具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，一种畜牧养殖用喷剂，所述喷剂主要由叶下珠提取物、N-乙酰神经氨糖酸、钨酸钠、甘油、乙醇和水制得。

本发明提供的畜牧养殖用喷剂，所述喷剂主要由叶下珠提取物、N-乙酰神经氨糖酸、钨酸钠、甘油、乙醇和水制得。上述原料中叶下珠提取物无毒副作用，有公认的抗菌抗病毒功效，且能激活畜体免疫反应，提高机体免疫力，有利于畜牧微生物疾病的预防及治疗，N-乙酰神经氨糖酸一方面能阻止细菌入侵机体，另一方面是流感病毒的受体，能与结合病毒的粘液细胞表面受体竞争病毒的结合，阻止病毒与粘液细胞的结合，从而降低畜牧微生物疾病的感染风险，钨酸钠作为金属离子维持喷剂液体的电离平衡，使各成分均匀分布，同时稳定液体PH呈中性，甘油是良好的湿润剂与溶剂，有助于喷剂的吸收，乙醇是广泛使用的有机溶剂，且对细菌有一定的灭杀作用。通过上述各原料的协同复配，不仅可以形成稳定的体相缔合结构，而且在界面上可以发生协同吸附，更有效地降低喷剂液滴表面张力，从而利于皮肤及粘膜的吸收。制得的上述畜牧养殖用喷剂具有很好的抗菌抗病毒的作用，在空气环境中喷施后能有效防止细菌病毒入侵动物机体，增强机体对有害微生物的免疫功能，同时灭杀环境中的有害微生物，确保畜牧养殖的生物安全，对畜牧养殖中微生物疾病的传播和危害具有很好的防控意义。

在本发明的一种优选实施方式中，按质量份数计，所述喷剂主要由以下原料制得：叶下珠提取物15～28份、N-乙酰神经氨糖酸15～28份、钨酸钠8～15份、甘油8～15份、乙醇6～12份和水900～932份；所述喷剂中各原料的质量份数之和为1000份；

上述叶下珠提取物典型但非限制性的优选实施方案为：15份、18份、20份、22份、24份、26份和28份；

上述N-乙酰神经氨糖酸典型但非限制性的优选实施方案为：15份、18份、20份、22份、24份、26份和28份；

上述钨酸钠典型但非限制性的优选实施方案为：8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份和15份；

上述甘油典型但非限制性的优选实施方案为：8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份和15份；

上述乙醇典型但非限制性的优选实施方案为：6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份；

上述水典型但非限制性的优选实施方案为：920份、922份、924份、926份、928份、932份、934份、936份、938份和940份。

在上述优选实施方式中，按质量份数计，所述喷剂主要由以下原料制得：叶下珠提取物20份、N-乙酰神经氨糖酸20份、钨酸钠10份、甘油10份、乙醇8份和水932份。

本发明中，通过对各组分原料用量比例的进一步调整和优化，从而进一步优化了本发明畜牧养殖用喷剂的效果。

在本发明的一种优选实施方式中，所述叶下珠提取物主要由叶下珠全草粉提取得到；

作为一种优选的实施方式，上述叶下珠提取物来自中药叶下珠，具有天然、安全、容易获取、药效温和以及抗菌、抗病毒等优点。应用该提取物制备得到的喷剂具有广谱的抗菌抗病毒活性，叶下珠提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、蜡状芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、肠球菌等畜牧养殖中常见的病原菌均有抑制作用，且不易产生耐药性；同时对新城疫病毒、禽流感病毒、烟草花叶病毒和乙肝病毒等具有显著的抗病毒效果。

