吡啶甲酰胺衍生物AMSP-30m在制备防治类风湿关节炎药物中的应用
阅读说明：本技术 吡啶甲酰胺衍生物AMSP-30m在制备防治类风湿关节炎药物中的应用 (Application of pyridine carboxamide derivative AMSP-30m in preparation of drugs for preventing and treating rheumatoid arthritis ) 是由 李�荣 刘明明 蔡莉 沐玉荣 周梦媛 孟博 刘方园 于 2020-12-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开吡啶甲酰胺衍生物AMSP-30m在制备防治类风湿关节炎药物中的应用,AMSP-30m的化学结构式如下所示：本发明提供了AMSP-30m在防治类风湿关节炎中的应用,发掘了AMSP-30m新的药用前景,开拓了一个新的药用领域；通过体内药效学实验和体外细胞实验,证实AMSP-30m具有高效防治类风湿关节炎的用途,AMSP-30m表现出了较好的治疗类风湿关节炎效果,且未见明显副作用,为将AMSP-30m制备成防治类风湿关节炎的创新药物提供了强有力的依据。(The invention discloses an application of a pyridine carboxamide derivative AMSP-30m in preparing a medicament for preventing and treating rheumatoid arthritis, wherein the chemical structural formula of the AMSP-30m is as follows: the invention provides the application of AMSP-30m in preventing and treating rheumatoid arthritis, explores the new medicinal prospect of AMSP-30m and develops a new medicinal field; in-vivo pharmacodynamic experiments and in-vitro cell experiments prove that the AMSP-30m has the function of efficiently preventing and treating the rheumatoid arthritis, the AMSP-30m shows better effect of treating the rheumatoid arthritis, no obvious side effect is seen, and a powerful basis is provided for preparing the AMSP-30m into an innovative medicine for preventing and treating the rheumatoid arthritis.)
技术领域
本发明涉及一种吡啶甲酰胺衍生物，具体涉及一种吡啶甲酰胺衍生物AMSP-30m在制备防治类风湿关节炎药物中的应用。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的慢性、系统性、进行性的自身免疫性疾病，以广泛且持续存在的关节滑膜炎症和不可逆软骨/骨破坏为主要特征，最终导致患者关节畸形和功能丧失，具有很高的致残率。RA的全球发病率约为1％，严重危害人类健康，降低生活质量。目前，RA治疗以减轻疼痛，控制炎症，改善关节功能等为主，临床上RA治疗措施以药物治疗为主，包括糖皮质激素、非甾体抗炎药、改善病情的抗风湿药和生物制剂等，但超过30％患者对临床常用治疗方法无明显疗效，且长期用药往往会产生毒副作用如胃肠道不适、溃疡、骨质疏松、机会性感染等，因此迫切需要开发针对特定靶点且具有较高安全性的新型RA治疗药物。
RA成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)过度增殖导致滑膜耗氧量增加，滑膜组织中存在血管翳形成、血供异常、炎症细胞浸润及炎症因子释放等，诸多因素导致关节局部缺氧，滑膜组织慢性缺氧微环境是RA重要病理特征之一。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是调节细胞缺氧反应的核心因子，缺氧下HIF-1α的稳定和蓄积导致靶基因转录水平的改变，HIF-1α表达高低是HIF-1α通路激活程度的标志。RA滑膜组织缺氧微环境持续激活HIF-1α通路，促进血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶等下游靶基因转录、诱导血管生成、促进RAFLS增殖、凋亡抑制、侵袭、促进炎症因子分泌等，密切参与滑膜炎症、滑膜增生、软骨/骨破坏等病理过程。因此，HIF-1α是极具潜力的RA防治新靶点，干预HIF-1α信号通路具有潜在的RA治疗意义。目前，RA治疗方面尚缺乏HIF-1α靶向抑制剂的相关研究报道，开发新型HIF-1α抑制剂用于RA的防治具有重要的临床价值。
