具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得了一种病毒样本保存液，本发明优选地病毒样本保存液中包含蛋白酶K、氢氧化钠、β-丙内酯、明胶等组分，通过各组分的协同的配合能够在室温条件下有效释放和保存病毒核酸，并在样本常温运输和保存过程中有效防止核酸降解，可用于制备临床病毒核酸样本。特别地，本发明人在研究过程中意外发现，在病毒样本保存液中添加明胶组分，既能够保证临床样本的病毒灭活效果，也能够显著降低样本保存液中化学组分对后续PCR扩增的影响，从能能够避免核酸提取步骤，可直接加入(RT-)PCR扩增试剂体系中进行基因扩增检测，大大简化病毒检测操作流程和时间。

本发明的试剂盒及配套方法灵敏度高、耗时短、适用性强。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

本发明的目的在于提供一种灭活、直扩型病毒保存液，并将之应用于病毒核酸PCR直接扩增检测中，灭活病原体，防止病原扩散，简化操作步骤，缩短病毒核酸检测时间和成本。

为了实现上述目的，本发明提供一种灭活、直扩型病毒保存液，包括以下组分：变性剂、两性离子缓冲液、非离子型表面活性剂、螯合剂、抑菌/灭活剂、增溶剂/乳化剂，pH＝7.0-9.0。

所述变性剂包括蛋白酶K和氢氧化钠中的一种或两种。蛋白酶K可以直接裂解病毒释放核酸，消除核酸酶(RNase/DNase)以防止病毒核酸降解，另外，蛋白酶K可以作为灭活剂使病毒外壳蛋白变性，病毒失去活性而“死掉”，不再有传染性，提高运输和检测阶段的安全性。

所述非离子型表面活性剂可以为吐温20、吐温80、NP-40和Triton-100中的一种或几种，能够温和破坏细胞或病毒释放核酸。本发明优选0.01-1％的Triton-100。Triton X-100是一种比较温和的非离子型表面活性剂，可以溶解脂质，破坏细胞，破坏蛋白质-脂质以及脂质-脂质之间的连接，使蛋白质溶解和分离，但却保留了蛋白质的天然构象、功能以及它们的相互作用。

所述螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)和次氮基三乙酸三钠盐一水合物(NTA)中的一种或几种，优选地，为0.5-5mM的EDTA。EDTA是常用的Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二价金属离子螯合剂，能有效去除样本中的二价金属离子，抑制多数依靠Mg²⁺作用的核酸酶的活性，降低核酸酶对核酸降解的风险，有利于保持核酸稳定。此外，EDTA也有变性剂的功能。

所述两性离子缓冲液可以为有机缓冲溶液和/或无机缓冲溶液，其中有机溶液可以为Tris、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸、甘氨酸、甘露糖或柠檬酸三钠等，无机溶液可以为碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或硼酸盐。本发明优选终浓度为10mM–200mM的Tris-HCl，可以提供足够的缓冲环境，保持保存液的稳定性，同时保持核酸稳定，避免脱氨基的发生。

所述稳定剂包括明胶(Gelatin)和PEG8000中的一种或两种，本发明优选终浓度为1-5％的明胶。

所述灭活(抑菌)剂包括Proclin-300和β-丙内酯中的一种或两种。其中β-丙内酯(BPL)作为疫苗灭活剂，可直接作用于核酸，对病毒具有很强的灭活能力。ProClin生物灭活剂具有广谱的抗菌性，作用速度快，使用剂量少，能够迅速穿透细胞膜，抑制对细胞呼吸至关重要的特定酶，因此一接触微生物有机体就会立即抑制细胞活性，6-20ppm的ProClin300即可达到抑菌的目的，并且其毒性远低于同类产品硫柳汞，并具有良好的酶和诊断因子相容性，不会影响与酶或抗体的相关反应。