优选地，所述叶下珠全草粉提取的提取方法为索氏提取(加热温度控制蒸馏速度在4到6滴每秒)。

在上述优选实施方式中，所述叶下珠提取物的提取方法包括以下步骤：

将叶下珠全草粉置于索氏提取器内，随后加入水进行索氏抽提，得到叶下珠提取物；

在上述优选实施方式中，所述索氏抽提的时间为4～6h，优选为4h。

优选地，所述叶下珠提取物的制备方法包括以下步骤：称取10g叶下珠中药粉体装入滤纸袋后，放进索氏抽提器内，接收瓶中加入100mL蒸馏水，索式抽提4h，接受瓶内的水提物定容至100mL即为叶下珠提取物；

在本发明的一种优选实施方式中，所述叶下珠全草粉的粒径为过40～60目筛粉末，优选为过40目筛粉末。

作为一种优选的实施方式，上述叶下珠全草粉为将去杂晾晒干后的叶下珠全草粉碎均匀形成中药粉体，粒度要求95％通过40目筛网。

在本发明的一种优选实施方式中，所述叶下珠全草粉与水的质量比为1：10～12，优选为1：10。

作为一种优选的实施方式，上述叶下珠全草粉与水的质量比是根据大量证实该质量比能在保证叶下珠有效成分完全提取的情况下，又能显著提高提取效率的实验结果下设立。

根据本发明的一个方面，一种上述畜牧养殖用喷剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

将配方量的叶下珠提取物、N-乙酰神经氨糖酸、钨酸钠、甘油和乙醇混合得到混合料；随后将混合料与水充分混匀，得到畜牧养殖用喷剂。

本发明提供的畜牧养殖用喷剂的制备方法，该制备方法为将配方量的叶下珠提取物、N-乙酰神经氨糖酸、钨酸钠、甘油和乙醇混合得到混合料；随后将混合料与水充分混匀，得到畜牧养殖用喷剂。上述制备方法具有制备工艺简单、易于操作的优势，十分适用于大规模工业化生产。

在本发明的一种优选实施方式中，所述混合料与水充分混匀在搅拌的条件下进行；

在上述优选实施方式中，所述搅拌的速度为500～600转每分钟，搅拌的时间为10～15分钟，环境温度为20～25度。

在本发明的一种优选实施方式中，所述制备方法还包括对制得的畜牧养殖用喷剂进行灭菌的步骤；

优选地，所述灭菌方式为紫外灭菌30～60分钟。

根据本发明的一个方面，一种上述畜牧养殖用喷剂在畜牧养殖空气消毒中的应用。

本发明提供的上述畜牧养殖用喷剂可以广泛应用于畜牧养殖的空气消毒中。

下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。

实施例1

一种畜牧养殖用喷剂，按质量份数计，所述喷剂主要由以下原料制得：

叶下珠提取物20份、N-乙酰神经氨糖酸20份、钨酸钠10份、甘油10份、乙醇8份和水932份；

上述畜牧养殖用喷剂的制备方法，包括以下步骤：

将去杂晾晒干后的叶下珠全草粉碎均匀形成中药粉体，粒度要求95％通过40目筛网；称取10g叶下珠中药粉体装入滤纸袋后，放进索氏抽提器内，接收瓶中加入100mL蒸馏水，索式抽提4h，接受瓶内的水提物定容至100mL即为叶下珠提取物；

将叶下珠提取物、N-乙酰神经氨糖酸、钨酸钠、甘油和乙醇按给定重量份计比例混合，加水磁力搅拌500～600转每分钟混匀10～15分钟；按每瓶250mL的量进行分装；紫外灭菌30～60分钟后得到喷剂。

实施例2

一种畜牧养殖用喷剂，按质量份数计，所述喷剂主要由以下原料制得：

叶下珠提取物24份、N-乙酰神经氨糖酸24份、钨酸钠12份、甘油12份、乙醇10份和水918份；

上述畜牧养殖用喷剂的制备方法同实施例1。

实施例3

一种畜牧养殖用喷剂，按质量份数计，所述喷剂主要由以下原料制得：

叶下珠提取物28份、N-乙酰神经氨糖酸28份、钨酸钠15份、甘油15份、乙醇12份和水902份；

上述畜牧养殖用喷剂的制备方法同实施例1。

实施例4

一种畜牧养殖用喷剂，按质量份数计，所述喷剂的原料组成同实施例1；

上述畜牧养殖用喷剂的制备方法，包括以下步骤：

将去杂晾晒干后的叶下珠全草粉碎均匀形成中药粉体，粒度要求95％通过60目筛网；称取8.3g叶下珠中药粉体装入滤纸袋后，放进索氏抽提器内，接收瓶中加入100mL蒸馏水，索式抽提6h，接受瓶内的水提物定容至100mL即为叶下珠提取物；