吡啶甲酰胺衍生物AMSP-30m是新型HIF-1α抑制剂，其化学结构如下所示：
有研究表明：AMSP-30m抑制缺氧培养下肿瘤细胞HIF-1α蛋白的表达及HIF-1α信号通路，体外抑制缺氧培养下肿瘤细胞的侵袭、迁移、血管形成及体内抑制乳腺癌在裸鼠肺部形成转移灶，表现出较好的抗肿瘤作用。RAFLS异常增殖和高度侵袭性等类似于肿瘤细胞，有理由推测AMSP-30m可能通过抑制RA缺氧滑膜组织中HIF-1α蛋白表达进而发挥其潜在的抗风湿作用，但AMSP-30m防治类风湿关节炎的药理学作用尚未报道，本发明由此而来。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，针对现有的研究AMSP-30m与类风湿关节炎的关系的缺乏，本发明提供了一种AMSP-30m在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用，为防治类风湿关节炎提供了一种新途径。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
吡啶甲酰胺衍生物AMSP-30m在制备防治类风湿关节炎药物中的应用，AMSP-30m的化学名为N-(2-氟苯乙基)-5-(2-甲氧苯基)-吡啶甲酰胺，分子式为C21H19FN2O2，分子量为350.39，其化学结构如下所示：
进一步地，所述的防治类风湿关节炎药物包含有效剂量的AMSP-30m和药学上可接受的载体。
进一步地，所述的将AMSP-30m制备成适用于胃肠道和非胃肠道给药的药物制剂。
进一步地，所述的将AMSP-30m制备成适用于胃肠道给药的药物制剂，其药物制剂形式为常规片剂、胶囊剂、控释制剂和缓释制剂。
进一步地，所述的在AMSP-30m制备成的适用于胃肠道和非胃肠道给药的药物制剂中，AMSP-30m在药物制剂中的含量为1wt％-99wt％。
进一步地，所述的在AMSP-30m制备成的适用于胃肠道给药的药物制剂中，AMSP-30m在药物制剂中的含量为10wt％-90wt％。
进一步地，所述的药物制剂的制备方法为将AMSP-30m直接做成制剂，或者分别或/和辅料混合后做成药物制剂，然后进行包装即得。
进一步地，所述的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物制剂形式不同进行变化，但以保证该药物组合物在使用对象体内达到有效的血药浓度为前提。
本发明技术方案通过体内动物实验的方法，研究了AMSP-30m灌胃给药对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用。AMSP-30m可以降低佐剂性关节炎大鼠的继发性足肿胀和关节炎指数、减轻关节病变和软骨破坏、降低血清炎症细胞因子的水平，上述作用和AMSP-30m抑制滑膜组织中HIF-1α的表达有关，药效学实验为探讨AMSP-30m防治类风湿关节炎提供充分的实验依据。
本发明技术方案还通过体外细胞实验的方法，研究了AMSP-30m体外对缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞(MH7A)增殖、迁移、侵袭能力及HIF-1α蛋白表达的影响。AMSP-30m体外给药抑制缺氧培养的MH7A细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并且抑制缺氧培养的MH7A细胞中HIF-1α蛋白的表达，表明AMSP-30m作为HIF-1α抑制剂体外给药显著抑制缺氧培养的MH7A细胞异常活化，这可能是AMSP-30m防治类风湿关节炎的作用机制之一。
本发明提供的AMSP-30m在制备防治类风湿关节炎药物中的应用，具有以下优点：本发明发掘了AMSP-30m新的药用前景，开拓了一个新的药用领域；通过体内药效学实验和体外细胞实验，证实AMSP-30m具有高效防治类风湿关节炎的用途，为将其开发为防治类风湿关节炎新药提供了强有力的依据。
附图说明
图1为实施例1中AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠继发性足肿胀的影响。
图2为实施例1中AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠关节炎指数的影响。
图3为实施例1中AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠踝关节组织病理改变的影响。
图4为实施例1中AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠踝关节软骨损伤的影响。
图5为实施例1中AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠血清炎症因子水平的影响。
图6为实施例1中AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠滑膜中HIF-1α表达的影响。
图7为实施例2中AMSP-30m对缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞MH7A增殖的影响。
