Cybb基因外显子表达变异在辅助鉴定慢性肉芽肿病中的应用
阅读说明:本技术 Cybb基因外显子表达变异在辅助鉴定慢性肉芽肿病中的应用 (Application of CYBB gene exon expression variation in auxiliary identification of chronic granulomatosis ) 是由 杨军 夏宇 罗书立 史丽娜 于 2019-10-28 设计创作,主要内容包括:本发明公开了CYBB基因外显子表达变异在辅助鉴定慢性肉芽肿病中的应用。本发明提供了检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平的物质在制备辅助检测待测人是否患有慢性肉芽肿病产品中的应用。本发明首次发现CYBB基因的第11外显子的缺失或表达水平与慢性肉芽肿病相关,同时本发明首次设计了用于检测CYBB基因的第11外显子的缺失或表达水平的引物对,并采用实时荧光定量PCR进行扩增,鉴定该基因的第11外显子是否缺失或表达水平是否变化,从而辅助判断待测人是否患有慢性肉芽肿病。(The invention discloses application of CYBB gene exon expression variation in auxiliary identification of chronic granulomatosis. The invention provides application of a substance for detecting whether a CYBB gene No. 11 exon in a genome of a human to be detected is deleted or mutated or has an expression level in preparation of a product for assisting in detecting whether the human to be detected has chronic granulomatosis. The invention discovers that the deletion or expression level of the 11 th exon of the CYBB gene is related to the chronic granulomatosis for the first time, simultaneously designs a primer pair for detecting the deletion or expression level of the 11 th exon of the CYBB gene for the first time, adopts real-time fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction) for amplification, and identifies whether the 11 th exon of the gene is deleted or the expression level is changed, thereby assisting in judging whether a human to be detected has the chronic granulomatosis.)
技术领域
本发明涉及分子生物医学领域,具体涉及CYBB基因外显子表达变异在辅助鉴定慢性肉芽肿病中的应用。
背景技术
慢性肉芽肿(chronic granulomatous disease)是致死性遗传性白细胞功能缺陷病。临床主要特征为患儿对各种过氧化氢酶阳性菌属,如葡萄球菌、沙雷菌、曲酶属等高度敏感,反复发生慢性细菌感染,感染局部形成慢性肉芽肿,以皮肤、肺及淋巴结广泛肉芽肿性损害为特点。发病多在2岁以内,少数可晚至10岁以后。约75%的病例为X-连锁隐性遗传,其余为常染色体隐性遗传,男女发病比例为9︰1。主要通过四唑氮蓝实验,筛查白细胞功能,再结合相应的X线检查进行确诊。诊断可能要延迟至青春期或成年后才能确诊,且难与G6-PD缺乏症、白细胞谷胱甘肽过氧化酶缺乏症、家族脂色素组织细胞增生症等疾病相鉴别。因此,能及早的应用分子检测手段检查发病原因,及时的进行治疗干预,尽可能的减少患者痛苦是当前科研人员迫不及待的心愿。
目前主要基因检测方法为二代测序,主要包含基因包高通量测序、基因数据分析和疑似致病突变验证三个环节。测序效率高,但是价格昂贵且耗时长(平均1个月出结果)。另外此方法适用于点突变及50bp以内的缺失插入突变(微小突变)以及2个以上外显子水平的缺失检测,不适用单个外显子的缺失、动态突变及复杂重组等特殊类型突变的检测,依据人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database)记录CYBB基因目前的突变种类达到790多种,其中大片段缺失占比达到15.57%。因此,较为准确的鉴定基因拷贝数变化的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明一个目的是提供了检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平的物质的用途。
本发明提供了检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平的物质在制备辅助检测待测人是否患有慢性肉芽肿病产品中的应用。
上述应用中,所述CYBB基因第11号外显子为X染色体第37665640-37665786位(即序列1第26310-26456位)。
上述应用中,所述物质为如下1)或2):
1)所示的物质包括对待测人基因组中CYBB基因进行高通量二代测序测序相关试剂或仪器;
2)所示的物质包括扩增待测人基因组中CYBB基因第11号外显子的引物或含有所述引物的PCR试剂或试剂盒。
上述应用中,所述扩增待测人基因组中CYBB基因第11号外显子的引物由如下a和b组成:
a、序列4所示的单链DNA分子或其衍生物;
b、序列5所示的单链DNA分子或其衍生物。
上述2)所示的物质还包括扩增内参基因CSF2RA的引物;
上述扩增内参基因CSF2RA的引物由如下c和d组成:
c、序列8所示的单链DNA分子或其衍生物;
d、序列9所示的单链DNA分子或其衍生物。
上述各单链DNA分子的衍生物为经过1个或几个碱基缺失、突变或取代得到的单链DNA分子。
上述应用为:检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平,若与不患有慢性肉芽肿病的人相比,待测人的CYBB基因第11号外显子缺失或突变或表达量降低,则待测人候选候选患有慢性肉芽肿病,若与不患有慢性肉芽肿病的人相比,待测人的CYBB基因第11号外显子不缺失或无突变或表达量不降低,则待测人候选不患有慢性肉芽肿病;
在本发明的实施例中,经过测序,待测人CYBB基因第11号外显子全部缺失。
上述检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平是通过如下方法实现的:
方法A:直接对待测人基因组中的CYBB基因进行高通量二代测序;
