具体实施方式

当数值伴有术语“约”时，该值旨在表示在所述值的-10％至所述值的+10％范围内的任何值。例如，“约20”意指“从18到22的值”。用下限值和上限值限定的范围涵盖从下限到上限的所有值，包括两个界限值。当范围伴有术语“约”时，两个界限被解读为伴有该术语。例如，“约20至30”被解读为“18至33”。

除非另外限定，本文中使用的术语如诸如有机化学、医学科学、药物科学、分子生物学和微生物学的技术领域中的技术人员通常所理解的进行解读。本文中使用的一些术语如下定义。本文中的定义优先于一般的理解。

术语“烷基”是指具有1至10个、优选1至6个碳原子的一价饱和脂族烃基。烷基的实例包括但不限于直链和支链的烃基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和新戊基。

作为修饰基团名称的用语的术语“取代的”表示该基团的一个或多个氢原子相同地或不同地被一个或多个指定取代基取代。

术语“亚烷基”是指具有1至10个、优选1至6个碳原子的二价饱和脂族烃基。亚烷基包括支链和直链的烃基。

术语“烷氧基”是指-O-烷基，其中烷基如本文中所定义。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基和正戊氧基。

术语“芳基”是指具有单个环(例如苯基)或多个稠合环(例如萘基或蒽基)的6至14个碳原子的一价芳族碳环基团。典型的芳基包括苯基和萘基。

术语“芳氧基”是指-O-芳基，其中芳基如本文中所定义。芳氧基的实例包括苯氧基和萘氧基。

术语“氰基”是指-CN基团。

术语“羧基(carboxyl或carboxy)”是指-COOH基团或其盐。

术语“羧基酯”是指-C(O)O-烷基，其中烷基如本文中所定义。

术语“卤素(halo)”是指卤素(halogen)，尤其是氟、氯、溴或碘。

术语“羟基”是指-OH基团。

除非另外指明，本文中未明确定义的取代基通过以下方式命名：首先描述取代基的末端官能团的名称，随后描述朝向与化合物的其余部分结合的点的一个或多个相邻官能团。例如，取代基“芳基烷基氧基羰基”是指(芳基)-(烷基)-O-C(O)-。

一些式(I)的化合物具有对映异构体或非对映异构体，这取决于它们的取代基的排列。一些式(I)的化合物可以作为外消旋混合物提供，或者可以以通过已知方法分离的立体异构纯形式提供。一些式(I)的化合物可以是互变异构体。

术语“酯”是指在体内水解的酯，其可以在人体内容易地分解以留下母体化合物或其盐。合适的酯包括例如来源于药用脂族羧酸(尤其是烷酸、烯酸、环烷酸和烷二酸(alkanedioic acid))的那些，其中每个烷基或烯基具有例如不超过六个碳原子。酯的实例包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基琥珀酸酯。

术语“氧化物”是指其中杂芳基中的氮被氧化而形成N-氧化物的氧化物。

术语“药用盐”可以表示式(I)的化合物与无机酸或有机酸的盐。优选的盐包括：与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸和硫酸的盐，以及与有机羧酸和磺酸诸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、马来酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸和萘二磺酸的盐。

药用盐还包括与常规碱的盐，诸如碱金属盐，例如钠盐和钾盐，碱土金属盐，例如钙盐和镁盐，来源于氨和有机胺(例如二乙胺、三乙胺、乙基二异丙基胺、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基吗啉、二氢松香胺(dihydroabiethylamine)、甲基哌啶、L-精氨酸、肌酸、胆碱、L-赖氨酸、乙二胺、N,N-二苄基乙二胺(benzathine)、乙醇胺、葡甲胺和氨丁三醇)的铵盐，尤其是钠盐。

术语“溶剂化物”意指与固态或液态的溶剂分子配位形成配合物的式(I)的化合物。合适的溶剂化物是水合物。

如本文中使用的术语“式(I)的化合物”旨在包括其酯、氧化物、药用盐和溶剂化物，只要情况允许即可。

在一个实施方案中，式(I)中的每个Ra基团都独立地选自由以下各项组成的组：卤素、羟基、烷基、卤素取代的烷基、和烷氧基。

在一个实施方案中，式(I)中的每个Ra基团都独立地选自由卤素和烷基组成的组。

在一个实施方案中，式(I)具有两个Ra基团，所述两个Ra基团是卤素和烷基。

在一个实施方案中，式(I)的化合物选自下表1中列出的化合物：

[表1-1]

[表1-2]