图8为实施例2中AMSP-30m对缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞MH7A迁移的影响。
图9为实施例2中AMSP-30m对缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞MH7A侵袭的影响。
图10为实施例2中AMSP-30m对缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞MH7A中HIF-1α表达的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
吡啶甲酰胺衍生物AMSP-30m治疗佐剂性关节炎大鼠的药效学研究
1.实验方法
1.1佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AIA)大鼠的建立和实验分组：
卡介苗80℃、1h灭活后与高压灭菌的液体石蜡充分碾磨混匀配成10g/L的乳剂(即弗氏完全佐剂)，SD大鼠左后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1mL致炎，制备AIA大鼠模型。正常对照组大鼠左后足跖皮内注射等体积的生理盐水。造模第12天(d12)，无继发侧关节肿胀症状的大鼠弃去，表现出AIA症状的大鼠随机分成模型组、AMSP-30m(30,60mg/kg)组和阳性药甲氨蝶呤(MTX,0.5mg/kg/3天)对照组。AMSP-30m和MTX临用前用0.5％羧甲基纤维钠(CMC-Na)配制成相应浓度的混悬液。用药组于造模后d13-26按相应剂量连续灌胃给药(10mL/kg)，每日一次，连续14天，正常对照组灌胃给予等容量的0.5％CMC-Na。
1.2继发性足肿胀和关节炎指数测定：
分别于致炎前(d0)和致炎后(d12,15,18,21,24,27)检测大鼠继发侧(非注射侧，右侧)后足容积，计算继发性足肿胀(ΔmL＝致炎后某时间点的足容积-致炎前的足容积)。并在上述时间点进行关节炎指数评分：0-无红肿；1-局限的足或踝关节轻度红肿；2-关节和足趾的轻度肿胀；3-足趾和踝关节的全部肿胀，4-踝关节至整个腿红肿或关节畸形，每爪最高4分，继发侧后足和两只前足共计最高12分。
1.3苏木精-伊红(HE)染色及组织学评分：
造模d28处死大鼠，取下右后足踝关节，4％多聚甲醛固定，10％硝酸脱钙，将踝关节纵向剖开，石蜡包埋、切片，HE染色，镜下观察病理变化、摄片，并根据滑膜增生、炎细胞浸润、血管翳形成等病理指标变化进行评分(0-无变化，1-轻度，2-中度，3-重度，4-非常重度)。
1.4番红O/固绿染色及Mankins评分：
取踝关节切片进行番红O/固绿染色，并对关节软骨损伤进行Mankins评分，从软骨结构(0-6分)、软骨细胞形态(0-3分)、染色评价(0-4分)、潮线完整性(0-1分)等进行评分，最高14分，最低0分。
1.5 ELISA检测炎症因子水平：
处死大鼠后收集血液，离心后取上清保存在-80℃。ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子的水平。
1.6蛋白质免疫印迹(western blot)检测滑膜组织中HIF-1α蛋白的表达：
取大鼠膝关节滑膜组织，加入含PMSF的RIPA裂解液充分裂解，离心取上清分装。蛋白上清液加等体积加样缓冲液(2×)，沸水浴5min，每孔加30μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，半干转法转膜。5％脱脂奶粉封闭2h，加入相应HIF-1α一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤。加辣根过氧化物酶标记的二抗室温反应2h，TBST洗涤。浸入含化学发光试剂A、B的水溶液中激发荧光，暗室中压X片，显影、定影。扫描底片，ImageJ软件进行半定量分析。
1.7统计学分析：
数据分析采用SPSS 16.0软件，数据结果以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA检验)，两两比较采用Tukey HSD进行分析，P<0.05表明差异具有统计学意义。
2.实验结果
2.1实验动物一般情况：
实验过程中无大鼠死亡。正常组大鼠活动灵活，精神状态良好，饮食正常，关节活动自如。AIA模型大鼠精神萎靡，饮食减少，关节活动有明显障碍，四肢关节肿胀，关节活动度小。AMSP-30m(30mg/kg)组大鼠精神状态一般，饮食情况好于AIA模型组，关节活动受限，部分关节红肿，行动能力部分恢复。AMSP-30m(60mg/kg)组和阳性药MTX组大鼠的饮食情况明显好于AIA模型组，精神状态较好，关节略有红肿，无明显活动障碍。
2.2 AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠继发性足肿胀的影响：
造模后d 13-26连续灌胃给药14天，在不同时间点测定继发侧后足爪容积，结果见图1，与正常组相比，AIA模型组大鼠右后足趾在d 12、d 15、d 18、d 21、d 24和d 27的继发性足肿胀明显增加(P<0.01)，在d24达到峰值，其后逐渐消退。与AIA模型组比较，AMSP-30m(30mg/kg)在d 21、d 24、d 27明显抑制AIA大鼠的继发性足肿胀；AMSP-30m(60mg/kg)在d18、d 21、d 24、d 27均有明显的抑制作用，AMSP-30m(60mg/kg)与阳性药MTX(0.5mg/kg/3d)具有相似的作用强度。