方法B:以待测人的基因组为模板,用序列4所示的引物和序列序列5所示的引物组成的引物对进行Q-PCR扩增,以不患有慢性肉芽肿病的人为对照,若待测人的扩增产物表达量低于不患有慢性肉芽肿病的人,则待测人CYBB基因11号外显子有缺失或表达量低;若待测人的扩增产物表达量不低于(等于或高于)不患有慢性肉芽肿病的人,则待测人CYBB基因11号外显子不缺失或表达量不低。
上述Q-PCR扩增使用罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR检测仪检测,
其扩增体系中,各个引物的终浓度为200nM;扩增程序如实施例中的表3所示。
本发明另一个目的是提供一种辅助检测待测人是否患有慢性肉芽肿病产品。
本发明提供的产品为上述检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平的物质。
本发明还有一个目的是提供一种辅助检测待测人是否患有慢性肉芽肿病的试剂盒。
本发明提供的试剂盒,包括扩增待测人基因组中CYBB基因第11号外显子的引物或含有所述引物的PCR试剂。
上述试剂盒中,所述扩增待测人基因组中CYBB基因第11号外显子的引物由如下a和b组成:
a、序列4所示的单链DNA分子或其衍生物;
b、序列5所示的单链DNA分子或其衍生物。
上述各单链DNA分子的衍生物为经过1个或几个碱基缺失、突变或取代得到的单链DNA分子。
上述试剂盒还包括扩增内参基因CSF2RA的引物;所述扩增内参基因CSF2RA的引物有如下c和d组成:
c、序列8所示的单链DNA分子或其衍生物;
d、序列9所示的单链DNA分子或其衍生物。
上述试剂盒还可以包括扩增CYBB基因的第10外显子的引物对和扩增CYBB基因的第12外显子的引物对。
上述扩增CYBB基因的第10外显子的引物对由序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明首次发现CYBB基因的第11外显子的缺失或表达水平与慢性肉芽肿病相关,同时本发明首次设计了用于检测CYBB基因的第11外显子的缺失或表达水平的引物对,并采用实时荧光定量PCR进行扩增,鉴定该基因的第11外显子是否缺失或表达水平是否变化,从而辅助判断待测人是否患有慢性肉芽肿病。
本发明采用的引物及实时荧光定量PCR方法的有益之处在于:
(1)本发明采用实时荧光定量PCR检测技术,设计了全新的CYBB基因及内参引物用于表达量变化的检测。
(2)本发明进行高通量检测,在同一个PCR板进行检测,采用了8x12的96孔板反应体系,能够准确、快速、高效的进行多个患者样品的表达量检测。
(3)本发明极大的降低了CYBB基因表达量检测的成本,提高了基因表达量检测的准确性。
(4)本发明的原理可以应用到现有的任何荧光实时定量PCR仪器,方便使用,易于大范围内推广。
(5)本发明所述检测方法可以简单快速的检测CYBB基因的表达量,最低检测限为1ng/μL,用时短,从标本送检到得出结果可在3小时以内完成。
总之,使用本发明的引物及实验流程,可在同一个反应条件下同时检测3个与CYBB基因表达量相关的变异,特异性强,用时短,从标本送检到得出结果可在3小时以内完成。40分钟完成40个PCR循环(384孔板),可应用于相对和绝对定量,结合最新的基于高分辨率熔解曲线的基因扫描,实现准确、快速和经济的检测CYBB基因的拷贝数变异。
本发明采用实时荧光PCR法检测CYBB基因的表达量数变化,实时荧光PCR法灵敏度高,分型准确,操作简便快捷,所用仪器容易普及,易于推广使用,同时也能够对大样本量进行快速检测。
附图说明
图1为患者家系图;
图2为患者二代测序图;
图3为患者家系CYBB基因10、11和12号外显子RT-Qpcr表达量。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、致病突变的获得
1、样品收集
申请人从深圳市儿童医院免疫科收集到慢性肉芽肿家系3人样品(图1,慢性肉芽肿患者、患者父亲和患者母亲)和正常人(非慢性肉芽肿患者或家系的健康男性)的样品,样品具体为待测人员的静脉外周血,所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。
患者信息:男性,反复感染、左腋下包块1年余炎症等症状,住院期间监测血常规白细胞波动于17.11-35.43×10^9/L,CRP波动于43.48-109.05mg/L,体液免疫功能检查,淋巴细胞免疫分析六项等检测结果综合分析后初步怀疑是免疫功能异常,患有慢性肉芽肿,进一步进行基因检测以便确诊。
2、目标区域捕获与高通量测序
1)DNA提取、建库、测序
主要流程是利用捕获芯片将目标区域的DNA片段进行富集后再借助高通量二代测序平台进行测序。本研究采用目标序列捕获芯片(MyGenostics,全外显子探针为P039-Exome,北京迈基诺基因科技股份有限公司)对全基因组范围内约24000个基因的外显子及其上下游50bp区域进行捕获。捕获的具体过程如下:将患者基因组DNA随机打断成片段,与Illumina PE接头寡核苷酸混合物链接,对产物进行链接介导的聚合酶链式反应(ligation-mediated Polymerase chain reaction,LM-PCR)扩增纯化后得到DNA文库,并对其进行质量检测,将上述PCR产物与目标区域捕获芯片进行杂交以富集目标区域序列,借助Illumina Next 500测序平台对捕获的序列进行测序,并对原始数据进行初步处理,包括图像识别和样本区分。
2)生物信息分析
将原始测序数据去除污染和接头序列,然后利用BWA软件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)将过滤后的序列比对到NCBI数据库人类基因组参考序列(hg19)上,利用GATK软件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)分析得出单核苷酸变异(single nucleotide variation,SNV)和插入缺失突变(inserts and deletions,INDEL)的相关信息。然后通过ANNOVAR软件(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)对所有的SNP和INDEL进行注释。筛选掉正常人数据库中频率小于0.05的突变位点,正常人数据库包括千人基因组计划(http://www.1000genomes.or/)、Exome VariantServer(http://evs.gs.washington.edu/EVS)和EXAC(http://exac.broadinstitute.org/)。错义突变使用SIFT(http://sift.jcvi.org/),PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/),MutationTaster(http://www.mutationtaster.org/)和GERP++(http://mendel.stanford.edu/SidowLab/downloads/gerp/index.html)软件进行致病性预测和保守性预测,剪切位点的改变用SPIDEX(http://www.deepgenomics.com/spidex)软件预测有害性,最终的遗传变异的致病性评估主要依据美国医学遗传学及基因组学学会(ACMG)于2015年发布的《序列变异解读标准和指南》。