[表1-3]

在一个实施方案中，药物组合物的活性成分是由下式表示的4-氨基-3-[6-(4-氟-2-甲基苯基)吡啶-3-基偶氮基]萘-1-磺酸：

或者其酯、氧化物、药用盐或溶剂化物，优选钠盐。

在WO2012/014994(专利文献1)中详细描述了式(I)的化合物(尤其是上面列出的化合物)的特征以及其合成方法。

如本文中使用的术语“脑梗死”意指由脑缺血引起的大脑中的损伤，包括但不限于腔隙性脑梗死、动脉粥样硬化血栓性脑梗死和心源性脑栓塞。脑缺血的原因包括但不限于脑血栓形成、脑栓塞、血管痉挛、低血压和低氧血。如本文中使用的术语“脑梗死”包括与脑梗死相关的症状和脑梗死的后遗症，诸如神经病、高级脑功能障碍和情感障碍。

如本文中使用的术语“治疗”涵盖旨在治愈、改善、减轻、缓解和/或暂时改善疾病或病况的任何医学干预。例如，“治疗”涵盖用于多种目的的医学干预，包括延迟或停止疾病进展、消退或消除病变或者预防复发。

治疗的受试者包括动物，典型是哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊或猴)，尤其是人。

药物组合物可以通过常规的施用途径以任何方式施用，例如，通过口服施用、肠胃外施用、注射或输注。所述组合物可以是适合于各施用途径的剂型。所述组合物也可以鞘内、硬膜外或心室内施用。在一个实施方案中，所述药物组合物是静脉内施用的。

适合于口服施用的剂型包括颗粒剂、细粒剂、粉剂、包衣片剂、片剂、栓剂、细粉剂、胶囊剂、微胶囊剂、咀嚼片剂、液体剂、混悬剂和乳剂。适合于注射的剂型可以是常规剂型，例如适合于静脉注射、输注或用于活性成分的延长释放的制剂的那些。用于静脉注射或输注的剂型包括：水性和非水性可注射溶液，其可以包含赋形剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂或等渗剂；以及水性和非水性可注射混悬剂，其可以包含赋形剂，诸如悬浮剂或增稠剂。这样的剂型可以作为在密封的安瓿或小瓶中的液体剂提供，或者作为冻干产品提供并且通过加入无菌液体诸如注射用水而在使用前立即制备。可注射溶液或混悬剂可以由粉剂、颗粒剂或片剂制备。

这样的剂型可以通过用常规方法配制活性成分来制备。如果制剂需要的话，可以加入各种药用赋形剂中的任一种。可以根据所采用的剂型使用任何赋形剂。赋形剂的实例包括缓冲剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、填充剂、稀释剂、添加剂、崩解剂、粘合剂、包衣剂、润滑剂、润滑试剂、调味剂、甜味剂和增溶剂。

基于诸如受试者的动物物种、健康状况、年龄和重量，施用途径以及所采用的剂型的因素，药物组合物的给药的剂量和次数可以由本领域技术人员适当地设定，使得将有效量的式(I)的化合物施用至受试者。本领域技术人员在给定情形下可以通过常规实验容易地确定有效量，这在临床医师的普通技术和判断的范围内。例如，式(I)的化合物可以在约0.001至1000mg/kg体重/天、约0.01至300mg/kg体重/天或约0.1至100mg/kg体重/天的范围内施用。例如，药物组合物可以以单次剂量或多次剂量施用，或者可以连续地施用。

在一个实施方案中，药物组合物在脑梗死的急性期期间施用。术语“急性期”意指从脑梗死发病起14天的时期。可以在脑梗死发病之后，例如在脑梗死发病之后立即，例如在脑梗死发病之后约3小时、约4.5小时、约6小时、约8小时、约12小时或约24小时内，将药物组合物施用至受试者。在本公开中，脑缺血的原因(例如，脑动脉的闭塞或狭窄)发生的时间被认为是脑梗死发病的时间。在一个实施方案中，药物组合物在脑梗死的急性期期间以单次剂量或多次剂量施用。在一个实施方案中，药物组合物在整个脑梗死的急性期中或在脑梗死的急性期中的一部分期间连续地施用。在一个实施方案中，药物组合物在由脑梗死引起的炎症发生之前施用。存在或不存在炎症可以基于血液中的炎症标志物如CRP或IL-1β来确定。