将叶下珠提取物、N-乙酰神经氨糖酸、钨酸钠、甘油和乙醇按给定重量份计比例混合，加水磁力搅拌500～600转每分钟混匀10～15分钟；按每瓶250mL的量进行分装；紫外灭菌30～60分钟后得到喷剂。

对比例1

一种畜牧养殖用喷剂，按质量份数计，所述喷剂主要由以下原料制得：

钨酸钠10份、甘油10份、乙醇8份和水972份；

上述畜牧养殖用喷剂的制备方法，包括以下步骤：

将钨酸钠、甘油和乙醇按给定重量份计比例混合，加水磁力搅拌500～600转每分钟混匀10～15分钟；按每瓶250mL的量进行分装；紫外灭菌30～60分钟后得到喷剂。

对比例2

一种畜牧养殖用喷剂，按质量份数计，所述喷剂主要由以下原料制得：

N-乙酰神经氨糖酸24份、甘油12份、乙醇10份和水956份；

上述畜牧养殖用喷剂的制备方法，包括以下步骤：

将N-乙酰神经氨糖酸、甘油和乙醇按给定重量份计比例混合，加水磁力搅拌500～600转每分钟混匀10～15分钟；按每瓶250mL的量进行分装；紫外灭菌30～60分钟后得到喷剂。

对比例3

一种畜牧养殖用喷剂，按质量份数计，所述喷剂主要由以下原料制得：

N-乙酰神经氨糖酸28份、钨酸钠15份、乙醇12份和水945份；

上述畜牧养殖用喷剂的制备方法，包括以下步骤：

将N-乙酰神经氨糖酸、钨酸钠和乙醇按给定重量份计比例混合，加水磁力搅拌500～600转每分钟混匀10～15分钟；按每瓶250mL的量进行分装；紫外灭菌30～60分钟后得到喷剂。

实验例1抗菌能力测定：

本实验用打孔法测试本发明实施例1～4以及对比例1～3制备得到的喷剂的抗菌能力，具体步骤如下：

(1)于超净工作台内，向每个灭菌培养皿中倾注约15-20mL的素琼脂进行铺底，每个培养皿厚度均一，待素琼脂冷却凝固，备用。

(2)吸取调制好的指示菌菌液1mL加入到100mL恒温至50℃左右的LB固体培养基中，轻轻摇匀(避免起泡，此时指示菌在培养基中的浓度为10⁶cfu/mL)，在平板背面做好浓度梯度标记，将灭菌好的牛津杯置于菌层培养基之上，每个培养皿可等距离放置7个牛津杯。

(3)向每个培养皿倒入15-20mL，该层一定要均匀铺平，待其冷却凝固后用无菌镊子小心夹去牛津杯，形成圆孔。

(4)吸取150μL的倍比稀释实施例1～3制得的喷剂样液加入到相应的牛津杯内，同时设立灭菌水为空白对照。

(5)将加过样的培养皿放入4℃的冰箱中预扩散3-4小时。

(6)将上述培养皿移入培养箱中37℃培养，8-12h观察抑菌圈，由于指示菌不同或每次铺制平板操作不同，时间会有差别，要及时观察。

(7)培养结束后，用游标卡尺测量抑菌圈直径(单位mm)，根据产生抑菌圈进行判断，抑菌圈的大小反应其抗菌效果的强弱。

实验结果：

本发明实施例1～4以及对比例1～3制备得到的喷剂对大肠肝菌ATCC-25922(购自美国模式菌种收集中心ATCC)和金黄色葡萄球菌ATCC-6538P(购自美国模式菌种收集中心ATCC)的抑制作用结果如表1和表2所示。