3)检测结果
通过检索数据库以及文献结合IUIS颁布PID分类标准里的各致病基因表型和临床症状对比,发明人发现,与正常人相比,慢性肉芽肿患者CYBB基因的11号外显子疑似纯合缺失,结果如图2所示,该突变突变造成CYBB编码蛋白截短,而蛋白截短会影响细胞色素B功能,最终使巨噬细胞NADPH氧化酶不能正常工作,患者表现出反复性全身化脓性感染。这个基因都位于X染色体上,属于X连锁隐性遗传。
实施例2、CYBB基因11号外显子缺失的确定及其用于鉴定慢性肉芽肿中的应用
1、Q-PCR引物的设计
依据Human GRCh37/hg19人类基因组版本,CYBB基因对应NM_000397转录本序列(其核苷酸序列为序列1),设计CSF2RA内参基因和CYBB基因10号外显子(chrX:37664259-37664421)、11号外显子(chrX:37665640-37665786,序列1第26310-26456位)、12号外显子(chrX:37668820-37668944)两端序列分别设计扩增引物,设计原则是位点数在5个以内、片段长度80-200bp、序列的GC含量应在35%-65%,结构预测无特别复杂结构;对应序列引物如下表1:
表1
编号
名称
序列
序列2
10号外显子F
CCTTCAGGATAGCGGTTGAT(序列2)
序列3
10号外显子R
TAAGGCCCTCCGATAAATGA(序列3)
序列4
11号外显子F
ATGCAGGAAAGGAACAAT(序列4)
序列5
11号外显子R
CCTTACCTGAGACTCATC(序列5)
序列6
12号外显子F
AAGACTTTGTATGGACGG(序列6)
序列7
12号外显子R
GGTGACAGACTCCTTACT(序列7)
序列8
内参F
TGGTGATGTTAGTGGGAGCA(序列8)
序列9
内参R
GCCCTGTTCAAAGTGTGGTT(序列9)
2、Q-PCR扩增
Realtime PCR具体上机操作,参考Roche 480说明书,分别取实施例1中1的慢性肉芽肿患者及父母基因组DNA作为模板,用表1所示的引物分别进行Q-PCR扩增。实验重复3次,平行组的Cp结果取平均值Avergage Cp。然后用需要检测基因的减去内参基因的得到△Ct值,再用实验组的△Ct减去对照组的△Ct得到△△Ct,利用excel公式”=POWER(2,-△△Ct)”得到最终结果(此处的△△Ct换为实际数值)。
利用对照人群的CYBB基因某个外显子表达量计算检测对象的CYBB该外显子的相对表达量。
α=检测对象△△Ct÷对照样品△△Ct
上述Q-PCR扩增体系如下表2所示:
表2
上述Q-PCR扩增的程序如下表3:
表3
结果如图3所示,以正常对照(男性)中CYBB基因各个外显子的表达量为1,其他样本中CYBB基因各个外显子的相对表达量是相对于正常对照(男性)中CYBB基因各个外显子的表达量;横坐标从左到右分为3组,第1组为正常样本、患者10号外显子、患者11号外显子和患者12号外显子,第2组为正常样本、患者之父10号外显子、患者之父11号外显子和患者之父12号外显子,第3组为正常样本、患者之母10号外显子、患者之母11号外显子和患者之母12号外显子;可以看出,先证者(男性,即患者)CYBB基因第11号外显子相对表达量为0,10号外显子和12号外显子相对表达量为1;患者之父为CYBB基因第10号外显子、第11号外显子、第12号外显子的相对表达量均为1;患者之母为女性,含有2个x染色体,各个外显子相对表达量为父亲的2倍。
因此,可以通过检测待测人CYBB基因11号外显子是否缺失或表达水平,辅助判断该人是否患有慢性肉芽肿病,具体如下:
检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平,若与不患有慢性肉芽肿病的人相比,待测人的CYBB基因第11号外显子缺失或突变或表达量降低,则待测人候选候选患有慢性肉芽肿病,若与不患有慢性肉芽肿病的人相比,待测人的CYBB基因第11号外显子不缺失或无突变或表达量不降低,则待测人候选不患有慢性肉芽肿病。
在本发明的实施例中,经过测序,待测人CYBB基因第11号外显子全部缺失。
上述检测待测人基因组中CYBB基因第11号外显子是否缺失或突变或表达水平是通过如下方法实现的:
方法A:直接对待测人基因组中的CYBB基因进行高通量二代测序;
方法B:以待测人的基因组为模板,用序列3所示的引物和序列序列4所示的引物组成的引物对进行Q-PCR扩增,以不患有慢性肉芽肿病的人为对照,若待测人的扩增产物表达量低于不患有慢性肉芽肿病的人,则待测人CYBB基因11号外显子有缺失或表达量低;若待测人的扩增产物表达量不低于不患有慢性肉芽肿病的人,则待测人CYBB基因11号外显子不缺失或表达量不低。
SEQUENCE LISTING
<110>深圳市儿童医院
<120> CYBB基因外显子表达变异在辅助鉴定慢性肉芽肿病中的应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30840
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
atggggaact gggctgtgaa tgaggggctc tccatttttg tcattgtaag taccaacaag 60
agataagtta taaattctct gacttctcgg ggttatcttg gaactaaaat agaccaaagc 120
ttttttgttc atttgaggaa ttgtgttgaa actgatttac catgtgaacc tatatctatc 180
tgtaaacaga ctgagtccat tcttccaaat tccttaatgg aaagaacata tctgggggct 240
cacttctagc ttacttctga attcctagga ggaataaatt agccagcatt tcgcagaagg 300
agtagaaaat atttcatgct aatgatctct gattctgagt tgtttagtaa tgtttactca 360
gacgcacatg tctatgtgtt tatactactt taaaaatgac aaattgaaat tttataccat 420
tttctaaata aaaaatataa gattgactca tgtatgggaa gtaggccttt atttcagtaa 480
ttacactaaa tataataaaa cttctcaaat ttattttcaa aaacaagtac cttctttttt 540
cagagatcta aacttgagtt atttataaga tttataaaaa ttcaaaagaa cagaattgaa 600
ataagtcatc tagattcata aatatgtagt atgtatattt atatataatt gtatatatat 660
ataaatcaat atagtctgga gaaactatgt aagtaaagat atagctaatt tacaagtgga 720
cagaatgatt tctgtacttt ttaaaacaaa gaaaatcaac tgttctctta aaatggtgtt 780
atcagcaaag caataatgga caaattgggt agatagaaat acgattttta aatagccttt 840