2.3 AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠关节炎指数的影响：
如图2所示，AIA大鼠的右后足爪和前爪出现红肿、变形，有的可见尾部结节，关节炎指数在d24天达到高峰。与正常组比较，AIA模型组大鼠在d 12、d 15、d 18、d 21、d 24和d27的关节炎指数均明显增加(P<0.01)；AMSP-30m(30,60mg/kg)能在d 21、d 24、d 27显著降低AIA大鼠的关节炎指数，MTX组大鼠在d 18、d 21、d 24和d 27的关节炎指数较模型组明显降低，AMSP-30m(60mg/kg)与阳性药MTX(0.5mg/kg/3d)具有相似的作用强度。
2.4 AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠踝关节组织病理改变的影响：
图3为HE染色结果，正常大鼠踝关节的滑膜衬里层由1-2层滑膜细胞组成，滑膜衬里下层为脂肪细胞和少量血管，关节面光滑，关节腔内无渗出，未见炎细胞浸润。AIA模型组大鼠关节病变表现为滑膜组织明显增生，滑膜衬里层细胞增加至3-4层甚至更多，滑膜囊内有大量炎细胞浸润，滑膜组织中有明显的血管翳形成，关节软骨存在破坏，具有人类RA的基本病理特点。AMSP-30m(30、60mg/kg)和MTX(0.5mg/kg/3d)对AIA大鼠踝关节组织的上述病理改变具有不同程度的改善作用。进一步从滑膜组织增生、炎细胞浸润和血管翳生成等方面进行组织病理学评分，结果表明，AIA模型组大鼠的各病理指标的组织病理学评分显著高于正常组大鼠，AMSP-30m(30、60mg/kg)能剂量依赖性地降低AIA大鼠踝关节中的滑膜组织增生、炎细胞浸润和血管翳形成，表明AMSP-30m明显改善AIA大鼠的关节损伤。AMSP-30m(60mg/kg)与阳性药MTX(0.5mg/kg/3d)具有相似的作用强度。
2.5 AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠踝关节软骨损伤的影响：
图4为番红O-固绿染色结果，由图可见，AIA大鼠关节软骨损伤严重，表现为软骨基质染色强度降低、软骨表面断裂、潮线不完整，AMSP-30m(30、60mg/kg)灌胃给药可不同程度减轻软骨损伤的严重程度。Mankin评分系统用于评估软骨病理变化，以量化软骨损伤的严重程度。结果表明，与AIA组相比，AMSP-30m(30、60mg/kg)和MTX均可以显著减轻AIA大鼠的软骨损伤。AMSP-30m(60mg/kg)与阳性药MTX(0.5mg/kg/3d)的作用强度类似。
2.6 AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠血清炎症因子水平的影响：
图5为ELISA检测结果，AIA组大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平明显高于正常组(P<0.01)，与AIA组相比，AMSP-30m(30、60mg/kg)可以剂量依赖性地降低AIA大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平，表现出较好的抗炎作用。AMSP-30m(60mg/kg)与阳性药MTX(0.5mg/kg/3d)的作用强度类似。
2.7 AMSP-30m对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中HIF-1α表达的影响：
图6为Western blot结果，AIA模型组大鼠滑膜组织中HIF-1α蛋白表达明显高于正常组，与AIA模型组相比，AMSP-30m(30、60mg/kg)和MTX明显降低AIA大鼠滑膜组织中HIF-1α蛋白表达，表明AMSP-30m可抑制AIA大鼠滑膜中HIF-1α信号通路。AMSP-30m(60mg/kg)与阳性药MTX(0.5mg/kg/3d)的作用强度类似。
3.结论
吡啶甲酰胺衍生物AMSP-30m灌胃给药显著减轻AIA大鼠的关节炎症，显著减少AIA大鼠的关节损伤和软骨破坏，明显减少AIA大鼠血清炎症细胞因子的水平，明显抑制AIA大鼠滑膜组织中HIF-1α蛋白表达，表明化合物AMSP-30m作为HIF-1α抑制剂是一个可以用于防治类风湿关节炎的药物。
实施例2
吡啶甲酰胺衍生物AMSP-30m体外对缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞MH7A生物学特性的影响
1.实验方法
1.1 MTT法检测细胞增殖：
细胞分组如下：缺氧(1％O2)组、缺氧+DMSO溶剂对照组、缺氧+AMSP-30m(10μM)组。将人成纤维样滑膜细胞(MH7A)悬液接种于96孔培养板(100μL/孔)，细胞密度约为4000个细胞/孔，37℃、5％CO2培养贴壁，弃去原培养液，加入含AMSP-30m(终浓度10μM)的DMEM培养液100μL，另设未加药处理组和DMSO溶剂对照组。置于缺氧培养箱培养48h，每孔加入10μL MTT(5g/L)继续培养4h，吸弃上清，每孔加二甲亚砜100μL，振荡，用酶标仪检测吸光度A(490nm)，以未加药组为对照，检测细胞相对增殖能力。