在一个实施方案中，药物组合物可以在闭塞血管的再灌注程序(例如通过施用血栓溶解剂或通过手术)之前立即施用或在所述再灌注程序之后立即施用。术语“再灌注程序之前立即”意指在从再灌注程序之前几分钟或几十分钟(例如约60分钟、约30分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟或约3分钟)到再灌注程序的时间段以内的时间点。术语“再灌注程序之后立即”意指在从再灌注程序到再灌注程序之后几分钟或几十分钟(例如约60分钟、约30分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟或约3分钟)的时间段以内的时间点。在一个实施方案中，药物组合物与再灌注程序同时施用。备选地，可以在正在连续地施用药物组合物的同时进行再灌注程序。

在一个实施方案中，可以在急性期期间以单次剂量静脉内施用约1至1000mg/kg体重、约5至500mg/kg体重、约10至300mg/kg体重或约25至200mg/kg体重(例如约100mg/kg体重)的式(I)的化合物。

式(I)的化合物可以单独使用或者与至少一种另外的活性成分(尤其是用于治疗脑梗死的活性成分)组合使用。适合组合使用的活性成分的实例包括但不限于：血栓溶解剂，诸如tPA、rtPA(例如，阿替普酶(alteplase)、孟替普酶(monteplase)、帕米普酶(pamiteplase)、去氨普酶(desmoteplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase))和尿激酶，抗血小板剂(例如，奥扎格雷钠(ozagrel sodium)、阿司匹林、氯吡格雷(clopidogrel)和西洛他唑(cilostazol))，选择性凝血酶抑制剂(例如，阿加曲班(argatroban))，肝素，低分子量肝素，类肝素，脑保护剂(例如，依达拉奉(edaravone))，高渗甘油，高渗甘露醇，血管扩张剂，抗炎剂和他汀类药物(statins)，尤其是rtPA，尤其是阿替普酶。

当组合使用一些成分时，可以采用含有全部成分的剂型或单独含有所述成分的剂型的组合。所述成分可以同时施用，或者任一种成分都可以在稍后的时间点施用，只要所述成分用于治疗脑梗死即可。可以组合使用两种以上的另外的活性成分。

可以将非药物疗法与式(I)的化合物的施用组合。合适的疗法的实例包括：外科手术，诸如机械血栓切除术(mechanical thrombectomy)、去骨瓣减压术(decompressivecraniectomy)、紧急颈动脉内膜切除术(emergency carotid endarterectomy)、急性期再通疗法(acute recanalization therapy)和急性期颈部颈动脉血管重建术(acutecarotid revascularization)(血管成形术/支架植入术)、基因疗法和再生疗法。

本公开的一个方面提供了一种用于治疗脑梗死的方法，所述方法包括将有效量的式(I)的化合物施用至需要其的受试者。

本公开的一个方面提供了用于治疗脑梗死的式(I)的化合物。

本公开的一个方面提供了式(I)的化合物用于治疗脑梗死的用途。

本公开的一个方面提供了式(I)的化合物用于制备用于治疗脑梗死的药物组合物的用途。

例如，本公开提供了以下实施方案。

[1]一种用于治疗脑梗死的药物组合物，所述药物组合物包含式(I)的化合物或者其酯、氧化物、药用盐或溶剂化物：

其中

Ra选自由以下各项组成的组：卤素、羟基、烷基、卤素取代的烷基、芳基、卤素取代或烷基取代的芳基、烷氧基、羟基取代或羧基取代的烷氧基、芳氧基、卤素取代或烷基取代的芳氧基、CHO、C(O)-烷基、C(O)-芳基、C(O)-烷基-羧基、C(O)-亚烷基-羧基酯和氰基，并且

m为选自0至4的整数。

[2]根据项目1所述的药物组合物，其中每个Ra基团独立地选自由以下各项组成的组：卤素、羟基、烷基、卤素取代的烷基、和烷氧基。

[3]根据项目1或2所述的药物组合物，其中每个Ra基团独立地选自由卤素和烷基组成的组。

[4]根据项目1至3中任一项所述的药物组合物，其中式(I)具有两个Ra基团，所述两个Ra基团是卤素和烷基。

[5]根据项目1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述式(I)的化合物选自表1中列出的化合物。

[6]根据项目1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述式(I)的化合物是4-氨基-3-[6-(4-氟-2-甲基苯基)吡啶-3-基偶氮基]萘-1-磺酸。

[7]根据项目1至6中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物包含4-氨基-3-[6-(4-氟-2-甲基苯基)吡啶-3-基偶氮基]萘-1-磺酸钠盐。