ctaaataacc aatagaagca ttacacagat gttaaaaagt acaattatga atggaatatg 900
aatggagctt ttgtaaaaat ttatcatgaa aaataatgag tctttgagtt ttaaatatag 960
aaagcaatta gtggcacaaa taaaaacaac aaatattttg ttataaaaaa tgtttacgcc 1020
aaaccaacat tctactgcaa cagagaattc ttccgagtat tcgaagctgt aaacttaact 1080
tcttatcacc atttttaagg gcaaataatt tctatagaaa gtaagttcaa attaaacttt 1140
tagctctcgc cacaattttt cccaggaaat gacctccttc taaattatat actcatgcac 1200
ttgaaagtga aaacacagct tggaaagtca gagtaaagaa agaatgacaa gatcaggaaa 1260
ttgggaagtt gctttagcac ttttttcttt gtaaagagag aatattatca agtgtctaga 1320
gcatataata gcttcaaagc atagttgaga aaagatcact atggagctga aggtagagaa 1380
ctgggtagtg tgaccacttg atccagtcag tgcttaggat aaaatgaact gtcatgatct 1440
agaaagctgt ttttgttgta aatcccaagc ccctcactat gctcaatatt ctctccttga 1500
agcattaagt aaaactaatc aaggaaaatg gaaggcttgg cattttagct gatgagaatt 1560
cactagctgg attactgtgt ggtagaggga ggtgattagc acctgtgaga acagaacgca 1620
gtgtcatact ggtggaggga aagcaatagt aatatgttcc cttcctttct cattttaagt 1680
ggagtggcct gctatcagct acctatccaa ggttaagcaa aagagagggg aaaaaaaggg 1740
agtggggtaa tgtaagactg ataatttggt atactggcca aatcataaaa caatcatggg 1800
gaacaacaca gggtggagag gttttaatta tagacaagtg tagtgacact gttgaggaaa 1860
gagctggctc taagctggtt atatccagct ttgtcactac ctttgtcaaa gttggacttg 1920
gggaagtcct gacccttatc tgactccagt cttgtgtgga atctactgtg gaaatgcgga 1980
aacttcatgc aattatttct gtttgtgcag ctggtttggc tggggttgaa cgtcttcctc 2040
tttgtctggt attaccgggt ttatgatatt ccacctaagt tcttttacac aagaaaactt 2100
cttggggtaa gtataaattc catcccatgc aatattggct ggttcacatt tctcatcaga 2160
cattcttgtt catcttcctg ttagcatttt aaatacatat tctgaccaac ccaaacagta 2220
ccattagcct cactccctcc attgcaactt cctgggcaac agtcacttaa agccttccag 2280
tctgggacca acaaaagtgg ggcagagggc cccagtggca tccttcccca accaagaacc 2340
atgtgccatt gtttagctta aaggagaaat ctaatactca ctctgaaatg gaagggcagg 2400
ttggagcaat ccatccagga gtgacacatg tgggacaagt gggactttcc atattttcta 2460
agtcacctaa ttcctagtac ttttttgcat gaagagctct gctcctaatc acatgttatg 2520
aaatgatctt cagaaaataa atctctctct acatataaag actcgaggaa cttgctcaag 2580
ggccacatct gttgactagg acagtagagt gaaggccctt cagtttcctt gggtccttta 2640
gtattctgag tttccttgaa ctgtcaggcc tcttgcctcc agaagacatc tgttacatca 2700
tgctgaaact atgaattaat tgcttaatat taattattat aagtattata aatcataaat 2760
aaataatttt agcatataat tatgctagat cattataatt gttgttagct tattcacatt 2820
gatgctttct cccgccaaaa tatgcaactt ctttagacat tacaaatata ataattataa 2880
tgccaaagca ttataccata ccaatttaag atactgttaa gatcaattta agtgctaaga 2940
aaatatttaa aatctttaaa agtcttgata cttaactcta gttaatgata tgcaccttaa 3000
gtgttaaaga gaaagtgaac tgttgtctgt aacttacttt gaaatgcatc aaaaattaga 3060
tgagttgatg gatggataca ggaatggata gatagaatgt gataaagcaa gcataaaagg 3120
tataatctgg gagatgaata aacaggtatt tattgtaaat ttccttcaac ttgtctttat 3180
gtttgaacat tttaataata aaatgttgaa ttagggcaaa aggtcaattt cagatgaaaa 3240
caaagggtcc tagctagccc taaaggaaaa ccgttggctc tgaaggacct tcctgtacag 3300
atcacttggt gtctctggtg tgtggcctca tgctaagaac cttggggaag tggggacagg 3360
gcatattctg tgctcaaaaa agtcactctg ctccctttcc cgcctcttct agtcagcact 3420
ggcactggcc agggcccctg cagcctgcct gaatttcaac tgcatgctga ttctcttgcc 3480
agtctgtcga aatctgctgt ccttcctcag gggttccagt gcggtaagag aaaatgtttt 3540