在一些实施例中，病毒保存液可包含以下成分(在溶液总量中)：10-100mM NaOH、10-20mg/L的蛋白酶K、10-100mM Tris-HCl、1-10mM EDTA、体积分数0.01-1％的Triton-100、0.01-0.05％Proclin-300、0.001-0.005％的β-丙内酯和1-5％的明胶，保存液pH值7-9。在一些实施例中，病毒保存液可进一步包含1-10mg/ml的BSA。细胞膜主要组分为磷脂类物质，病毒外壳由蛋白或脂蛋白组成，在NaOH和蛋白酶K的双重作用下，提供的碱性环境中，酯键断裂，细胞裂解，蛋白变性；Triton-100作为温和的非离子型去污剂替代SDS等离子型变性剂，用于温和裂解细胞，解离蛋白，释放病毒核酸；Tris-HCl缓冲液维持了pH缓冲环境，维持释放出来的核酸保持稳定；EDTA螯合样本中的二价金属离子，作为RNA酶抑制剂保护病毒RNA核酸免遭降解；Proclin-300和β-丙内酯作为抑菌剂和灭活剂，能有效灭活病原活性，防止病原扩散；BSA是酶的稳定剂，在后续核酸直扩检测中能减轻不利环境因素如加热、表面张力及化学因素引起的酶的分解变性，并能防止酶非特异性吸附到管壁而损失；明胶作为稳定剂可增加保存液稳定性，样本保存溶液可以直接作为模板进行PCR核酸检测，无需核酸提取操作，可以兼容大部分PCR扩增试剂。

在本发明个另一个优选地实施方式中，本发明提供了一种病毒样本采集保存和PCR检测方法，采用本发明提供的病毒保存液保存采集的病毒鼻咽拭子样本，不需要核酸提取步骤，取适量样本保存溶液直接作为模板进行PCR核酸检测。具体步骤为：

1)采集病毒拭子；

2)加入0.5-1mL病毒保存液，室温(18-26℃)放置5分钟使病毒灭活，核酸释放；

3)取出10-25μL(模板加入量不超过PCR总体系的50％)作为模板，加入(RT-)PCR体系(20-50μL)中进行病毒核酸检测。

综上所述，本发明提供了一种免提取的病毒灭活保存液，能够有效灭活病毒，实现样本常温保存运输，并且不需提取步骤即可直接加入PCR扩增试剂体系中进行病原基因核酸扩增检测。

本发明的主要优点在于：

(1)室温保存运输：本发明提供的病毒保存液成分简单，成本较低，能够在室温条件下有效释放和保存病毒核酸，并在样本常温运输和保存过程中有效防止核酸降解，在15～37℃下保持病毒样本至少7天，降低了因运输或保存不当导致核酸降解的可能性，解决了传统病毒保存液保存样本的时间较短，而且要求低温保存的问题。

(2)灭活病毒：本发明提供的病毒保存液是一种灭活型病毒保存液，可以使病毒迅速灭活不再具有活性，对于操作人员和环境都非常安全，并且无需高温灭活处理步骤，可以避免高温灭活过程导致的病毒RNA/DNA核酸降解，降低漏检率。

(3)免核酸提取：本发明提供的病毒保存液采用简单的配方组分，能够与市场上常见的PCR扩增试剂兼容，不需核酸提取步骤，即可直接加入(RT-)PCR扩增试剂体系中进行基因扩增检测，大大简化病毒检测操作流程和时间。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1.病毒样本保存液配方

本发明免提取病毒样本保存液的配方主要包括以下组分：NaOH、蛋白酶K、Tris-HCl、Triton-100、EDTA、明胶、Proclin-300和β-丙内酯。其中Tris HCl的终浓度为10–200mM，优选50-100mM；Triton-100终浓度为0.01-1％(v/v)，优选0.01-0.5％；EDTA的终浓度为0.5-5mM，优选0.5-1mM；明胶的终浓度为1-5％，优选2-4％；NaOH的终浓度为10-200mM，优选50-100mM；蛋白酶K的终浓度为10-30mg/L，优选10-20mg/L；Proclin-300终浓度为0.01-0.5％，优选0.01-0.05％；β-丙内酯的终浓度为0.001-0.05％，优选0.001-0.005％；病毒保存液pH值7-9，优选pH值为7-8。

表1.病毒保存液配方

实例2.灭活直扩型保存液对鸡传染性支气管炎病毒的灭活效力研究

实验组保存液：实施例1中的1、2、3、4号病毒保存液

对照组保存液：专利CN111334503A发明的灭活型病毒保存液(包括5mg/ml核酸酶抑制剂EDTA、40mg/ml蛋白变性剂SDS、50mg/ml稳定剂甘氨酸、100mg/ml抑菌剂山梨酸钾、80mM Tricine盐缓冲液。)