[8]根据项目1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述脑梗死为腔隙性脑梗死、动脉粥样硬化血栓性脑梗死或心源性脑栓塞。

[9]根据项目1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述脑梗死为腔隙性脑梗死。

[10]根据项目1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在脑梗死的急性期期间施用。

[11]根据项目1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在脑梗死后的再灌注程序之前立即施用或之后立即施用。

[12]根据项目1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物与脑梗死后的再灌注程序同时施用。

[13]根据项目11或12所述的药物组合物，其中所述再灌注程序为血栓溶解剂的施用。

[14]根据项目11或12所述的药物组合物，其中所述再灌注程序为外科手术。

[15]根据项目1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物以单次剂量施用。

[16]根据项目1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物以多次剂量施用。

[17]根据项目1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是连续施用的。

[18]根据项目1至17中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在脑梗死发病后约24小时内施用。

[19]根据项目1至18中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在脑梗死发病后约12小时内施用。

[20]根据项目1至19中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在脑梗死发病后约8小时内施用。

[21]根据项目1至20中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在脑梗死发病后约6小时内施用。

[22]根据项目1至21中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在脑梗死发病后约4.5小时内施用。

[23]根据项目1至22中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在脑梗死发病后约3小时内施用。

[24]根据项目1至23中任一项所述的药物组合物，其中施用约1至1000mg/kg体重的所述式(I)的化合物。

[25]根据项目1至24中任一项所述的药物组合物，其中施用约5至500mg/kg体重的所述式(I)的化合物。

[26]根据项目1至25中任一项所述的药物组合物，其中施用约10至300mg/kg体重的所述式(I)的化合物。

[27]根据项目1至26中任一项所述的药物组合物，其中施用约25至200mg/kg体重的所述式(I)的化合物。

[28]根据项目1至27中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物与血栓溶解剂组合使用。

[29]根据项目28所述的药物组合物，其中所述血栓溶解剂为tPA。

[30]根据项目28或29所述的药物组合物，其中所述血栓溶解剂为阿替普酶。

[31]根据项目1至30中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是静脉内施用的。

本文中引用的文件的全部内容通过引用结合于此。

上述实施方案是非限制性的，并且可以在不偏离所附权利要求所限定的本发明的范围的情况下进行改变。以下实施例是非限制性的，并且仅提供用于说明本发明。

实施例1

材料和方法

原代神经元细胞培养

使用先前描述的方法(Maki T等，Annals of Clinical and TranslationalNeurology，2014年8月；1(8):519-33)由17日龄的斯普拉-道来大鼠(Sprague Dawley rat)胚胎(Shimizu Laboratory Supplies)制备大脑皮层神经元培养物。简而言之，将皮层切开并且分离。在含有5％热灭活胎牛血清和1％青霉素/链霉素的杜尔贝克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中，将细胞以200,000-250,000个细胞/cm²的密度铺在涂覆有聚-D-赖氨酸的培养皿上。在接种后24小时，将培养基换成含有0.5mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和2％B27补充剂的Neurobasal(NB)培养基。接种后14天，将培养的神经元用于实验。

氧糖剥夺

用不具有葡萄糖的DMEM替换培养基。然后，将细胞放入具有Anaero Pack的密封的Anaero容器(Mitsubishi Gas Chemical Company)中达1.5至2小时。在氧糖剥夺后，将细胞切换至正常培养基，并且返回至含氧量正常的5％CO₂培养箱中。

细胞活力测试

通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定(Dojindo Laboratories)来评价细胞活力。CCK-8测定基于水溶性四唑鎓盐即2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓一钠盐(WST-8)在电子载体的存在下通过脱氢酶还原时向水溶性甲臜染料的转化。将细胞与10％CCK-8溶液一起在37℃温育1至2小时。然后，用酶标仪在450nm的测试波长和630nm的参照波长下测量培养基的吸光度。

免疫细胞化学

将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，然后用4％多聚甲醛(PFA)处理15分钟。在进一步用PBS洗涤两次后，将它们与PBS/0.1％吐温一起温育(10分钟)，并且用3％BSA/PBS封闭(在室温1小时)。将细胞与针对MAP2的一抗(1:1000，Sigma Aldrich，M1406)一起在4℃温育过夜。之后，在用PBS洗涤后，将它们与二抗一起在室温温育1小时。最后，用DAPI对细胞核进行复染色。

ATP测定

按照制造商的方案用基于荧光素酶化学发光的细胞用ATP测定试剂(Toyo Ink)测量细胞裂解物中的ATP水平。简而言之，将100μL的制造商提供的裂解液添加到96孔板的各个孔中。在室温温育5分钟后，在发光计中测量溶液的等分试样的发光。

