胞大部分呈圆形、椭圆形，少部分细胞有触角；在ABSP给药组中RAW 264.7细胞体积明显变大，且全部细胞均有触角分化，呈现出不规则的形态。巨噬细胞形态的变化会引起相应功能的改变，被激活的巨噬细胞表现为体积变大、胞内酶增加、内含物增多等，并且具有免疫调节功能明显提高。巨噬细胞经ABSP处理后，细胞依旧贴壁完好，无皱缩、漂浮现象，细胞密度呈现增加趋势。说明ABSP在该浓度对264.7细胞无毒性作用，同时能够促进细胞增殖。此外，细胞也出现体积增大、形状变为长梭形或棱形、伪足伸长等现象。由此可以推断，ABSP具有潜在的免疫调节活性。

实施例3，ABSP对巨噬细胞吞噬功能的影响

采用吞噬中性红实验检测对RAW 264.7细胞吞噬能力的影响。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×10⁴cell/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL。将载有细胞的96孔板置于二氧化碳恒温培养箱中，37℃，5％CO₂条件下培养24h。弃上清，PBS洗涤2次后，加入用RPMI1640培养液稀释的不同浓度的多糖(50、100、200μg/mL)150μL，并以150μL的LPS(0.1μg/mL)和培养液分别作为阳性对照和空白对照。培养24h后，弃细胞培养液，每孔加入0.1％中性红生理盐水溶液100μL，继续培养4h，倾去上清液，用37℃预温的PBS溶液洗3遍，每孔加入150μL细胞裂解液(冰醋酸：乙醇＝1:1)，置37℃放置1h，振荡均匀，用酶标仪于540nm处测吸光度。

巨噬细胞在体内通过吞噬作用发挥免疫调节功能，静息的巨噬细胞受到免疫调节药物刺激后，其吞噬功能会增强，因此测定巨噬细胞的吞噬功能可以评价药物的免疫活性。采用中性红法测定RAW 264.7细胞的吞噬活性，不用同浓度的ABSP处理细胞24h后，通过测定OD540nm来评价ABSP对RAW 264.7细胞的吞噬功能的影响。如图3所示，ABSP可以提高RAW264.7细胞的吞噬能力，随着ABSP浓度的增加，细胞吞噬能力进一步提高。ABSP处理后，巨噬细胞的中性红吞噬率明显增加，并且呈剂量依赖关系。由此可知ABSP可以增加巨噬细胞的吞噬能力从而提高机体免疫功能。

实施例4，ABSP对免疫抑制小鼠的作用

将小鼠随机分为4组(空白对照组、免疫抑制模型组、多糖低剂量组、多糖高剂量组)，每组5只(n＝5)，除对照组外，其余各组采取连续5d皮下注射环磷酰胺80mg/kg的方法制造免疫功能低下模型，模型制备成功后，大肥菇多糖低剂量组(10mg·kg^-1·d^-1)和大肥菇多糖高剂量组(30mg·kg^-1·d^-1)采取灌胃的方式给药，空白对照组和免疫抑制模型组用生理盐水给药，按0.1mL/10g体重计，连续给药10d。

实验各组小鼠给药10d后，采血抗凝后用血细胞计数仪检测小鼠血象。末次给药前12h，动物禁食，不禁水，停药24h后各组动物处死后，取脾脏、胸腺，称湿重并按公式计算脾和胸腺指数。

脾指数＝脾重量(mg)/体重(g)胸腺指数＝胸腺重量(mg)/体重(g)

各组小鼠在给药第3d，用2％绵羊红细胞腹腔注射，每只小鼠注射0.2mL致敏，5d后测量右后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％绵羊红细胞，每只小鼠20μL，24h后测量右后足跖部厚度，测量三次取平均值，计算足跖增加厚度(mm)，以足跖增加厚度表示DTH程度。

各组小鼠于给药第3d，腹腔注射2％的SRBC 0.2mL致敏。末次给药后24h，处死动物，小鼠摘眼球取血，分离血清，用生理盐水将血清稀释200倍，将稀释后的血清lmL置试管内，依次加入10％的绵羊红细胞0.5mL，补体lmL(用生理盐水按l：10稀释)，另设不加血清的对照管(以生理盐水代替)。置37℃恒温水浴锅中保温15min，冰浴中终止反应，2000r/min离心l0min。取上清夜lmL、生理盐水3mL于试管内，同时取10％的SRBC 0.25mL于另一支试管内，充分混匀，放置l0min后，于540nm处分别测定各管的光密度值。

半数溶血值HC₅₀＝(样品OD值/SRBC半数溶血时OD值)×稀释倍数

从表1看出，与空白对照组相比，免疫抑制模型组小鼠脾指数、胸腺指数均低于空白对照组，差异显著。与模型对照组比较，低剂量组和高剂量组均明显提高免疫抑制小鼠的脾指数和胸腺指数。

表1 ABSP对小鼠脏器指数的影响(X±S，n＝5)