实验材料：10日龄SPF鸡胚(购自扬州)，实验用毒种IBV种毒(保存于-80℃冰箱)。

实验方法：实验设置如表2所示，将等份的制备好的鸡传染性支气管炎病毒IBV株种毒分别添加至实验组和对照组病毒保存液中，按1(病毒原液)：10(病毒保存液)比例混合，置室温18-26℃反应5min使病毒灭活，然后用灭活后的病毒液按尿囊腔接种方式接种10日龄SPF鸡胚，每个病毒保存液样品接种3枚鸡胚，0.1mL/枚，接种后置于37℃培养箱中培养，每日观察记录鸡胚死亡情况，并于接种培养168h后剖检观察鸡胚病变情况，并收获鸡胚尿囊液进行病毒核酸PCR检测，以判断是否感染。对收获的鸡胚尿囊液进行鸡传染性支气管炎病毒核酸检测，检测方法参照GB/T23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术，使用病毒RNA提取试剂盒(康为世纪，货号CW3023)提取RNA，并使用一步法RT-qPCR(康为世纪，货号2207)进行病毒核酸检测。

表2.病毒灭活和接种鸡胚实验设置

实验结果：鸡胚接种病毒后，培养过程中观察记录鸡胚发育情况，结果见表3和图1所示，不接种任何病毒的3枚健康鸡胚均正常发育，培养168h后无病变死亡发生；实验组1、2、3、4号保存液和对照组保存液灭活病毒后再接种鸡胚，每日照胚统计鸡胚死亡情况，观察期内组1、2、4、5均显示鸡胚生长正常，仅组3中有1枚鸡胚在接种培养120h后发生死亡，组3内其余2枚鸡胚发育无异常，168h后剖检观察发现，组3中死亡的1例并无明显病变，IBV病毒核酸检测也呈阴性，因此此例死亡鸡胚非IBV病毒感染导致；组6病毒对照组(生理盐水混合病毒)接种后，其中1例于培养96h小时后死亡，培养168h后解剖观察发现，3枚鸡胚均发生病变，并且IBV病毒核酸检测均呈阳性。说明实验组1、2、3、4号保存液和对照组保存液都能够有效灭活病毒。

表3灭活保存液灭活效力统计

图1.接种灭活病毒保存液后鸡胚发育情况统计。

实例3.病毒保存液对RNA病毒保存能力的研究

本实施例中，以禽IBV病毒(冠状病毒，RNA病毒，对人不具有感染性)作为模型，检测本发明提供的灭活直扩型病毒保存液在不同保存温度条件下对RNA病毒样本核酸的保存效果。

实验材料：实施例1中的1、2、3、4号病毒保存液，实验用毒种IBV种毒(保存于-80℃冰箱)。

实验方法：将20μl IBV病毒原液分别加入1、2、3、4号病毒保存液中，颠倒混匀，每份样本等分成三份，分别置于37℃，4℃，-80℃保存，于第7天取出，每个样本取10μl作为模板(模板加入量不超过RT-PCR总体系的50％)直接进行RT-qPCR检测。

使用康为世纪qPCR检测试剂(CW2207)对提取得到的核酸样本进行一步法反转录荧光定量PCR(RT-PCR)检测，具体操作参考说明书。PCR检测用引物序列信息为IBV-F：GCTTTTGAGCCTAGCGTT，IBV-R：GCCATGTTGTCACTGTCTATTG，探针序列信息为IBV-P：CACCACCAGAACCTGTCACCTC。反应体系采用15μl PCR反应液(包括反应缓冲液12.5μl、扩增前/后引物(10μM)各0.5μl、探针(10μM)0.5μl、酶1μl)+10μl样本模板。在ABI7500(美国Thermofisher公司)型荧光定量PCR仪上进行IBV核酸检测，反应条件如下：50℃15min→94℃10min→94℃15s,60℃30s(40个循环)，FAM通道。所有检测均进行3次重复，取平均Ct值进行计算。