蛋白质印迹

将细胞收集，并且在含有10％2-巯基乙醇(Nacalai tesque)和1％蛋白酶抑制剂(Nacalai tesque)的RIPA缓冲液(20mM HEPES-KOH pH 7.4，150mM NaCl，2mM EDTA，1％Nonidet-P40，1％脱氧胆酸钠)中裂解。将切出的脑样品在具有2-巯基甲醇和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀化。将样品超声处理，并且在4℃以15,000rpm离心15分钟，并且收集上清液。加载蛋白质(15至20μg/泳道)，并且将蛋白质通过5-20％SDS-PAGE进行分离，并且转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore)。使用以下一抗：β-肌动蛋白(1:5000，Sigma Aldrich，A5441)，CHOP(1:1000，Cell Signaling Technology，L63F7)，NeuN(1:2000，MerckMillipore，ABN78)，VCP(1:500，ABGENT，AP6920b)。使用HRP标记的二抗(Santa CruzBiotechnology)进行通过增强化学发光(Nacalai tesque)的可视化。

小鼠

成年雄性C57BL/6(C57BL/6NJcl)和CB-17(CB-17/lcr-+/+Jcl)小鼠(6至7周龄)分别购自Shimizu Laboratory supplies和Clea Japan。使动物自由获取食物和水。

脑卒中手术

在CB-17小鼠中，如前所述(Kasahara Y，Ihara M，Nakagomi T等，CB-17小鼠中具有延长存活的脑缺血/再灌注的高度可重现模型(A highly reproducible model ofcerebral ischemia/reperfusion with extended survival in CB-17mice)，Neuroscience Research，2013年7月；76(3):163-8)在略微修改的情况下进行远端大脑中动脉闭塞(远端MCAO)。简而言之，分别通过吸入4％和1.5％的异氟烷(Pfizer)来诱导和保持全身麻醉。将小鼠以侧卧位放置，并且在左眼球和左外耳道之间形成皮肤切口。将左唾液腺和一部分颞肌切除以使得能够通过颅骨可见大脑中动脉(MCA)。在颅骨中形成钻孔。然后，将MCA分离并且用单丝尼龙缝线暂时闭塞。在闭塞22分钟后，通过移除尼龙缝线来恢复MCA血流。在手术期间，监测直肠温度，并且通过反馈调节加热垫将直肠温度控制在36.0至37.2℃。

在C57BL/6小鼠中，如前所述(Doyle KP，Fathali N，Siddiqui MR等，远端缺氧性脑卒中：具有高通量、低可变性和可量化功能缺陷的新型脑卒中小鼠模型(Distal hypoxicstroke:a new mouse model of stroke with high throughput,low variability and aquantifiable functional deficit)，Journal of Neuroscience Methods，2012年5月30日；207(1):31-40)在一些修改的情况下进行具有缺氧性的远端MCAO。在通过尼龙缝线闭塞远端MCA后，将小鼠放入含有10％氧气和90％氮气的大型室内。在30分钟的缺氧后，通过移除尼龙缝线使小鼠恢复至含氧量正常的状况。除了闭塞远端MCA以外，假手术与脑卒中手术相同。

脑卒中体积的评价

缺血后24小时，将小鼠深度麻醉并且用PBS和4％PFA进行心脏灌注。将大脑取出，并且在4％PFA中后固定48小时。将它们进一步在20％蔗糖中冷冻保护，直到它们沉到小瓶的底部。对于尼氏(Nissl)染色，在载玻片上每600μm将大脑在低温恒温器上连续地切成20μm厚的切片(相对于前囟，前后+2.0、+1.4、+0.8、+0.2、-0.4、-1.0和-1.6mm)。将切片在甲酚紫溶液中温育15分钟，并且在70％甲醇中脱水5秒。之后，将载玻片用封固剂覆盖。使用NIHimageJ软件测量每个切片上的身体同侧半球的面积和梗死的面积。将测量值乘以各切片之间的距离(600μm)，然后在整个大脑上求和，得到体积测量值。