注：^##与对照组比较，P<0.01；^**与模型组比较，P<0.01

ABSP对小鼠体液免疫功能的影响：由表2可见，与空白对照组相比模型组小鼠的血清溶血素值明显降低(P＜0.01)，多糖给药后能够使免疫抑制小鼠的体液免疫功能有所改善，并且高、低剂量的多糖均能使免疫抑制小鼠外周血中抗体含量恢复到正常水平。

表2 ABSP对小鼠血清溶血素的影响(X±S，n＝5)

注：^##与对照组比较，P<0.01；^**与模型组比较，P<0.01

ABSP对小鼠细胞免疫功能的影响：由表3可知，皮下注射环磷酰胺后，免疫抑制模型组小鼠的迟发超敏反应能力明显低于空白对照组，说明环磷酰胺对小鼠细胞免疫功能有显著的抑制作用。免疫抑制小鼠给药后，其迟发型超敏反应能力均显著高于免疫抑制组，高剂量可使免疫抑制小鼠的迟发超敏反应能力恢复到正常水平。

表3 ABSP对小鼠血清溶血素的影响(X±S，n＝5)

注：^##与对照组比较，P<0.01；^**与模型组比较，P<0.01

实施例5，ABSP对免疫抑制小鼠的作用

取健康昆明种雄性小鼠50只，随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组、免疫亢进模型组、免疫亢进+大肥菇多糖[低(10mg·kg^-1·d^-1)、高(30mg·kg^-1·d^-1)]剂量组。给每只小鼠每天肌注一次卡介苗生理盐水溶液(含卡介苗5mg)，连续注射11d，造成免疫亢进模型。正常对照组和免疫亢进模型组小鼠每天灌胃1次去离子水(20ml·kg^-1)，其他各组小鼠每天灌胃1次相应剂量的大肥菇多糖溶液，连续灌胃11d。

巨噬细胞吞噬活性检测：实验第10天，各组小鼠腹腔注射1mL 6％无菌可溶性淀粉溶液造成小鼠腹壁炎症反应，促使巨噬细胞游出。实验第11天早上测小鼠体质量，然后灌胃给药。1h后腹腔注射0.5ml 3％鸡红细胞溶液，1h后颈椎脱臼处死小鼠，用75％乙醇浸泡2min，剪开腹部皮肤，用镊子提起腹膜，用注射器注入2mL预冷的生理盐水，轻揉腹部1min，吸取腹腔冲洗液制作涂片，用瑞氏染色法染色后用油镜随机观察100个巨噬细胞，计数其中吞噬了鸡红细胞的巨噬细胞数及被吞噬的鸡红细胞数，按公式“吞噬百分率＝有吞噬作用的巨噬细胞数/计数的总巨噬细胞数×100％”和“吞噬指数＝有吞噬作用的巨噬细胞吞入的鸡红细胞总数/计数的总巨噬细胞数”分别计算吞噬百分率和吞噬指数。

小鼠脾淋巴细胞体外增殖能力测定：吸取腹腔冲洗液后，剪开腹膜，无菌条件下取出脾脏，置于无菌培养皿中，剔除脂肪和筋膜组织，用Hank液漂洗，然后用1mL注射器芯将其碾碎混匀，将得到的细胞悬液用200目细胞筛过滤，滤液装于2mL离心管中1000r/min离心3min，弃去上清液后每管加入溶血素1mL，混匀，静置3min后1000r/min离心3min，弃去上清，将脾淋巴细胞沉淀用RPMI 1640培养液离心洗涤2次；最后将上述收集到的脾淋巴细胞置于玻璃培养瓶中，取一部分经0.5％台盼蓝染色计数后调节细胞数至5×10⁶/mL，且活细胞数应大于95％。取上述小鼠脾淋巴细胞液，按100uL/孔加入96孔细胞培养板，每只小鼠的脾淋巴细胞做3个重复，空白组只含培养液，对照组含细胞和培养液，实验组加100μL Con A(2.5μg/mL)；将细胞培养板置于37℃，5％CO 2的培养箱中培养68h，取出，各孔加入50μL MTT工作液继续培养4h，培养结束后将每孔培养液上清轻轻吸出弃去，然

后每孔加150μL二甲基亚砜溶解MTT甲簪沉淀，用微量振荡器混匀，于酶标仪570nm波长读取各孔光密度值(OD 570nm)。计算刺激指数来反映各组脾淋巴细胞的增殖情况：刺激指数＝(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)

表4 ABSP对免疫亢进小鼠的作用

从表4可见，与正常对照组比较，免疫亢进模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性极显著升高，脾淋巴细胞增殖能力显著升高。与免疫亢进模型组相比，ABSP各剂量组的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性和脾淋巴细胞体外增殖能力均有所降低，缓解免疫亢进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性亢进和脾淋巴细胞体外增殖能力亢进降低，说明该多糖对于过度免疫具有较好的免疫下调作用。

以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。