表1：喷剂对大肠杆菌产生的抑菌圈大小(单位：mm)：

表2：喷剂对金黄色葡萄球菌产生的抑菌圈大小(单位：mm)：

由上述表1和表2可知，与空白对照组和对比例1～3相比实施例1～4制得的喷剂在稀释3倍之前均对大肠杆菌和金黄色葡萄有一定的抑菌能力；而对比例1～3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用与空白对照组无显著差异。以上结果说明：本发明制备得到的喷剂能够对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生有效且显著的抑菌效果。

实验例2细胞毒性实验测定：

本实验通过细胞消化计数法测定本发明实施例1～4以及对比例1～3制备得到的喷剂对细胞生存状况的影响，从而反映喷剂对细胞的毒性强弱，具体步骤如下：

(1)、以9×10⁴个/孔的细胞浓度，将A549细胞(腺癌人类肺泡基底上皮细胞)接种到24孔板，每孔加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基1mL，在细胞培养箱内以37℃、5％CO₂的条件培养48h至单层细胞长满；

(2)、弃去培养基，使用PBS清洗细胞3次，再将各喷剂以1mL/孔的量孵育在细胞上，设置相同浓度空白对照组，同时每个组做3个复孔，在细胞培养箱内以37℃、5％CO₂的条件培养48h；

(3)、弃去上清液，使用PBS清洗细胞3次，每孔加入0.25％胰酶1mL，37℃、5％CO₂的条件消化3min，轻柔吹打混匀后用赛默飞CountessⅡFL全自动细胞计数仪测定每孔的细胞数量。

所述实验结果如表3所示。

表3：喷剂作用后A549细胞的生长数目(单位：个)：

由上述表3可知，本发明实施例1～4制得的喷剂孵育后A549细胞生长(购自国家生物医学实验细胞资源库BMCR)的数目与空白对照组相比基本不变；说明本发明制备的喷剂细胞毒性低到基本可以忽略或者说没有毒性。

实验例3抗病毒能力实验测定：

本实验通过细胞消化计数法测定本发明实施例1～4以及对比例1～3制备得到的喷剂对感染病毒细胞生存状况的影响，从而反映喷剂对感染病毒细胞的抗病毒能力强弱，具体步骤如下：

(1)、9×10⁴个/孔的细胞浓度，将A549细胞(腺癌人类肺泡基底上皮细胞)接种到24孔板，每孔加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基1mL，在细胞培养箱内以37℃、5％CO2的条件培养48h至单层细胞长满；

(2)、去培养基，使用PBS清洗细胞3次，以1个MOI的量接种用RPMI-1640培养基稀释的NDV-herts33毒株，在细胞培养箱内以37℃、5％CO2的条件接毒1h。

(3)、去培养基，使用PBS清洗细胞3次，将各喷剂以1mL/孔的量孵育在细胞上，以RPMI-1640培养基设置空白对照组，再每孔加入含4％胎牛血清的RPMI-1640培养基1mL，同时每个组做3个复孔，在细胞培养箱内以37℃、5％CO2的条件培养6h、12h、18h、24h四个实验批次；

(4)、去上清液，使用PBS清洗细胞3次，每孔加入0.25％胰酶1mL，37℃、5％CO2的条件消化3min，轻柔吹打混匀后用赛默飞CountessⅡFL全自动细胞计数仪测定每孔的细胞数量，具体检测结果如表4所示：

表4：喷剂作用后接毒A549细胞的生长数目(单位：个)：

由表4可知，与空白对照组相比，随着时间的推移，12h后开始本发明实施例1～4制得的抗菌抗病毒喷剂能明显提升感染NDV的A549细胞存活率；说明本发明制备的喷剂对NDV-herts33有一定的抗病毒能力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。