actaagttcc tctaattttc aaaggccatc aagcaaaatg ccctttttta ggtaaaaaca 3600
aatgaatgat ttgggaggat tccagcttct gtagaatact catgagccaa gccattatct 3660
agtatatttc tgtgctattt ggggatggag ctccctaaga caactatttg gaaaacaaat 3720
tttgaaaaaa cacacaaaac cacctatacc tcaacagtag caatgaagta gcacacacgt 3780
acacgtttac acacacacac atatatatat gatagatatg catatataca gagctttagg 3840
aagttgacat gtgatatctg ggagttaatc tttcagtgtc attcaaaaaa atttaagtca 3900
gaggaaatat cttctgtgga taatatctca aggagatgga gtcaatggac agagtcacac 3960
tataatgaat gtaaccaaga agtgttggct tcatggaact ggggagcata gagctttcta 4020
aatgtccaga attcctttga ctctcactcc aacaatttag taagccacta aatgtactgt 4080
gctagaaggg ggaaaaaata agtaggaaga atctctgtaa cccataaaat ggtatacaaa 4140
tttcttacta gtattattgt acaaagatga caaacaagga acttaaaatc tacaagtgta 4200
ctcaaataaa tattatacaa agcaaaatat gatgggttcc acaaagcttt acaaataaaa 4260
tactatgggg aagcaagaga gaagttgtgt caggtggggc agagaatgaa gaagggcatt 4320
ttagagaagg tgacattaga gatgagtata taaaaataag cttctaagag gtgtaaagga 4380
gagagaaagg cattctatgt ggagaagatg gcatggacag aagcacagga aatagtgagg 4440
aaatcgtatt cttgaaggcc aagaattggc atagccttgg cttctctttg tattattatt 4500
ataaatattt ttttgccacc tgtgaccaca ccaaagaggg tagctgggaa aaaagtaggg 4560
attggtgtcc tggtgggacc aattccgtgg ttcattaatg actagtagct tctaggtttt 4620
ttttaaaaaa taaaaggtat agtaagcttt ttgaaaaaaa tacttattaa gtagagatca 4680
cttatggagg acagcagaaa gcaaactact tttgtgggaa tgtagggatt gtacagggca 4740
gatgcctgac ataaggctgg agaaaagagg taggatttta ctggtaaact agaactgcat 4800
atgtatagtt gaggagttca tgcttaattt ggcaattaca gaatatttga aggaggcagt 4860
gaactaaact gtaataacaa gcataacttg ccttgaactc tgcctcattt ttcctagtta 4920
cactaaattc atgctgatcc agagaatttt tttctttaag aacatataac attcaattta 4980
ctaatatagg actagaggct ataatttagc ttttatttta tgacttaact atttacaaaa 5040
taccatttca tcttaaacca actgccaaaa ttgggctctc acaaatctaa agtacaagtt 5100
ggcagaaata actgttacac cttcgcttcc tcagaaaaag aagaatgttg ataaccaatt 5160
taagatgttc cagaaagagt cgtgatatct tcctctgaaa aattctgtga tgaggttcct 5220
ttccttaagc cataaattct atgctacgca atgttgtctt gcaaactgag agctaaccaa 5280
aaccaaaaac taacaacagt acttggtatt aaacattgat tacaaggatt tccaaaaaat 5340
cttccaaatt taagaaatca cagaggtaaa attacactca attgaaagtt ttattaatga 5400
gccacctatt gtaaagtata acgtttaata tatcgtaagt gcccagtgaa catttgctaa 5460
atgaagccca tgcactatag cttatttttg agttgggttc tctatcaccc aggctggagt 5520
gcagtggtac gatcatagct cactgcagcc tggaactcct gggctcaagt gatcatccct 5580
ccttgacttc catacatgtg gggattacag gcatgagtca cctgcctggc gagttccttg 5640
tttctaagga gacacaattc atttttattc tccctacccc cattagaata gtttctattt 5700
agaggaagta aagcctgaga aacaggcaat gttttcacca agatggcctg ttaagaaatc 5760
ttggttagtc tacaagtcca aatttcactg ccggtgagca ccatgtccca tgagcagcac 5820
atgttgtaat gccagctttt atgcctcctg tgacccagga gggaagatct gcatgagagt 5880
ctctaaagac agggatgaaa tgagactgcc cttcaaatcg cagagaagct tggctgtata 5940
actacataga tctttatata aaagaatatg ttttaaaact atcagcaagc aacattcttt 6000
tatagatcaa gcatgtactt tcttctggga ttcctaacct gaaatgtgaa cttttctaat 6060
aaaacttctt ctgtgattgt gattaaaatg agtgagtgtg ctgtaactaa tgttggaaat 6120
catatagctg ccactcattg aagcttaatg gaattcaccg catgaaatct gcacatcaaa 6180
ccagtaaagt gggaacaaaa ttaaatggaa gtgttggcat tcaaacccag gtcattgtgt 6240