1.2划痕实验检测细胞迁移：
细胞分组如下：缺氧(1％O2)组、缺氧+DMSO溶剂对照组、缺氧+AMSP-30m(10μM)组。收集细胞悬液，计数板计数，将细胞密度调至1×108/L，吸取2mL接种于6孔板。待生长至融合度达90％时，用枪头垂直于细胞层面划直线。PBS清洗，加入含AMSP-30m的DMEM培养液，放入缺氧培养箱培养，在0和24h时间点取样拍照。以0h划痕距离为基准(L0h)，计算培养24h的划痕距离的变化值(L0h-L24h)，并计算迁移指数：(L0h-L24h)/L0h。
1.3 Transwell实验检测细胞侵袭：
细胞分组如下：缺氧(1％O2)组、缺氧+DMSO溶剂对照组、缺氧+AMSP-30m(10μM)组。在24孔板中放入Transwell小室并铺好Matrigel胶，准备好细胞悬液，计数板计数后在上室中加入1×108/L的无血清细胞悬液100μL，下室加入含不同浓度AMSP-30m的10％FBS培养基500μL，置缺氧培养箱培养24h。将上室取出，PBS清洗，4％多聚甲醛200μL固定30min，0.1％结晶紫染色20min。将结晶紫吸出，用棉签轻轻擦拭膜内表面，PBS清洗，干燥后置显微镜下观察并采集图像，随机取5个视野进行细胞计数，结果用每个视野的侵袭细胞数的平均值来表示。
1.4 Western blot检测细胞中HIF-1α蛋白表达：
细胞分组如下：缺氧(1％O2)组、缺氧+DMSO溶剂对照组、缺氧+AMSP-30m(10μM)组。取各组MH7A细胞，加入含PMSF的RIPA裂解液充分裂解，离心取上清分装。蛋白上清液加等体积加样缓冲液(2×)，沸水浴5min，每孔加30μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，半干转法转膜。5％脱脂奶粉封闭2h，加入相应HIF-1α一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤。加辣根过氧化物酶标记的二抗室温反应2h，TBST洗涤。浸入含化学发光试剂A、B的水溶液中激发荧光，暗室中压X片，显影、定影。扫描底片，ImageJ软件进行半定量分析。
1.5统计学分析：
数据分析采用SPSS 16.0软件，数据结果以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA检验)，两两比较采用Tukey HSD进行分析，P<0.05表明差异具有统计学意义。
2.实验结果
2.1 AMSP-30m对缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞MH7A增殖的影响：
图7为MTT实验结果，在缺氧培养条件下，与未加药物处理的MH7A细胞相比，DMSO(0.1％)溶剂对照对缺氧培养的MH7A细胞增殖能力无影响，而AMSP-30m(10μM)体外给药可以显著抑制缺氧培养48h的MH7A细胞的增殖能力(P<0.01)。
2.2 AMSP-30m对缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞MH7A迁移的影响：
图8为划痕实验结果，在缺氧培养条件下，与未加药物处理的MH7A细胞相比，DMSO(0.1％)溶剂对照对缺氧培养的MH7A细胞迁移能力无影响，而AMSP-30m(10μM)体外给药显著减少缺氧培养24h的MH7A细胞的迁移指数、降低其迁移能力(P<0.01)。
2.3 AMSP-30m对缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞MH7A侵袭的影响：
图9为Transwell实验结果，在缺氧培养条件下，与未加药物处理的MH7A细胞相比，DMSO(0.1％)溶剂对照对缺氧培养的MH7A细胞的侵袭能力无影响，而AMSP-30m(10μM)体外给药可以显著减少缺氧培养24h的MH7A细胞穿过Matrigel的细胞数、降低其侵袭能力(P<0.01)。
2.4 AMSP-30m对缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞MH7A中HIF-1α表达的影响：
图10为Western blot检测结果，在缺氧培养条件下，与未加药物处理的MH7A细胞相比，DMSO(0.1％)溶剂对照对缺氧培养的MH7A细胞中HIF-1α蛋白表达无影响，而AMSP-30m(10μM)体外给药可以显著抑制缺氧培养24h的MH7A细胞中HIF-1α蛋白表达(P<0.01)，表明AMSP-30m可以抑制缺氧条件下MH7A细胞中的HIF-1α信号通路。
3.结论
吡啶甲酰胺衍生物AMSP-30m作为HIF-1α抑制剂体外显著抑制缺氧培养的人成纤维样滑膜细胞MH7A的增殖、转移和侵袭能力，明显抑制缺氧培养的MH7A细胞异常活化，这可能是AMSP-30m防治类风湿关节炎的作用机制之一。
以上所述的实施例1和实施例2应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应落入本发明权利要求所限定的保护范围之内。