加速转棒测试

缺血后二十四小时，将小鼠放在加速转棒装置上，其中速度在4分钟内从0加速至40rpm。测量小鼠可以在旋转圆柱体上停留的时间。进行三次试验，并且使用下落的最佳潜时。

KUS121的施用

将通过WO2012/014994(专利文献1)中描述的方法制备的4-氨基-3-[6-(4-氟-2-甲基苯基)吡啶-3-基偶氮基]萘-1-磺酸钠盐(在下文中被称为KUS121或KUS)溶解于在PBS中的5％克列莫佛(Cremophor)EL(Sigma)中以制得20μg/μL溶液。在局部缺陷脑卒中小鼠模型中，静脉内和腹膜内施用KUS121溶液(分别为100mg/kg和50mg/kg的KUS121)。

统计分析

除非另外说明，否则所有值都表示为平均值±SE。使用Dunnette检验(对于细胞活力测试)和Student检验(对于除细胞活力测试以外的那些)进行统计分析。具有p<0.05的概率值的差异被认为是统计上显著的。

结果

KUS121在氧糖剥夺条件下通过防止ATP耗尽来保护原代大脑皮层神经元。

图1示出了使用原代大脑皮层神经元的体外实验的程序。为了评价KUS121在缺血条件下对神经元的保护效果，在存在和不存在KUS121的情况下，在氧糖剥夺(OGD)后进行细胞活力测试(图1，上)。在大鼠大脑皮层原代神经元培养物中进行OGD达2小时，之后在21％O₂和含葡萄糖培养基下恢复另外的22小时。将对照神经元在21％O₂下在含葡萄糖培养基中保持24小时。暴露于OGD杀死原代大脑皮层神经元。然而，在整个实验中100μM和200μMKUS121的存在显著改善了在OGD后的神经元活力(在载体(DMSO)的情况下为18.1±1.9％，在100μM KUS的情况下为43.5±3.1％，并且在200μM KUS的情况下为42.4±3.7％；p<0.001)(图2)。此外，100μM KUS121与载体(DMSO)相比显著增加了MAP2阳性面积(在载体(DMSO)的情况下为0.87±0.13％，并且在100μM KUS的情况下为2.64±0.41％；p<0.05)(图3)。在没有OGD的情况下，DMSO或KUS121对神经元活力没有影响。

因为KUS121被报道为在病理情况下能够防止ATP耗尽，所以检查KUS121在用OGD处理的原代大脑皮层神经元中是否显示出类似的效果。在1.5小时OGD后，通过基于荧光素酶的测定来测量细胞ATP水平。用KUS处理提高了ATP水平(在载体(DMSO)的情况下为14.3±1.1％，并且在100μM KUS的情况下为28.0±2.3％；p<0.001)(图4)。在没有OGD的情况下，DMSO或KUS121对ATP水平没有影响。这些数据表明，KUS121在氧糖剥夺条件下通过防止ATP耗尽来保护原代大脑皮层神经元。

KUS121在内质网应激诱导条件下保护原代大脑皮层神经元。

因为在缺血后触发内质网应激，所以在用衣霉素处理原代大脑皮层神经元时测试KUS121的保护效果(图1，下)。已知衣霉素处理引起内质网应激。C/EBP同源蛋白质(CHOP)是内质网应激诱导的细胞死亡的核心介质，并且在内质网应激期间上调。将大脑皮层神经元暴露于0.25μg/mL衣霉素达6小时。KUS121抑制了在用衣霉素处理的原代大脑皮层神经元中的CHOP的表达(图5)。

用KUS121处理改善了运动功能并且减少了脑梗死体积。

图6示出了使用小鼠的体内实验的程序。为了评价KUS121对脑缺血的效果，在C57BL/6小鼠中诱导短暂性局灶脑缺血。在左侧大脑中动脉的远端部分的闭塞之后立即施用KUS121(图6，上)。在闭塞后二十四小时，KUS121与载体相比显著延长了转棒停留时间(在载体(5％克列莫佛)的情况下为134.5±18.4秒，并且在KUS的情况下为201.0±21.8秒；p<0.05)(图7)。另外，在KUS121处理的情况下梗死体积显著减少(在载体(5％克列莫佛)的情况下为8.8±0.63％，并且在KUS的情况下为4.7±1.70％；p<0.05)(图8)。

在CB-17小鼠中确认了神经元保护效果。在缺血之前立即施用KUS121减少了梗死体积(在载体(5％克列莫佛)的情况下为11.8±0.60％，并且在KUS的情况下为5.74±1.64％；p<0.05)(图9)。此外，大脑皮层的蛋白质印迹显示，利用KUS121保持了神经元标志物NeuN的表达(图10)。

工业实用性

本公开提供了一种基于从未使用过的机理治疗脑梗死的方法，因此可以用于医疗领域。