实验结果：结果如表4所示，与0天对照组的Ct相比，1、2、3号保存液保存的样本在-80℃，4℃和37℃保存7天后检测的Ct差值基本都在1以内，大部分差异不显著(p＞0.05)，说明三种保存液在不同温度条件下均能有效保护病毒RNA核酸，可以在保存7天后也能保证核酸有效检出。4号保存液保存的样本在-80℃，4℃保存7天后，直接进行RT-qPCR检测，扩增曲线异常，无法判断样品是否存在IBV靶标；37℃保存7天后，直接进行RT-qPCR检测，无法检测出IBV靶标。

表4.RT-qPCR检测病毒保存液对禽IBV病毒核酸(RNA病毒)的保存效果

将4号保存液保存的样本在-80℃，4℃和37℃保存7天后，采用RNA提取试剂盒进行病毒RNA核酸提取(康为世纪，货号CW3023)，具体提取操作详见说明书，最后采用50μl无核酸酶水洗脱病毒核酸，取10μl作为后续RT-PCR扩增检测的模板。然后参照上述步骤进行一步法反转录荧光定量PCR(RT-PCR)检测。

检测结果如表5所示，4号保存液保存的样本在-80℃，4℃，37℃保存7天后进行核酸提取，然后进行病毒核酸检测，Ct值(均值±标准差)均显著高于保存0天的Ct值(p＜0.05)。

结合表4数据分析可知，对4号保存液保存的样本直接进行RT-qPCR检测，样本会明显干扰后续的PCR扩增，而且在保存过程中核酸靶标存在明显的破坏。

表5.4号保存液样本提取后PCR病毒检测

实例4.病毒保存液进行病毒核酸PCR直接扩增效果的研究

本实施例中，以禽IBV病毒(冠状病毒，RNA病毒，对人不具有感染性)作为模型，检测本发明提供的病毒保存液对RNA病毒样本核酸的PCR直接扩增效果。

实验组：采用上述实施例1中的1号病毒保存液保存IBV病毒；

对照组：采用专利CN111925941A公布的一种免核酸提取的病毒保存液优选配方(包含50mM Tris-HCl、0.5％Triton-100、4mM DTT、10mM TCEP·HCl、4μg/μl BSA、1％DMSO和2％甘油)保存IBV病毒。

分别使用实验组和对照组的病毒保存液稀释禽IBV病毒原液(20μl)成10^-3,10^-4,10^-5,10^-6稀释梯度，将稀释好的病毒保存样本样品置于室温(18-26℃)反应5分钟，每份样品等分成2份，一份(200μl)暂时置于4℃备用，后续直接扩增实验时，直接取10μl作为模板进行RT-qPCR检测；另一份(200μl)采用RNA提取试剂盒进行病毒RNA核酸提取(康为世纪，货号CW3023)，具体提取操作详见说明书，最后采用50μl RNase-Free Water洗脱病毒核酸，取10μl作为后续RT-PCR扩增检测的模板。

使用康为世纪qPCR检测试剂(CW2207)对保存液直扩样本和提取得到的核酸样本进行一步法反转录荧光定量PCR(RT-PCR)检测，具体操作参考说明书。PCR检测用引物序列信息为IBV-F：GCTTTTGAGCCTAGCGTT，IBV-R：GCCATGTTGTCACTGTCTATTG，探针序列信息为IBV-P：CACCACCAGAACCTGTCACCTC。反应体系采用15μl PCR反应液(包括反应缓冲液12.5μl、扩增前/后引物(10μM)各0.5μl、探针(10μM)0.5μl、酶1μl)+10μl样本模板。在ABI7500(美国Thermofisher公司)型荧光定量PCR仪上进行IBV核酸检测，反应条件如下：50℃15min→94℃10min→94℃15s,60℃30s(40个循环)，FAM通道。所有检测均进行3次重复，取平均CT值进行计算。

结果如表6和图2所示，实验组和对照组的病毒保存液均能直接作为模板进行直接扩增检测，并且两组扩增Ct值相当，没有显著差异。此外，与提取扩增组相比，直接扩增组的Ct值普遍小1-2个Ct值，说明直接扩增组检测灵敏度更好。我们推测，核酸提取过程中会造成核酸样本的部分损失，因此病毒核酸提取效率也会影响病毒检测的灵敏度。

表6.RT-qPCR检测病毒保存液的直扩效果

图2.病毒保存液的直扩效果检测。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。