ccccagagcc cattcacttt aaatcatgct gccaaaactt cttgaaattg tgctgttgca 6300
gtattatgat cctagaaagc cattatatat atgagtgttt gagcatgcca agtaacctag 6360
actagaaatg acaaggatgt tataaataca aggacttaat agtaggacac tatataagca 6420
aaataaccac gaacttgcat tcagtttcta gaggtctcaa tcattgaaac tttgctttgt 6480
aatccttctg gttacctaga gaaagaaagc cccagggttg cccaccccac cactccagga 6540
aaggtagggg taaaggctct cagactgctt tgttgagaaa aatggagaat gggtgaagct 6600
cagcacacaa aaatctctga ggaagcctta aaaaccccca acttgccatg cagaaactaa 6660
tttctgtctg gatggcagtc ctagtcttaa gatcagaaag aaacaggaag gtgagagggt 6720
gaggttttat ctgttacctt atatagtctg ggagtcagag gcactcagtg tgcctctatc 6780
tttaatcacg tggtctagca ctagtctctt gggctttctg tctcatagtt ttttttttta 6840
gttgaaaaac aggtcaacta acacaaatgt aagaaggcat atgttggtct aaaagtatat 6900
taattgttta agtctgtcaa ttagtgagtt gtcagtcaat aaatatttgt tgagtgccat 6960
ttatgtgcta agcactgggg acatgtggta agtaaagatt aagttataga taggccatga 7020
gcttaaggag cttagagtgt taacaggaga gacagagaat aaatatggaa cttccaaatt 7080
ataaacagtg ctatgcaaat aaggtagtgt tattcatatt tatcagatat tctactgcca 7140
gcaggtgtgg atattactgt caacttactt gcctgagttc tgtagattca aagttggatt 7200
ttgtaatttc tcccagttgc gtataaatat ctaaatcaga tacattgatg gtgcgtgtgg 7260
tgagatcaag tgtacaaaaa gtagagcttt tgagtttctg taaagtgtta caccccataa 7320
aatatgtact tctttttagt tccacttccc attttcttga aatatttttt tcttactcag 7380
tttcaataga gcatagaaat ctgctgaagt gactcaataa tctcccttgc attagaatgg 7440
tagtttattg aaatcgggca aggcttccgg tgacagtaac agagaaactt ccctttagaa 7500
gtcaatggca gaaagtaaag taagttagta aggaagctat ggggcatgat ggcaacgtgg 7560
ataattggga agtggctggc aataatttag aagtaactca aagcatataa atgcaatctg 7620
cctgatgatg gggaacaaaa aattatgggc agtcacagac agtaaagtcc ttccttccta 7680
tgccaccaac cggttgtctc gcctcctttt ttaaggaagt ggtgaggaga tggtattctt 7740
aaaagcccag tatcagcatg acttgtggct tctttttgga tttgtttgcc attcctgtcc 7800
acaccaaaga gggtaggtgg gaaaaattag ggatttgtgc cctgatggtt ggacccactc 7860
cactgatcca ttagttacta gtaatctcac tttttccttt caatataata tatgtgtttt 7920
acattaacta gctttttaaa aattacctat taagatgaaa cagagtatca ttgaatggac 7980
aatgtatttc ccaatcacat ctctccactg ttctggcttt cagttaattt ttctctaagg 8040
atctacagtt aaagctatca gggggcatca acatatatta ttttacattt tttatgatcc 8100
atggtgatta tgatgataag gataggacta tgaagacagt gtatgttcca caacaaaacc 8160
atattcgttt gctttaaatt cggcgtgcag gagccagtga attttcccca aaaaatttca 8220
aaaggatttg tcaacaaata gaaaagaaca gtgtgtggca agtatagaca tgggggtaaa 8280
ttcatctcta taggtttagt atgatcatct ccagttccag ggcatgaaaa tgtacttcat 8340
ttatgcagcc aaataatgat taaaagattt ttttaagtac atgacatact gtttttcaca 8400
caggaagctt acctgctagc tggggagtgc agccttacta actgaaaact taaataatga 8460
tactaaataa catcaaatat tgattaaata cctgtcaatg aatatatgca atagggattt 8520
gagggactaa ctatgataat tatacaggtg aggaaactgg agactgagta tgttgttcga 8580
tgtcacacgg ctaggtggga ggactgggac ccaacatagg tatatctgaa gacaaaactt 8640
gctctgaaat gtgtaattca gtactgcttt ccaaccctac taattctcat tctctgattc 8700
tttggactcc aacctagttt caccactcct gtaaggactg tatcaatcat ctatcgtgta 8760
acaaattacc acaataactt aaaacaaccc ctgtttatta gtttacagtt ctgtaggtca 8820
caagtccagc acccagttgc tgggttctct gctcagagta tcataagact gaaatcaagg 8880
tgttttctgg gctgaattcc cacctggaaa ctctaagtaa aaaccctctt ccaagctcat 8940
tcttgttggc agaattcagt tcattacaga tgtagcacta gaggtccctg tttccttgct 9000
ggtgatcatc tagggtccac tcaaatccta gatgttcctg cattccctgc cacatgccct 9060
cctccacctt ccaaccagca gcagtgcttc aaatctctga cttcctccat ctctgacttc 9120
taaacccaga tttaaagagt tcatgtgatt gggtttgttg gcccagataa tctccctatt 9180
aaagtcaact tgggacttta cctctgcaaa atcccttttg ccatataatg taacaaaatc 9240
acagagtgat gtctcatcat tttcacaggt ccaaactcaa ggggaggaga ttatataagt 9300
cattgggggt cattctagaa ttctgtctac cacaaggact ctcagaaact atagaggaaa 9360
ttaagttgaa atttaagaag ccaaagaaag aaagaaggaa agaaagaaag aaagaaagag 9420
aaagaaagaa aggaagaaag aaagaaagaa aataaataaa taaataaata aataaactat 9480
aaaggaacat ggcaattggg aaacaggaaa aagttatttc ctcaaaattt taaggaatac 9540
aaagtagaaa ataattttca gcacttgtaa tgaacacaaa agacaaggag gctatataag 9600
aaaacaaaga tggtcaactt ttcaacaaca gatcagtaaa atgtatttta caaataaatt 9660
tttatttcaa aaacattaag tttgaaaatt tgtattttac aagtttttat ttcaaatagg 9720
aaaccattgt tttgagagtc tgagtcattg ctcagctcca ctggtgaaca tttaattata 9780
accaatgcat tggtgctcca ccatattccc taagcactgg cacttccaat ccatgcgaca 9840
actgcccttt gcaagcatca ttcactctct gcctggggat tttctttcag ctttctcctg 9900
gggcaagcct gaaatcccag gggattgatg tcctgagagc atccctcaga gcagccctca 9960
gccaatcatg gatggcagtt ggtggttgaa cacccaagct tcttaacccg ttaggtaaaa 10020
accaaagaac gaaacaaaca aagtaaatga ataaaaaacc ctttgggata agttctacac 10080
agtctcccag agttccctgg tgtgatcgag cccaatgata tgatatgatc atggtagctg 10140
atataataat gcactcttca ttaatttcct tcccagtctc atttttaccc tcgttttcta 10200
tgaccacctt ccggatagaa tacttacact taaattcttg tcacaggttt ctaggcactt 10260
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agacaaatag acttggatcc cagccaatgt gcaattttag ctttagtttt cttacctgta 10380
aaatgaggac attaagattt accttgttgc attaaatgag taatgattat gggtaaacta 10440
cctagttcac agaaggaatt caataaagca taattttttt atttttcctt tttctggaat 10500
cctcagtgtc ttccttgcta ctatttctgt aatttcaaga acctgacctc atggtttaaa 10560
cttcctgccc tccctagtta tggctaactg agagatagat ggtggagtaa gcacaatttt 10620
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aattttcttt ggtacttcac tctcttgttc ttaaagttcc ctgaatctct gtgacagtgc 10800
atttagacta tggaacaaag caaccagagc aagacattgg ccagttttca ggagagccaa 10860
gctctaattc aaccataaat cagtttaaat cagttttttt ctttctttga gcattggcac 10920
gaattgagat tcaaactcac attttctaac atatgtaggt tcgtcaaata cactaaaata 10980
ctgagtacaa tagtattttt aatgccaaag gaaatcatgt aaagtatgaa atatcagaat 11040
gtttatataa actctagtat cagatggcct gagtttaaat cccagctctg caacttatta 11100
gctgtgtgac ctaaggctag gtaaactctc tatccctttg ttttctcatc tgttatgtag 11160
taataataat ggtacctccc ttgtaccatt attgtaagaa ttaaagagtt aatttgatta 11220
ttacattaaa gattaaatta aattaaatat tacatcaatt acattaaaga ttaatgtaag 11280
aattaaatta gtcaatgcat gtaaaacagt tgcagaagct cttggtaaat gttagctatt 11340
gttattttgg ctattagcat ttggtcaatg atctcccctg tgatgttgtt cacctacatg 11400
ggcaggtgta cccttctttc tcctctcata gtgtgtatgt cctagaacag tgttgtttga 11460
aaactattca cttgttctag aactgttcac ttgtctgtgt ccccacttga ctatgaggta 11520
tgtgatgtta atttctacat cctttgttta atgagtaaat taatcagaac tagaaactat 11580
gtagctagat atgttttttg tacaagttta tatttttata cagttaagca atggattcca 11640
gaggagactt tatgtcacca gtatgagaac agaaaacata ccagttaagc cagccatgtc 11700
acttactggc tgtttgacct gaggaagatg actgcatctc tctgaacctc agtttcctca 11760
tttatcaaat agatataatg atacagtttg cagggtggtc atgaaaatta aatgagataa 11820
tatgtatcaa atgtttgaca catagcaagc tttcctgtta acaattacta ttccattctt 11880
tcccccttaa tccaaagtgc tgctcaacaa gagttcgaag acaactggac aggaatctca 11940
cctttcataa aatggtggca tggatgattg cacttcactc tggtaagttt attaaagaaa 12000
acttggaacc agggagttcc ctctattcat agataccttt ttatatagga gatcaaccag 12060
ttttatagtt agattaagtg gtggttggat atgttgtatt tttttaatga gttttgctca 12120
aaagtattta ccacactttc tgccacttca atattaggat ttattccttt aggttttaaa 12180
gcatttttat ttcaggattt tcctataaaa atgaaaatat gccatcagaa aagtcaatcc 12240
tagtgtcctc accctttgct attctttcta gtgtcaaaaa tgttaattca ctcatgaaaa 12300
cttatttatt ctaaaaaaag ttcttggttg catgtgtgaa tttgtggact ttttgcagca 12360
aacctacagg agccatagcc cataaattga gaatccctca agacggtcat tatcagctaa 12420
ataccttcat tattattatt actattgtta ttgttattgc atgtatccat acaatggata 12480
tatatgtgtg tatatagata ttatatgtta ttattaaaat tattagggtg gtagtgtcag 12540
tgcaagaagg gctgtatttg ggacccttat ctaattccac taattcactc aacaaatcat 12600
tcatgtgcca gagaatatat aagcacagtg ataaagcaga cttgtactct gcccttaaaa 12660
agtctgttcc tagcctgagt aaaataggct tagattacag gcatttaact gagtttctct 12720
tctactagta gatctggcag gcttttttag cagtggcaaa taaatagttc aaaagaaata 12780
tatgataaaa tcttgttaga aactggcata gtgtacggat taagagcaca tatttgcgtg 12840
ccagaggtac tggatttgat tcttaactct gctgcttcct agcttgatga ccttgaacaa 12900
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acctacatca ttgagtcaat gtaaggatta agtcattgtg aagtacttat aacagtactt 13020
ggcatctagt aagccctatg taagtgttta ttaataaaga atgcaatttt taagacagag 13080
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ggaggtaatt tcagagtcag gttaatgggc cagcaattag gcattcacta catgagtgtt 13200
ttcttgtttg agcccaaata tattatggag agagataatg agagcatatc taaacacctt 13260
cagaaactaa ggctattgtg tagaatctta taacttgatt gagtctttag gagcatatag 13320
ctcaacatct tcatcttaca aattaggaaa ccaagaccag agagttaagt cattttccca 13380
caattacaca actagagagg atcttaccca ctagaattgc cttgtctcct tggttctgga 13440
gacccagttc ttgtctataa gtgtcctggg cctccctttg tctccctgtg gcttatcata 13500
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tttgtttctc ttctctgccc ttttcagcga ttcacaccat tgcacatcta tttaatgtgg 13620
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aattgggggt agttctcaga taaggtatct taattatttt ttctaggagg cagagggaac 14280
agaataggac taagtctata ataggcaaag aagcagtagt cattgtctag gctcagacat 14340
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tatgtggttg ttgccttcaa acattctaat ataatgaaag tagcagctaa cttctattaa 16620
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cttaaactac ttgctgactg tgacccctga taaactcttt gtaagcatgg agaaatcaat 17160
ggagaccaag aatctgatga ctctcttaaa gcactcaaat atctttaaat gggacttagt 17220
cataatcccg tgtttcaggt aatcctagag aagagaaata atttcttccc ctctccaatt 17280
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attgttgtta ttacagtttc attactgaca atctttaacc tgtgtctaag aaacatgtac 19080
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tgttctgtta ttaacatcct gatataaaac ttgggaaaat agtgttttta gaagtgctgt 19260
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